自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0927

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4007-4013.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0927

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自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死

陈翔¹，王伟卓²，薛建利²，夏立峰²，李涛³，邱岭⁴，宋焕瑾²

¹陕西中医药大学第一临床医学院，陕西省咸阳市 712046；²西安交通大学第二附属医院骨科，陕西省西安市 710004；³西安市红会医院骨科，陕西省西安市 710054；⁴西安市第一医院骨科，陕西省西安市 710002

修回日期:2018-06-21 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 宋焕瑾，博士，副主任医师，西安交通大学第二附属医院骨科，陕西省西安市 710004
作者简介:陈翔，男，1989年生，甘肃省静宁县人，汉族，硕士，医师，主要从事骨与关节疾病临床研究。
基金资助:
陕西省自然科学基础研究计划项目(2016JM8129)

Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of early femoral head necrosis

Chen Xiang¹, Wang Wei-zhuo², Xue Jian-li², Xia Li-feng², Li Tao³, Qiu Ling⁴, Song Huan-jin²

¹First Clinical Medical College of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi Province, China; ²Department of Orthopaedics, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China; ³Department of Orthopedics, Xi’an Honghui Hospital, Xi’an 710054, Shaanxi Province, China; ⁴Department of Orthopaedics, Xi’an First Hospital, Xi’an 710002, Shaanxi Province, China

Revised:2018-06-21 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Song Huan-jin, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopaedics, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Chen Xiang, Master, Physician, First Clinical Medical College of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi Province, China
Supported by:
the Natural Science Basic Research Project of Shaanxi Province, No. 2016JM8129

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管内皮生长因子：又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
骨形态发生蛋白2：是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。从分子水平上看，骨组织的形成过程就是生物大分子在细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的信息转导过程。骨形态发生蛋白是惟一能够单独诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子。在骨形成早期，骨形态发生蛋白2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞等逆转分化为骨系细胞。

摘要
背景：目前国内外研究表明骨髓间充质干细胞可作为理想的种子细胞用于改善早期股骨头坏死区微循环。
目的：观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死的疗效。
方法：①体外实验：利用Transwell系统行骨髓间充质干细胞和成骨细胞共培养为实验组，正常成骨细胞培养为空白组，无血清培养基培养成骨细胞为对照组，培养3 d后MTT检测成骨细胞活力，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡率，ELISA检测各组培养液中血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平；②体内实验：新西兰兔30只随机分为3组：空白组(正常股骨头)，对照组(髓芯减压术+生理盐水)，实验组(髓芯减压术+自体骨髓间充质干细胞)。移植7 d后获取股骨头标本，行苏木精-伊红染色、免疫组化染色。
结果与结论：①与对照组和空白组比较，实验组成骨细胞增殖活力增强，成骨细胞凋亡减少，培养液中血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平增高(P均< 0.05)；②对照组股骨头区骨小梁断裂，脂肪细胞坏死明显，出现大量空骨陷窝；实验组成骨细胞较对照组增多，毛细血管较对照组增多；实验组早期股骨头坏死区血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2表达较对照组明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，骨髓间充质干细胞移植后可促进股骨头坏死区血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2表达增加，达到改善早期股骨头坏死区微循环的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2504-630X(陈翔)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 髓芯减压术, 血管内皮生长因子, 形态发生蛋白2, 股骨头坏死, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) as ideal seed cells have been worldwide confirmed to improve the microcirculation in the necrotic area of the femoral head.
OBJECTIVE: To observe the efficacy of autologous BMSCs transplantation in the treatment of early necrosis of the femoral head.
METHODS: (1) In vitro experiment. Osteoblasts were co-cultured with BMSCs using Transwell system as experimental group, osteoblasts cultured normally as blank group, and osteoblasts cultured in serum-free medium as control group. MTT was used to detect cell viability at 3 days of culture, flow cytometry used to detect cell apoptosis, and ELISA used to detect levels of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 2 in the culture medium. (2) In vivo experiment. Thirty New Zealand white rabbits were randomized into three groups: blank group, control group (core decompression plus normal saline injection), and experimental group (core decompression plus autologous BMSCs injection). Femoral head samples from white rabbits were taken for hematoxylin-eosin and immunohistochemical staining at 7 days after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control and blank groups, the experimental group showed increased osteoblast proliferation, decreased osteoblast apoptosis, and enhanced levels of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 2 in the culture medium (all P < 0.05). (2) In the control group, broken trabecular bone in the femoral head, evident adipocyte necrosis and a large number of empty bone lacunae were detected. In the experimental group, the number of osteoblasts and capillaries was increased as compared with the control group. The expression levels of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 2 in the necrotic area of the femoral head were significantly increased in the experimental group compared with the control group (P < 0.05). To conclude, BMSCs transplantation can improve the microcirculation in the necrotic area of the femoral head by increasing the expression of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein 2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Vascular Endothelial Growth Factors, Bone Morphogenetic Proteins, Femur Head Necrosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈翔，王伟卓，薛建利，夏立峰，李涛，邱岭，宋焕瑾. 自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4007-4013.

Chen Xiang, Wang Wei-zhuo, Xue Jian-li, Xia Li-feng, Li Tao, Qiu Ling, Song Huan-jin. Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of early femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4007-4013.

图/表（结果） 1

2.1 成骨细胞活力、凋亡及血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平 空白组成骨细胞吸光度值为0.273 2± 0.030 8，对照组成骨细胞吸光度值为0.174 6±0.045 6，实验组成骨细胞吸光度值为0.263 6±0.052 6。对照组与实验组吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)，提示成骨细胞与BMSCs共培养时，可以促使成骨细胞活力增强(图1A)。

空白组成骨细胞总凋亡率为(5.6±2.1)%，对照组总凋亡率为(16.3±2.8)%，实验组总凋亡率为(8.8±3.6)%。各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示成骨细胞与BMSCs共培养时，可减少成骨细胞凋亡(图1B)。

空白组、对照组、实验组血管内皮生长因子水平分别为(266.4±10.2)，(322.1±10.3)，(391.7±18) ng/L；空白组、对照组、实验组骨形态发生蛋白2水平分别为(14.95± 2.26)，(11.80±3.17)，(17.58±2.01) μg/L。组间比较行方差分析：①血管内皮生长因子组间比较F=668.86，P=0.000，进一步行Dunnett T检验，每两组间比较P=0.000，提示每两组的血管内皮生长因子水平差异有显著性意义；②骨形态发生蛋白2组间比较F=473.847，P=0.000，进一步行Dunnett T检验，每两组间比较P=0.000，提示每两组的骨形态发生蛋白2水平差异有显著性意义(图1C，D)。

2.2 体内实验结果 造模4周后动物双后肢活动减少；治疗后观察手术动物一般情况良好，伤口无红肿、无渗液；治疗后3 d患肢无主动活动，1周后患肢开始自主活动，期间无动物死亡。

2.2.1 MRI检测造模效果 行兔股骨头冠状位(OA)及矢状位(OC)MRI检查，MRI结果T2加权抑脂序列可见：空白组兔股骨头区信号均一，未有异常信号表现(图2A，B)；实验组可见兔股骨头区呈现不均匀的低信号，关节腔内可见少量关节积液，实验组MRI检查符合早期股骨头缺血性坏死期表现，提示造模成功(图2C，D)。

2.2.2 苏木精-伊红染色结果 获取标本时，按原手术切口逐层切开，各组动物切口周围组织纤维化粘连，无流脓、无溢液，取兔股骨头区域制备切片行苏木精-伊红染色(图3)。空白组股骨头骨小梁排列规律，骨小梁饱满，细胞核较大位于中央，骨小梁中罕见空骨凹陷，骨髓细胞增殖活跃，骨小梁边缘可见成骨细胞依附。对照组股骨头骨小梁内成骨细胞坏死，有大量空骨陷窝，骨髓脂肪细胞增大，主要分布在髓芯减压孔道区；实验组股骨头骨小梁结构较紊乱，成骨细胞增多，新生血管较多，骨髓脂肪细胞增多，但较对照组脂肪细胞增大；骨小梁中仍有骨细胞，空骨陷窝较空白组宽大，细胞核周可见空晕，但空骨陷窝较对照组明显减少；骨小梁周围成骨细胞较空白组减少，较对照组增多。

每组每只动物标本随机选取3张切片，每张切片随机选取5个视野进行计数。空白组、对照组、实验组血管数分别为(8.4±1.3)条，(3.5±1.2)条，(6.2±1.5)条，空骨陷窝率分别为(13.9±7.5)%，(58.3±7.3)%，(37.4±6.6)%。各组血管数、空骨陷窝率比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2.3 免疫组化染色结果 血管内皮生长因子染色阳性细胞在镜下呈棕黄色，其主要分布于血管内皮细胞胞质和细胞膜内。空白组血管内皮生长因子阳性表达(图4A)。对照组血管减少，出现血栓，血管内皮生长因子呈阴性表达(图4B)；实验组新生血管增多，血管内皮生长因子呈弱阳性，提示骨髓间充质干细胞移植可使兔股骨头区血管内皮生长因子表达增加(图4C)。

空白组、对照组、实验组血管内皮生长因子免疫组化染色吸光度值分别为0.285 9±0.066 0，0.187 2±0.037 5，0.250 0±0.058 5，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

骨形态发生蛋白2阳性染色表达在成骨细胞胞质和细胞膜内，成骨细胞主要存在于骨小梁周围边缘。空白组可见骨小梁周围成骨细胞胞质骨形态发生蛋白2阳性表达(图5A)。对照组成骨细胞罕见，骨小梁周围成骨细胞胞质骨形态发生蛋白2阴性表达(图5B)。实验组骨小梁成骨细胞增多，细胞胞质骨形态发生蛋白2阳性表达(图5C)，提示骨髓间充质干细胞移植可使兔股骨头坏死区骨形态发生蛋白2表达增加。

空白组、对照组、实验组骨形态发生蛋白2免疫组化染色吸光度值分别为0.238 9±0.033 5，0.132 0±0.037 3，0.213 1±0.051 3，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验，体内及体外对比观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年9月在西安交通大学医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选取26-28周龄新西兰大白兔48只，由西安交通大学动物实验中心提供，体质量2.5-3.0 kg，雌雄各半，单笼常规饲养。

1.3.2 实验试剂及仪器 大肠杆菌内毒素(LPS)、MTT、二甲基亚砜、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)；DMEM、体积分数为10%胎牛血清(美国Hylone公司)；甲强龙(美国辉瑞)；Percoll(瑞典Pharmacia公司)；Transwell小室(孔径0.4 μm) (美国Corning公司)；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所)；血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2 ELISA试剂盒(福州蓝图生物技术有限公司)；免疫组化检测试剂盒、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2一抗(武汉博士德)；酶标仪(enspire multimode reader)(新加坡PerkinElmer)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter)；MRI(1.5T)(美国GE)；倒置显微镜(CK40)(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 原代细胞分离培养 参照文献[3]获取18只新西兰大白兔胫骨骨髓，利用密度梯度离心法获取原代BMSCs并行增殖培养，传至第3代。参照文献[4]获取新西兰兔髂骨组织，利用酶消化法分离培养出原代成骨细胞并行增殖培养，传至第3代。

1.4.2 利用Transwell系统行BMSCs和成骨细胞共培养 取同一只兔分离培养的BMSCs及成骨细胞进行体外共培养实验。将获取的原代细胞传代培养至第3代，显微镜下细胞计数，加入DMEM培养液将成骨细胞和BMSCs浓度均调整至5×10⁸ L^-1。将BMSCs接种于transwell小室，与成骨细胞行非接触式共培养。

1.4.3 BMSCs对成骨细胞活力的影响

MTT检测成骨细胞活力：实验分3组：空白组(正常成骨细胞)，对照组(无血清培养基培养成骨细胞)，实验组(BMSCs和成骨细胞共培养)。培养3 d后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，培养4 h后小心吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇床上振荡10 min，在490 nm波长处用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值。

流式细胞仪检测成骨细胞凋亡：实验分3组：空白组(正常成骨细胞)，对照组(无血清培养基培养成骨细胞)，实验组(BMSCs和成骨细胞共培养)。培养3 d后，弃去培养液，PBS冲洗2次，对照组和实验组加入无血清DMEM培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂温箱培养12 h，消化细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，1 500 r/min离心5 min后弃上清，加入500 μL的1×Binding Buffer；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，加入10 μL Propidiumlodide，摇匀；室温下避光反应10 min；上流式细胞仪测定细胞凋亡(激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm，PI红色荧光通过PI通道为FL2；使用未经凋亡诱导的正常细胞为对照进行荧光补偿调节)。

ELISA检测培养液内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平：实验分为3组：空白组(正常成骨细胞，每孔含成骨细胞6×10⁴)、对照组(无血清培养基培养成骨细胞，每孔含成骨细胞5×10⁴)、实验组(BMSCs和成骨细胞共培养，每孔含成骨细胞3×10⁴、BMSCs 2.5×10⁴)。细胞接种于24孔板，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂温箱培养3 d。取上清培养液，3 000 r/min离心10 min，ELISA法检测血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平。用0.25%胰酶消化下24孔板细胞及transwell小室内细胞，并分别计数，将transwell小室内细胞数计入其对应培养孔中。

1.4.4 体内实验动物建模^[5] ①BMSCs的原代分离、培养、冻存：新西兰兔30只，随机分为空白组(正常股骨头)、对照组(髓芯减压+生理盐水)以及实验组(髓芯减压+ BMSCs移植)，每组10只。取实验组新西兰兔抽取全骨髓分离、培养原代BMSCs并相应编号，空白组、对照组动物给予相应骨髓穿刺；②兔早期股骨头缺血性坏死模型的建立：对照组和实验组动物给予耳缘静脉注射10 μg/kg大肠杆菌内毒素，之后连续3 d臀肌注射20 mg/kg甲强龙，常规饲养；③兔早期股骨头缺血性坏死模型MRI检测：造模6周后，各组动物麻醉前1 d禁食水。10%水合氯醛(2.0 mL/kg)耳缘静脉麻醉，麻醉满意后，仰卧位将兔双下肢外展固定，行磁共振检查。

1.4.5 兔股骨头髄芯减压术及自体BMSCs移植术 术前2 d复苏BMSCs，调整细胞浓度达1×10⁹ L^-1，将1 mL PBS分装致EP管中，放入冰盒备用。

所有实验兔麻醉、备皮、消毒，行后外侧入路，无菌操作下逐层切开，暴露兔股骨颈。用2.0 mm克氏针自股骨头下穿刺，沿股骨颈向股骨头凹方向行针7-9 mm，摄片确定克氏针位置(摄片参数：曝光电压46 kV，曝光电流8 mAs，曝光时间20 ms)。实验组注入已制备好的含自体BMSCs(5×10⁶个)的PBS混悬液1 mL，用骨蜡封闭髄芯减压孔道；对照组于减压孔道注射1 mL生理盐水，封闭孔道。术后3 d给予4×10⁴ U/kg青霉素臀肌注射预防感染。

1.4.6 苏木精-伊红染色和免疫组化染色 移植7 d后，按原手术切口逐层切开，取兔股骨头区域制备切片行苏木精-伊红染色、免疫组化染色。

1.5 主要观察指标 ①MTT检测成骨细胞活力、凋亡；②ELISA检测血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平；③苏木精-伊红染色检测血管数量、空骨陷窝率；④免疫组化检测血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件行统计学分析，数据均用x(_)±s表示。单样本均数的比较、两独立样本均数的比较采用t 检验；多个样本均数比较采用方差分析，组间比较用Dunnett T检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

股骨头坏死是一种在骨科领域的常见疾病且发病率高^[6-8]，其主要原因是由于局部血液供应中断，生理结构异常和成骨细胞发生坏死，最终导致严重的髋关节功能活动障碍。股骨头坏死总是与一个或多个危险因素有关^[9-10]，如臀部外伤、过量饮酒、过度使用糖皮质激素、血红蛋白病、Gaucher病、妊娠、凝血病、减压病、器官移植、高压暴露、炎症和自身免疫性疾病及其他不明原因的特发性机制。然而，股骨头缺血性坏死的病理生理机制尚不确定。

虽然目前自体骨移植也被用于治疗股骨头坏死，然而这些治疗方案仍然比较复杂，花费较高，且不能被临床患者广泛的接受。Hernigou等^[11]最新的研究表明，在股骨头坏死早期的治疗中，自体骨髓细胞植入股骨头坏死区域有着显著的疗效。

BMSCs是指骨髓起源的多能性间充质干细胞，可以在体外单克隆增殖，也可以分化为骨细胞、软骨细胞或者脂肪细胞^[12-13]。在骨髓组织中，造血干细胞生长于间充质细胞微环境中^[14-15]，有学者描述了两种类型细胞的内环境：“骨内微环境”是由成骨细胞围绕骨小梁表面形成的；“血管微环境”是由内皮细胞和CD146⁺上皮外间质细胞在骨髓窦内表面组成的。BMSCs在此两种微环境中扮演重要角色，提供合适的微环境帮助造血干细胞避免分化和凋亡，从而维持稳定和自我更新^[16]。更重要的是，微环境控制着造血干细胞的增殖和分化^[17-19]。BMSCs可以通过其分化以及维持合适微环境控制造血干细胞的增殖、分化。虽然BMSCs可以分化为多种类型的细胞，但是其对组织修复的具体原因仍不清楚^[13^，^20]。因此BMSCs的生理作用不仅在于其可以分化为相应的成熟细胞，而且可以维持其适当的微环境^[21-22]。

血管内皮生长因子是1989年由Ferrara等^[23]在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化出来的，可以促进血管内皮生长，诱导血管生成。激素通过糖皮质激素受体对血管内皮生长因子表达有抑制作用。股骨头缺血性坏死的病理变化，其中重要环节就是血供障碍^[24-26]，有报道在造模10周时血管内皮生长因子mRNA表达会减少^[27-28]。

骨形态发生蛋白是能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，具有修复骨折损伤部位骨组织以及牙齿内部骨组织的能力^[29-30]，其主要成骨作用在于其可以诱导间质细胞分化为成软骨细胞、成骨细胞，从而产生成骨作用^[31-33]。孙明林等^[34]实验证实骨形态发生蛋白对坏死股骨头有成骨诱导作用，可以刺激新生骨的形成、爬行替代坏死骨小梁，髓芯减压加骨形态发生蛋白组远较单纯髓芯减压植骨组疗效好。薛元锁等^[35]实验发现激素性股骨头坏死兔的骨小梁和骨髓组织中骨形态发生蛋白2水平明显减少，骨髓基质细胞向成骨细胞分化减少。

国外有研究表明，在骨组织形成以及修复的生理过程中，一方面，血管内皮生长因子可以对成骨细胞的分化产生促进作用^[36-38]；另一方面，骨形态发生蛋白2可以促进成骨样细胞血管内皮生长因子表达增加，并以此途径促进新血管在新生骨组织中形成；局部骨形态发生蛋白2的浓度也会对血管内皮生长因子产生影响，血管内皮生长因子水平与骨形态发生蛋白2水平呈正相关关系^[39-41]。因此该实验挑选出这两种细胞因子来评估股骨头区微环境情况。

实验运用0.4 μm孔径Transwell进行非接触性共培养，两种细胞间无接触但细胞分泌物可通过孔径，以此来确定BMSCs对成骨细胞的作用是通过旁分泌途径实现的。国内学者报道在体外成骨细胞与BMSCs共培养时^[42-43]，BMSCsⅠ型胶原的表达量增高，成骨能力增强。前人研究重点探讨成骨细胞对BMSCs的影响，该研究结果显示BMSCs对成骨细胞活力、凋亡也有影响。MTT结果显示在BMSCs和成骨细胞共培养下，实验组的吸光度值大于对照组，同时两组成骨细胞计数显示差异有显著性意义，MTT结果容易产生波动的原因在于细胞的状态和细胞数目容易产生波动。因此，实验利用同一批次分离培养的细胞，消除细胞本身状态不同给MTT结果产生的偏倚。实验结果显示，BMSCs在与成骨细胞非接触共培养时，可通过旁分泌提高成骨细胞的增殖活力。流式细胞仪检测结果显示，BMSCs可以通过旁分泌作用使得成骨细胞凋亡减少。

国外学者在研究髓核细胞和BMSCs接触性共培养时，上清液中BMSCs来源的胰岛素样生长因子1、转化生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子含量明显增加，说明BMSCs可以通过分泌作用影响细胞环境^[44]。ELISA法检测各组细胞血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2分泌量。由于细胞因子在细胞液中的浓度和细胞数有关，同样单位体积培养基内的细胞因子浓度和其细胞数成正相关。因此实验将每组细胞培养液固定为1 mL，并将细胞数都控制在同一水平，统计学分析各组细胞数差异无显著性意义，消除细胞数对于血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2分泌量的影响，即培养液中细胞因子浓度只与细胞分泌因子的能力相关。成骨细胞与BMSCs共培养组的细胞因子浓度均高于单独成骨细胞组，对此结果有3种解释：①成骨细胞的分泌能力增加，BMSCs分泌能力不变或者降低，但成骨细胞分泌能力增加大于BMSCs分泌降低；②BMSCs的分泌能力增加，成骨细胞分泌能力不变或者降低，但BMSCs分泌能力增加大于成骨细胞分泌降低；③成骨细胞、BMSCs分泌能力均增加。实验未对细胞因子的分泌来源进行确定，因此无法确定细胞因子浓度增加的是哪种具体机制。但无论哪种解释，在成骨细胞和BMSCs共培养时，周围细胞液中的血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2水平增加，二者均有利于股骨头坏死的修复，所以从这个角度可以认为，BMSCs可以通过旁分泌途径影响并改善其微环境。

很多研究指出，BMSCs移植治疗股骨头缺血性坏死时，BMSCs可分化为成骨细胞从而促进股骨头坏死修复^[45-46]。也有实验通过血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2等因子基因转载构建其高表达状态，移植后可改善修复股骨头坏死局部微环境。在动物体内实验中发现，BMSCs可以使股骨头区血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2的表达增加，改善股骨头坏死区微环境。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死

Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of early femoral head necrosis

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