静脉移植人脐血单个核细胞治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及抗炎机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0958

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4014-4020.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0958

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静脉移植人脐血单个核细胞治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及抗炎机制

靳娜¹，姚星宇²，张国华³，杨丽敏⁴，李剑波⁵，刘婕⁶，魏林洹¹，段瑞¹

¹内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；²满洲里南区医院内科，内蒙古自治区满洲里市 021400；内蒙古医科大学附属医院，³神经内科，⁵核医学科，⁶康复中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；⁴内蒙古医科大学基础医学院病原微生物与免疫实验中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010059

修回日期:2018-03-19 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 张国华，主任医师，硕士生导师。内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050
作者简介:靳娜，女，1991年生，汉族，内蒙古自治区巴彦淖尔市人，内蒙古医科大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(81360189)

Intravenous transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells in an intracerebral hemorrhage rat model: microPET-CT evaluation and anti-inflammatory mechanisms

Jin Na¹, Yao Xing-yu², Zhang Guo-hua³, Yang Li-min⁴, Li Jian-bo⁵, Liu Jie⁶, Wei Lin-huan¹, Duan Rui¹

¹Inner Mongolia Medical University Graduate School, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Department of Internal Medicine, Manzhouli Southern District Hospital, Manzhouli 021400, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ³Department of Neurology, ⁵Department of Nuclear Medicine, ⁶Rehabilitation Center, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ⁴Pathogenic Organisms and Immunology Laboratory of Inner Mongolia Medical University Basic Medicine School, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2018-03-19 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Zhang Guo-hua, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Jin Na, Master candidate, Inner Mongolia Medical University Graduate School, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360189

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
¹⁸F-FDG：是指氟代脱氧葡萄糖，葡萄糖是人体3大能源物质之一，将可以被PET探测并形成影像的的正电子核素¹⁸F标记在葡萄糖上，即¹⁸F-脱氧葡萄糖。通过脑组织的¹⁸F-脱氧葡萄糖代谢功能测定，可早期发现和诊断脑功能性病变，干预疾病的发生发展，达到早期防治目的。
酶联免疫法：是指把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，然后根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。具有特异性强、重复性好、稳定性高、灵敏度高及操作简便等优点。

摘要
背景：脐血中分离出的单个核细胞含有丰富的细胞类型，在细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程学中具有重要的研究和应用价值。
目的：通过microPET-CT及Longa评分评估人脐血单个核细胞治疗大鼠脑出血的疗效，同时探讨其部分治疗机制。
方法：采用二次注血/退针法制作脑出血大鼠模型，造模成功大鼠随机分为移植组与对照组，将从人脐血中分离出的单个核细胞经尾静脉注入移植组大鼠体内，对照组大鼠造模成功后不予治疗。各组大鼠均于移植前及移植后的第3，7，14，21天，通过microPET-CT及Longa评分对大鼠脑代谢变化及神经功能恢复情况进行评估；通过ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平。
结果与结论：①人脐血单个核细胞移植治疗后第7，14，21天，与对照组相比，移植组大鼠血肿中心及血肿周围脑代谢水平均显著升高(P < 0.05)，血肿及其周围缺血组织体积及Longa评分显著降低(P < 0.05)；②人脐血单个核细胞移植后第3，7，14天，移植组两种因子水平均较对照组显著降低(P < 0.05)，移植后第21天，两组血清中血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平均降至正常水平；③结果说明，人脐血单个核细胞移植可促进大鼠脑出血的神经功能恢复，其机制可能与其能够减少炎性因子表达及抑制炎性反应有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1556-9585(靳娜)

关键词: 脐血单个核细胞, 干细胞, 移植, microPET-CT, 神经功能评分, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素6, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mononuclear cells isolated from umbilical cord blood (UCB-MNCs) are rich in cell types which are of great benefit in cell replacement therapy, gene therapy and tissue engineering.
OBJECTIVE: To evaluate the efficacy of human UCB-MNCs (HUCB-MNCs) in the treatment of intracerebral hemorrhage rats by microPET-CT and Longa scores, and to discuss the therapeutic mechanism.
METHODS: We made a rat intracerebral hemorrhage model by autologous blood injection. After modeling, rats were randomly divided into two groups: transplantation group and control group. The HUCB-MNCs were transplanted into the rats in the transplantation group via the tail vein. Control group received no treatment. Before and at 3, 7, 14, 21 days after transplantation, brain metabolic changes and neurological function scores of rats in the two groups were evaluated by microPET-CT and Longa scores. Levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the rat serum of two groups were measured by ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 7, 14 and 21 days after HUCB-MNCs transplantation, the rates of brain metabolism in the hematoma center as well as around the hematoma in the transplantation group were significantly higher than that in the control group (P < 0.05), while the volume of hematoma and surrounding ischemic tissues as well as Longa scores were significantly reduced in the transplantation group as compared with the control group (P < 0.05). The levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the serum in the transplantation group were significantly lower than those in the control group at 3, 7, 14 days after transplantation, and further lowered to the normal levels at 21 days after transplantation. These findings suggest that transplantation of HUCB-MNCs through the tail vein can promote the neurologic recovery of cerebral hemorrhage rats, and one of the therapeutic mechanisms may be related to the reduction of inflammatory factors and the inhibition of inflammatory response.

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Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Tumor Necrosis Factor-alpha, Interleukin-6

中图分类号:

R743.34

靳娜，姚星宇，张国华，杨丽敏，李剑波，刘婕，魏林洹，段瑞. 静脉移植人脐血单个核细胞治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及抗炎机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4014-4020.

Jin Na, Yao Xing-yu, Zhang Guo-hua, Yang Li-min, Li Jian-bo, Liu Jie, Wei Lin-huan, Duan Rui. Intravenous transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells in an intracerebral hemorrhage rat model: microPET-CT evaluation and anti-inflammatory mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4014-4020.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠76只，其中10只作为ELISA分析时空白对照组大鼠，剩余66只大鼠造模，其中6只于造模过程中血液经针道返流或者死亡，实验过程中10只大鼠死亡，将死亡大鼠数据剔除，重新及时补充。实验过程中无大鼠感染。最终60只大鼠实验数据纳入结果分析。

2.2 人脐血单个核细胞活性 将10 μL新鲜分离出的人脐血单个核细胞稀释至1 mL，加入体积分数0.5%的锥虫蓝3 μL摇匀，将10 μL上述稀释液滴加至细胞计数板上，置于光学显微镜下观察细胞活性并将细胞浓度调整为1×10⁷ L^-1(图1)。

2.3 大鼠神经行为学变化 随机抽取造模大鼠，待麻醉清醒后行神经功能评分(图2A)，断头取脑解剖(图2B)，行microPET-CT扫描(图2C)验证造模成功。
2.4 移植组与对照组大鼠血肿中心代谢率(SUV%)比较 两组大鼠不同时间点血肿中心代谢率均随时间变化呈逐渐增高的趋势(P < 0.05)；除移植前及移植后第3天，其他各个时间点两组大鼠血肿中心代谢率差异均有显著性意义 (P < 0.05)，且移植组大鼠血肿中心代谢率高于对照组(表1)。

2.5 移植组与对照组大鼠血肿周围代谢率比较 两组大鼠不同时间点血肿周围代谢率均随时间推移逐渐增高(P < 0.05)；除移植前及移植后第3天，其他各时间点两组大鼠血肿周围代谢率差异均有显著性意义(P < 0.05)，且移植组大鼠血肿周围代谢率高于对照组(表2)。

2.6 移植组与对照组大鼠不同时间点血肿及周围缺血组织体积比较 两组大鼠血肿及周围缺血组织体积随时间变化呈现逐渐减小的趋势(P < 0.05)；除移植前无显著差异外，其他各个时间点两组大鼠体积差异均有显著性意义(P < 0.05)，且移植组体积减小的趋势更明显(表3，图3)。

2.7 各组神经功能评分变化 移植组与对照组大鼠不同时间点神经功能评分均随时间逐渐降低(P < 0.001)；除移植前及移植后第3天，其他各个时间点两组大鼠神经功能评分差异有显著性意义(P < 0.05)，且移植组评分较对照组低(图4)。

2.8 各组血清炎性因子变化 各组大鼠不同时间点血清中肿瘤坏死因子α水平变化：空白组大鼠各个时间点血清中肿瘤坏死因子α均维持在较低水平。对照组与空白组比较：血清中肿瘤坏死因子α水平在大鼠脑出血后即升高，于第3天达高峰后逐渐下降，第21天降至与空白组水平，其他各时间点对照组大鼠血清中肿瘤坏死因子α水平均较空白组高(P < 0.05)；移植组与空白组相比：移植组大鼠移植前及移植后第3，7天血清中肿瘤坏死因子α水平较空白组明显升高(P < 0.05)，至第14，21天时降至与空白组相比无显著差异；移植组与对照组对比：两组大鼠移植前血清中肿瘤坏死因子α水平无显著差异，移植后的3，7，14 d，移植组大鼠血清中肿瘤坏死因子α水平均较对照组低(P < 0.05)，至第21天，两组大鼠血清中肿瘤坏死因子α水平无显著差异(表4)。

各组大鼠不同时间点血清中白细胞介素6水平变化：空白组大鼠各个时间点血清中白细胞介素6水平均维持在一个稳定的低水平。对照组与空白组比较：大鼠血清中白细胞介素6水平在出血后即逐渐升高，于第7天达峰值后逐渐下降，于第21天降至与空白组无显著差异，其他各时间点血清中白细胞介素6水平均较空白组大鼠高(P < 0.05)；移植组与空白组相比：移植组大鼠移植前及移植后第3，7天血清中白细胞介素6水平较空白组明显升高(P < 0.05)，至第14，21天时降至与空白组相比无明显差异；移植组与对照组对比：两组大鼠移植前血清中白细胞介素6水平无显著差异，移植后第3，7，14天，移植组大鼠血清中白细胞介素6水平均较对照组低(P < 0.05)，第21天时两组大鼠血清中白细胞介素6差异无显著性意义(表5)。

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引言

脑出血是中老年人致残和死亡的主要原因之一，导致了巨大的经济和社会负担^[1]。然而目前内科的治疗手段仍局限于降低颅高压以及营养脑神经等对症支持疗法，外科治疗办法即为开颅或者微创术式清除颅内血肿，但因受损的脑组织被破坏不能发挥原有的生理功能，就会遗留难以治愈的后遗症。国内外大量研究均发现干细胞具有自我更新和多向分化潜能，可在特定环境下定向分化成不同的神经细胞类型，产生神经细胞替代作用^[2-4]，且有学者经统计学分析发现，干细胞疗法与中风患者的行为和功能显著改善相关^[5]，为脑血管病的治疗带来了新的希望。而脐血干细胞因其含量丰富、取材安全、免疫原性低，且较其他细胞更原始，增殖能力更强等大量优点成为极具潜力的生物资源^[6-10]。实验所用移植细胞——人脐血单个核细胞即来源于脐血，且课题前期实验组成员发现，从脐血中分离出的新鲜的单个核细胞经培养后利用免疫荧光法在倒置荧光显微镜下发现有Nestin及NSE表达，并观察到有类似轴突和树突粗长突起的神经样细胞^[11]。然而因其治疗脑血管病的疗效及其治疗机制还不十分明确，故国内外对于脐血单个核细胞移植治疗脑出血的动物及临床实验报道仍较少。

microPET-CT是专门为研究人类疾病的小动物模型而设的临床前影像设备，实现了功能影像学与解剖影像学的完美统一，空间分辨率显著提高，能在较小的体积容量上对目标组织进行动态分析，可以准确反映小动物脑组织损伤程度，更早、更灵敏的判断疾病的转归^[12]。早有研究认识到炎症反应是脑出血后脑组织二次损伤过程中重要的病理过程，而大量产生的不同类型的炎性因子则是启动和调节炎症反应的关键介质^[13]。

实验的目的在于通过microPET-CT观察人脐血单个核细胞移植前后不同时间点脑损伤部位血流及代谢变化，联合神经功能评分变化，评价人脐血单个核细胞移植治疗脑出血的疗效。并通过酶联免疫法(ELISA)检测大鼠人脐血单个核细胞移植前后血清中炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达水平的变化，探讨其是否具有抗炎机制进而发挥治疗脑出血的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年4至10月在内蒙古医科大学病原生物与免疫学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 人脐血 脐血由内蒙古医科大学附属医院产科健康足月新生儿提供，由产科医师通过新生儿脐静脉采血。产妇纳入标准：①足月生产产妇；②经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，产妇及家属知情同意。产妇排除标准：①患有心、肝、肾和其他脏器严重的器质性疾病者；②有传染病感染史者；③过敏体质者。

1.3.2 实验动物 健康成年Wistar清洁级大鼠76只，由内蒙古医科大学动物实验室提供，合格证号：SCXK(蒙) 2015-0001，体质量300-350 g，饲养及实验过程符合国家《实验动物管理条例》的规定^[14]。

1.4 实验方法

1.4.1 脑出血模型大鼠的构建 参照杨亚萍等^[15]报道方法，66只健康成年大鼠采取自体血二次注血/退针法制作大鼠脑出血模型，术前禁食8 h，体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL/kg)后将头部固定于立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)上，暴露颅骨前囟及冠状缝，设定右侧尾状核坐标原点(距右侧中线3.5 mm，前囟前0.5 mm，深度5.5 mm)，电钻(Makita Corporation，Japan)穿透头骨后，用微量注射器于左心室采血120 μL，由创口进针至右侧尾状核，先注血50 μL，等候2 min，再次缓慢注入50 μL，停针4 min后退针2 mm，继续停针约4 min，观察无血液返流，将注射器缓慢退出，骨蜡封闭创口，可吸收缝线缝合头皮。术后大鼠电暖风照射保暖直至麻醉清醒。大鼠行Longa评分进行初筛：0分记为大鼠未见明显神经功能缺损体征；1分记为大鼠左前肢伸展受限；2分记为大鼠行走时逆时针方向打转；3分记为大鼠站立及行走时向病灶对侧倾倒；4分记为大鼠出现意识不清，完全不能行走；5分为大鼠死亡^[7]。评分1-3分的大鼠初步判定造模成功，继续于本院小动物实验室行头PET-CT扫描确诊脑出血。其中6只于造模过程中血液经针道返流或者死亡，实验过程中10只大鼠死亡。最终共50只造模成功大鼠存活。

1.4.2 分离及移植人脐血单个核细胞将采集的脐血按照脐血干细胞处理试剂盒(Wealthlin Science Technology Inc.Canada)操作步骤在4-8 h内分离出人脐血单个核细胞，加锥虫蓝观察细胞活性后，将细胞浓度调整为1×10¹⁰ L^-1备用。

1.4.3 实验大鼠分组情况 实验共分为3部分：第1部分，从50只造模成功大鼠中随机取10只大鼠均分为移植组与对照组各5只，行microPET-CT检查；第2部分：从剩余的40只模型大鼠中随机挑出20只均分为移植组与对照组各10只，行神经功能评分；第3部分：剩余20只大鼠随机均分为移植组及对照组各10只，另取10只健康成年大鼠作为空白对照组，行ELISA分析。

造模成功24 h内，移植组大鼠用乙醇反复消毒鼠尾，以微量注射器经尾静脉缓慢移植备用的细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的细胞悬液1 mL，注射完毕停顿数10 s后拔针，无菌棉球按压2 min，避免出血及细胞悬液反流，对照组不接受任何特殊治疗。

1.4.4 Micro-PET-CT扫描 移植组(n=5)及对照组(n=5)组内每只大鼠均于移植前及移植后第3，7，14，21天进行microPET-CT(SIEMENS Inveon MM，北京，中国)扫描。PET-CT扫描之前，大鼠禁食12 h，扫描前40 min称质量后在非麻醉状态下尾静脉注射示踪剂：800 uCi/400 g ¹⁸F-FDG，待30 min的药物分布后，大鼠进行麻醉后行头部扫描。采集图像上示踪剂分布稀少或缺失区为血肿及周围缺血组织区，将摄取减低区最大截面确定为测量平面，在血肿中心及周围缺血组织各选取一处作为感兴趣区，分别标注为ROI1和ROI2，计算相应的SUV值；选取对侧大脑的对称区域为镜像的感兴趣区，分别标注为ROI1，和ROI2，测量相应的SUV值，最终计算SUV%(患侧感兴趣区SUV值/对侧镜像SUV值×100%)记为血肿中心及周围的代谢率。在扫描图像横断面、矢状面及冠状面测量出血肿最长、最宽和上下径得到的立体椭圆形体积作为血肿及周围缺血组织体积。

1.4.5 神经功能评分 移植组(n=10)及对照组(n=10)大鼠分别于移植前及移植后的3，7，14，21 d，采用Longa 5级评分对神经功能恢复情况进行比较。

1.4.6 ELISA法检测血清炎性因子水平 另取10只健康大鼠作为空白对照组，移植组(n=10)及对照组(n=10)组内每只大鼠分别于移植前及移植后第3，7，14，21天，于左心室采血，收集血清存于-70 ℃冰箱备用。待标本收集完毕后，采用ELISA法检测不同时间点血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平，检测方法严格按照试剂盒(武汉依莱瑞特生物科技有限公司)操作步骤逐步进行。用酶标仪在450 nm波长处分别测量各孔的吸光度值，计算各检测指标的质量浓度。

1.5 主要观察指标 ①两组大鼠血肿中心脑代谢率变化情况；②两组大鼠血肿周围脑代谢率变化情况；③两组大鼠不同时间点血肿及周围缺血组织体积变化情况；④两组大鼠不同时间点神经功能评分变化；⑤各组大鼠不同时间点血清炎性因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素6水平变化。

1.6 统计学分析 使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的数据采用x(_)±s表示；经正态分布检验且方差齐，多组不同时间点之间的比较采用单因素方差分析，两组间相同时间点之间的比较采用两样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

人脐血单个核细胞来源于脐血，2014年Julio Castano等研究后发现，在确定的神经源性培养条件下，脐血细胞可迅速转变为神经上皮形态并表现出高扩增能力^[16]，课题前期实验组成员发现人脐血单个核细胞在未加任何诱导剂情况下经培养后可分化为神经样细胞^[11]。不仅如此，近年有研究报道称人脐血单个核细胞中还发现有一定数量的神经干细胞^[17]，这可能对其移植后向神经干细胞分化更加有利，且虽然人脐血单个核细胞成分复杂，但已有实验证明人脐血单个核细胞不具有致瘤性^[18]。综上所述，人脐血单个核细胞可以直接移植治疗神经系统疾病。一些动物实验及临床实验也印证了人脐血单个核细胞在治疗中枢神经系统疾病方面发挥了不错的治疗效果，例如，Karlupia等^[17]通过动脉移植人脐血单个核细胞治疗大鼠中动脉闭塞模型，发现与对照组相比，移植细胞的大鼠梗死面积及神经缺损均得到了显著改善；中国学者姚星宇等^[19]的研究显示急性一氧化碳中毒迟发性脑病患者经人脐血单个核细胞移植治疗后，肌肉痉挛、认知功能及行为执行能力都明显改善。

实验的重点在于通过microPET-CT来评价人脐血单个核细胞治疗脑出血大鼠的疗效。众所周知，脑组织的代谢与其他组织不同，脑赖以产生能量的底物和储存的能量十分有限，而葡糖糖作为脑组织能量的主要来源，其变化水平可以客观地反映生理及病理状态下脑局部功能状态。PET-CT是将PET和CT整合在一起，组合成一个完整的显像系统，从分子水平检测正常情况下和病理状态下的神经细胞活动及代谢变化，对疾病进行疗效评估和预后判断，对脑出血的评估水平显著强于CT及核磁。实验即利用¹⁸F-FDGPET显示脑出血后脑损伤区域糖代谢情况。观察发现，两组大鼠随着时间的推移血肿中心及周围代谢率均逐渐升高，体积逐渐减小，且两组大鼠神经功能评分随着时间的变化也出现相应的下降，这与机体发生损伤后可发挥自我保护作用及脑卒中后内源性干细胞可以增殖、分化、迁移，进行自我修复相符^[20-21]。但综合实验结果来看，移植组大鼠表现出的恢复能力较对照组更好。国内学者朱华等^[22]在食蟹猴脑出血后1周将人骨髓间充质细胞通过脑内移植途径注入猴体内观察发现，移植动物在细胞移植后1周神经功能缺损情况即出现明显改善，PET显示在细胞移植后2周猴血肿周围脑代谢率即较对照组出现显著增高。上述实验所得结论与此次实验基本一致，区别在于发挥治疗作用的时间不尽相同，分析原因可能与移植时间窗、移植途径、移植细胞不同及所用剂量不同有关。

实验中，经尾静脉移植入大鼠体内的脐血单个核细胞，进入血液循环后，细胞要承受“首过效应”，经过肝脏、肺、脾脏过滤，且需通过血脑屏障、脑脊液脑屏障，最终进入病灶的细胞数量少，则分化为神经细胞的数量就少，不足以完全替代坏死的神经细胞，且即使移植的细胞能够顺利归巢且存活，并表达神经细胞标志，还需进一步证实失去神经支配的细胞在病灶组织中能否建立起有效的联系。故有学者提出异议，干细胞移植的治疗效果可能不是通过直接细胞替代，而是通过调节宿主微环境来发挥治疗作用的^[23]。有研究表明，干细胞可以分泌各类型营养因子来改善损伤区域微环境，减少神经元的凋亡及促进受损神经元的修复^[24]，并促进损伤区域新生血管网的生成，改善病灶区域缺血状况^[25]，不仅如此，这些新生血管还可以作为内源性神经祖细胞向受损脑区域迁移的支架^[20]。而在脑出血早期就有大量的炎性因子在损伤部位聚集，尤其在微血管部位，这些炎性因子能够改变血脑屏障结构，同时还可导致内皮细胞的损伤，破坏血管内皮细胞的通透性，导致血肿及周围脑组织代谢紊乱，出现缺血缺氧，从而介导、激活脑组织的继发性损伤^[26]。实验即从脑出血后的病理机制入手，探讨人脐血单个核细胞是否能够抑制炎性因子的表达从而改善损伤区域微环境。此次实验通过ELISA法检测在炎症反应过程中扮演了重要角色的两个炎性因子：肿瘤坏死因子α和白细胞介素6^[27-29]。从实验结果来看，细胞移植后3天炎性因子水平即有所降低，且移植组大鼠炎性因子水平降至正常低水平的时间点较对照组大鼠提前。有学者在人脐血间充质干细胞移植治疗兔脑梗死的实验中发现，细胞移植后6 h即会显著抑制兔血清中白细胞介素1β，白细胞介素6，肿瘤坏死因子α的表达^[30]。这与实验所得结果相同，只是作用时间点不同，这可能与实验设计时间点有关，且实验中每只大鼠需连续不同时间点左心室采血，对大鼠损伤较大，也会影响炎性因子表达水平。

实验推测，人脐血单个核细胞通过早期减少促炎细胞因子来减弱炎症级联反应并降低其神经毒性作用从而发挥对神经系统的保护作用，机制可能与以下几点有关：①当机体发生损伤后，凋亡及坏死的细胞释放出的相关介质能够募集大量免疫细胞，同时产生的自由基及趋化因子等会刺激人脐血单个核细胞分泌大量的免疫抑制因子，从而发挥强有力的免疫抑制作用；②人脐血单个核细胞具有非特异性免疫调节能力，这种免疫调节能力能够抑制各类型的免疫细胞增值或者发育、成熟，且对于这些免疫细胞的分泌因子也具有抑制作用。当然，上述推测还需进一步通过实验来验证。

实验虽取得了预期结果，但实验过程中仍存在一些待解决的问题。首先，实验采用二次注血-退针法制作脑出血模型，脑内注血量多推荐为50 μL，相当于人脑40 mL的出血量，但前期预实验发现，大鼠注入50 μL的血量并未出现明显的神经功能缺损症状，通过尝试发现，注入100 μL血量可以保证大鼠神经功能评分≥2分，但血肿体积增大则对大鼠机体创伤就更大，同时因做PET-CT分析大鼠需不同时间点连续体内注射对比剂，做ELISA分析的大鼠需不同时间点连续左心室采血，实验过程中大鼠于第7，14天时死亡率较高。虽然大鼠出现神经功能缺损症状，但与脑动脉破裂所致脑实质出血的病理过程仍有区别，且增加注血量加大了实验难度，还需不断改善造模过程。其次，虽然验证了脐血单个核细胞治疗大鼠脑出血有效，但对于移植干细胞最佳时间窗的选择仍未有定论。从脑出血后病理发展过程来看，发病超早期因大脑能量代谢障碍所致大量氧自由基和兴奋性氨基酸堆积，不利于细胞存活，但随着出血时间的延长，损伤处脑组织产生的代谢产物及分泌的细胞因子等趋化物质就会逐渐减少，且病灶处脑组织胶质瘢痕增生，不利于移植细胞迁移及存活，故推断在发病早期即移植干细胞，可以减轻脑细胞的病理损害，并将神经系统损害程度降到最低，当然，这还需要后期实验进一步比较验证。再次，实验移植的人脐血单个核细胞量为1 mL细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，经长时间迁移消耗，最后能够归巢到病灶的细胞数量十分有限，但进入病灶的细胞数量直接决定了移植的治疗效果^[31]。虽然静脉移植方法操作简便，可重复多次移植，但这也会造成花费较高，而如果加大移植细胞的数量，理论上可能有足够数量的干细胞进入病灶区域发挥作用，但细胞密度过大也可能产生血管微栓塞和脑梗死。未来研究可以考虑蛛网膜下腔移植干细胞，既可以避免大脑局部移植的损伤，也可以较动、静脉移植有较多的细胞归巢。

实验通过PET-CT分析联合神经功能评分比较肯定了脐血单个核细胞能够改善血肿及周围脑组织代谢水平，促进血肿吸收及神经功能恢复；其治疗机制之一可能与抑制炎性因子、减轻炎症反应有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

静脉移植人脐血单个核细胞治疗脑出血大鼠疗效的microPET-CT评价及抗炎机制

Intravenous transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells in an intracerebral hemorrhage rat model: microPET-CT evaluation and anti-inflammatory mechanisms

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