剖宫产手术不影响孕鼠体内骨髓间充质干细胞的归巢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0885

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2644-2649.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0885

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剖宫产手术不影响孕鼠体内骨髓间充质干细胞的归巢

沙文琼，折瑞莲，王硕石，王倩，许曼，石苇，李岚

暨南大学附属第二临床医学院(深圳市人民医院)产科，广东省深圳市 518020

修回日期:2018-05-07 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 折瑞莲，硕士，主任医师，深圳市人民医院产科，广东省深圳市 518020
作者简介:沙文琼，女，1980年生，河北省秦皇岛市人，博士，副主任医师，主要从事胎盘病理学和胎盘、脐带间充质干细胞研究。
基金资助:
深圳市科技计划(JCYJ20140416122811918)

Cesarean section has no impact on bone marrow mesenchymal stem cell homing in pregnant rats

Sha Wen-qiong, She Rui-lian, Wang Shuo-shi, Wang Qian, Xu Man, Shi Wei, Li Lan

Department of Obstetrics, Second Clinical Medical College of Jinan University (Shenzhen People’s Hospital), Shenzhen 518020, Guangdong Province, China

Revised:2018-05-07 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: She Rui-lian, Master, Chief physician, Department of Obstetrics, Second Clinical Medical College of Jinan University (Shenzhen People’s Hospital), Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
About author:Sha Wen-qiong, M.D., Associate chief physician, Department of Obstetrics, Second Clinical Medical College of Jinan University (Shenzhen People’s Hospital), Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Plan of Shenzhen City, No. JCYJ20140416122811918

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
归巢：是指移植入宿主体内的干细胞入血后，穿过血管内皮，停留到各个组织内的过程。间充质干细胞也具有归巢的行为特征，并且可归巢至受损伤部分，参与创面愈合或分化成靶组织细胞，替代损伤细胞。
SRY-PCR：SRY基因是雄性的性别决定基因。此次研究中体外培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞，经尾静脉注射入雌性大鼠体内，雌性大鼠处死后，通过RT-PCR技术检测组织中SRY基因含量，间接反映了组织中雄性大鼠骨髓间充质干细胞的存留量。

摘要
背景：剖宫产术后远期并发症(前置胎盘、胎盘植入、瘢痕处妊娠、子宫破裂)危及孕产妇生命，剖宫产术切口瘢痕处的子宫内膜及平滑肌缺损、蜕膜形成不良可能是主要病因。间充质干细胞具有修复组织损伤的功能，归巢于损伤部位的细胞量有可能影响组织修复的效果。
目的：在大鼠剖宫产手术模型中探讨间充质干细胞输入后在体内的分布、归巢情况。
方法：体外分离雄性大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定。取雌性Wistar大鼠随机分为2组：剖宫产手术组大鼠于受孕第21天进行剖宫产术，术后即时经尾静脉注射制备好的雄性大鼠间充质干细胞；对照组大鼠自然分娩后即注射等量雄性大鼠间充质干细胞。分别于注射后第7，28天处死大鼠，通过SRY-PCR技术检测其心、肺、肝、肾、以及子宫瘢痕组织中SRY基因含量，间接反映组织中雄性大鼠骨髓间充质干细胞的存留量及相对分布水平。
结果与结论：剖宫产手术组细胞注射后第7天，SRY基因在肺组织中含量最高，其次是肝，在肾组织中也有一定量的分布，而在心脏和子宫瘢痕处的SRY基因含量较少；注射后第28天SRY基因在肺、肝和肾中的含量均有一定程度的下降(P < 0.05)，而在心脏和子宫瘢痕处，SRY基因的含量未见显著变化(P > 0.05)。非手术对照组注射后第7，28天SRY基因的检测结果和剖宫产手术组基本一致，心脏和子宫组织的SRY基因含量均较低。结果提示：异体骨髓间充质干细胞进入大鼠体内主要分部于血流丰富的肺、肝、肾组织，并且随着时间干细胞量逐渐减少；心脏和子宫组织中的骨髓间充质干细胞数量较少，随时间变化不明显。剖宫产手术损伤并没有影响骨髓间充质干细胞在孕鼠体内的分布，也没有增加骨髓间充质干细胞在子宫手术瘢痕处的归巢和定植。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2520-9217(沙文琼)

关键词: 剖宫产术, 骨髓间充质干细胞, 归巢, SRY基因, 组织修复, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Long-term complications of cesarean section include placenta praevia, placenta accreta, cesarean scar pregnancy and uterine rupture. These life-threatening complications in pregnant women maybe result from the defects of endometrium and uterine smooth muscle as well as poorly formed decidua in the scar of cesarean section. Mesenchymal stem cells have the function of repairing tissue injuries, and the amount of cells homing to the site of injury may affect the effect of tissue repair.
OBJECTIVE: To explore the distribution and homing of bone marrow mesenchymal stem cells from male rats into rat models of cesarean section.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells isolated from male rats in vitro were cultured and identified. Female Wistar rats were randomized into two groups: cesarean section group and control group. Rats in the cesarean section group were given intravenous administration of bone marrow mesenchymal stem cells from male rats via the tail vein on day 21 after cesarean section, and non-operative rats in the control groups were given the same amount of bone marrow mesenchymal stem cells from male rats after natural delivery. Rats in the two groups were sacrificed on days 7 and 28 after cell injection. The distribution of bone marrow mesenchymal stem cells from male rats in tissues (including heart, lungs, livers, kidneys, and uterine scar) was detected by measurement of the SRY mRNA level using SPY-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: In the cesarean section group, the SRY gene was most abundant in the lung, followed by the liver and the kidney on day 7 after injection, although the distribution of SRY gene in the heart and uterine scar was low; on day 28 after injection, the levels of SRY gene in the lung, liver and kidney decreased (P < 0.05), but had no significant changes in the heart and uterine scar (P > 0.05). In the control group, the distribution of SRY gene was similar to that in the cesarean section group on both days 7 and 28 after injection, and the levels of SRY gene in the heart and uterus were low. These findings reveal that allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells implanted mainly distribute in tissues with abundant blood flow, including lungs, livers and kidneys. And the cell number decreases gradually over time. Since the amount of implanted cells in the heart and uterus is very low, the change with time is not obvious. Cesarean section injury has no impact on the distribution of bone marrow mesenchymal stem cells in pregnant rats and there is of course no increase in the homing and colonization of bone marrow mesenchymal stem cells in a cesarean scar.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Cesarean Section, Genes, sry, Stem Cells

中图分类号:

R394.2

沙文琼，折瑞莲，王硕石，王倩，许曼，石苇，李岚. 剖宫产手术不影响孕鼠体内骨髓间充质干细胞的归巢[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2644-2649.

Sha Wen-qiong, She Rui-lian, Wang Shuo-shi, Wang Qian, Xu Man, Shi Wei, Li Lan. Cesarean section has no impact on bone marrow mesenchymal stem cell homing in pregnant rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2644-2649.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠BMSCs的培养和鉴定 大鼠BMSCs呈长梭形贴壁生长，并具有较好的增殖能力。在成骨培养基和成脂培养基中体外三四周的诱导，大鼠BMSCs可向骨细胞及脂类细胞进一步分化，可分化为成脂细胞及成骨细胞(图1)。

流式细胞仪检测结果提示：BMSCs的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166均呈阳性表达，表达效率分别为96.2%，87.9%，94.7%，89.8%，93.7%和92.9%，BMSCs的CD14、CD34和CD45均呈阴性表达，表达效率分别为0.23%，0.34%和0.54% 。

2.2 实验动物数量分析 入组的24只大鼠在处死前没有死亡，全部进入结果分析。

2.3 SRY-PCR结果 SRY基因是雄性的性别决定基因。此次研究中体外培养雄性大鼠BMSCs，经尾静脉注射入雌性大鼠体内，雌性大鼠处死后，检测组织中SRY基因含量，间接反映了组织中雄性大鼠BMSCs的存留量。

两组大鼠经尾静脉注射雄性大鼠BMSCs后，通过RT-PCR技术检测大鼠各个组织(心、肺、肝、肾、以及子宫瘢痕)中SRY基因的相对含量，从而评价BMSCs的分布水平。注射后7 d，剖宫产手术组大鼠SRY基因在肺组织中含量最高(0.073 1±0.018 4)，其次在肝组织中(0.012 6± 0.002 8)，在肾组织中也分布一定比例(0.005 3±0.002 7)，而在心脏(0.000 6±0.000 1)和子宫瘢痕(0.001 0±0.000 3)处的SRY基因含量较少。注射后28 d，各组织中SRY基因的相对含量与7 d的检测结果略有不同，主要体现在肺(0.039 6±0.008 4)、肝(0.009 5±0.003 3)和肾(0.003 9± 0.001 6)中的相对含量均有一定程度的下降(P < 0.05)，而在心脏(0.000 8±0.000 3)和子宫瘢痕(0.001 0±0.000 2)处，SRY基因的相对含量未见显著变化(P > 0.05)。见图2。

在非手术对照组(图3)，孕鼠注射雄性大鼠BMSCs 7 d后，SRY基因仍然在肺组织中含量最高(0.070 5±0.023 4)，其次在肝组织中含量较多(0.013 4±0.002 3)，在肾组织中也分布一定比例(0.006 1±0.005 5)，在心脏(0.0006± 0.0002)和子宫(0.001 1±0.000 4)处的SRY基因含量较少；注射28 d肺(0.038 4±0.020 4)、肝(0.009 1±0.002 7)和肾(0.004 0±0.001 9)中的相对含量均有一定程度的下降，而在心脏(0.000 7±0.000 3)和子宫(0.000 9±0.000 3)处，SRY的相对含量未见显著变化，总体来讲，与剖宫产手术组的检测结果相似。

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引言

近年来世界各地的剖宫产率逐渐升高。WHO2007年在亚洲的大规模调查显示：中国剖宫产率高达46.2%，泰国34.1%，日本19.8%，印度17.8%^[1]。剖宫产术可能给产妇产后带来一系列近远期并发症^[2]。研究表明有剖宫产手术史者(瘢痕子宫)再次妊娠后前置胎盘、胎盘植入、瘢痕处妊娠发生率明显高于无剖宫产手术史者。对于有剖宫产史再次妊娠的孕妇，子宫手术瘢痕处破裂是一种严重的并发症，可导致胎死宫内、失血性休克甚至子宫切除^[3]。剖宫产切口瘢痕处的子宫内膜及平滑肌缺损、蜕膜形成不良可能是这些严重并发症的主要病因，如果能改善剖宫产术切口的愈合，及时修复剖宫产术造成的组织损伤，则可能预防这些术后并发症的发生。

间充质干细胞最早从骨髓中分离出，在脂肪组织、脐血、胎盘、脐带等组织中也能分离得到，在体外可分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉细胞等^[4-7]。间充质干细胞可以分泌多种细胞因子、趋化因子，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子，血管生成素、肾上腺髓质素和胰岛素样生长因子等^[8-9]。目前多项研究提示间充质干细胞具有修复损伤组织的作用，作为在组织工程和再生医学领域最有应用前景的细胞，间充质干细胞已经初步应用于临床治疗各种损伤性疾病，如烧伤、皮肤溃疡、心肌梗死、脑脊损伤、骨和软骨缺损^[10-16]，还可用于治疗糖尿病、系统性红斑狼疮等疾病^[17-19]，但目前还鲜有间充质干细胞用于修复剖宫产术子宫切口的相关研究。

现有研究显示，当组织损伤、缺血缺氧时，内源性或外源性的间充质干细胞可以表达特异性受体，介导细胞迁移，归巢于受损组织，一定数量的间充质干细胞归巢可以帮助组织损伤的修复^[20-21]。间充质干细胞表面广泛表达趋化因子和生长因子等受体，趋化因子、黏附分子、生长因子等均参与了其归巢过程^[22-23]。因此研究间充质干细胞在体内的归巢情况对其临床应用、选择治疗方案、提高治疗效果有重要意义。

该研究拟建立大鼠剖宫产手术模型，通过尾静脉输入雄性大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，然后对大鼠进行解剖，通过SRY-PCR法检测大鼠心、肺、肝、肾、子宫组织中的SRY基因含量，分析BMSCs在各组织的分布以及在子宫切口处的归巢情况，从而为应用BMSCs修复子宫手术切口提供参考依据。

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材料方法

1.1 设计 细胞学、动物学、对比观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年4至10月在深圳市暨南大学附属第二临床医学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雌性Wistar大鼠24只，6-8周龄，体质量220-280 g；雄性Wistar大鼠1只，体质量130 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养环境为标准环境，怀孕大鼠与其他大鼠隔离，单独饲养。

1.3.2 实验试剂与仪器 细胞培养箱：Thermo Heracell 150i；流式细胞仪：BD FACSCalibur；实时荧光定量PCR仪：Applied Biosystems 7500；DMEM/F12培养基：Gibco11330032；胎牛血清：Gibco 10099141；DNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (货号：9765A)；实时荧光定量PCR试剂盒：TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq^TM(货号：DRR820A)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠BMSCs制备和鉴定 取雄性Wistar大鼠1只(体质量130 g)，从鼠股骨和胫骨收集骨髓，用1.073 g/mL的Percoll分离液分离，并用密度梯度离心法，从骨髓中分离BMSCs；将分离得到的细胞用DMEM/F12培养基(含体积分数10% FBS，penicillin/streptomycin 100 U/mL to 0.1 g/L，2 mmol/L L-glutamine)悬浮，并于37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养；传代三四次后用于后续研究。

收集对数生长期的BMSCs，以2×10⁶ L^-1的细胞浓度接种到96孔板中，接种后正常培养，分别在培养第0，1，2，3，4天，采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖指数。使用流式细胞仪检测细胞表面标记物：CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD34、CD73、CD105、CD166；并在体外诱导BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞方向分化，具体参照程斌等^[24]的诱导方案。

1.4.2 大鼠剖宫产手术模型建立 取Wistar雌性大鼠12只(6-8周龄，体质量220-280 g)，分别于受孕第21天进行剖宫产术，具体操作如下：大鼠经10%水合氯醛麻醉后。于腹部消毒，打开腹腔，暴露两侧子宫，于子宫中断剪约0.5 cm的切口，取出仔鼠及胎盘，缝合子宫切口，子宫归位后再进一步缝合腹腔，对腹部进行消毒后常规抗感染饲养。

剩余12只不造模为非手术对照组，受孕后自然分娩。

1.4.3 SRY-PCR对雄性大鼠BMSCs的体内分布进行定位

分组及干预：24只雌性孕鼠随机分为剖宫产手术组(n=12)和非手术对照组(n=12)。剖宫产手术组孕鼠进行剖宫产术，在术后即时经尾静脉注射制备好的雄性大鼠BMSCs(细胞悬于生理盐水中，按5.0×10⁶/kg剂量注射)^[19-20]；非手术对照组孕鼠自然分娩后即注射同等剂量的雄性大鼠BMSCs。

取材：分别于注射后7 d(n=6)、28 d(n=6)处死大鼠，解剖后取心脏、肺、肝、肾以及子宫瘢痕处组织，通过SRY-PCR技术检测大鼠各个组织中BMSCs的相对分布水平。

SRY-PCR具体操作方法：采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit提取各组织中的DNA，进行实时荧光定量PCR。SRY引物及内参(GAPDH)引物序列：SRY forward (F) 5’-CAC ACT ATC ATA TAC GGA CA -3’，reverse (R) 5’- ACA GGC TGT AAA TAA ATG C -3’，PCR产物长739 bp；GAPDH forward (F) 5’- GCC AGC CTC GTC TCA TAG ACA-3’，reverse (R) 5’- AGA GAA GGC AGC CCT GGT AAC-3’，PCR产物长89 bp。上述引物均由上海瑞捷生物制备。采用TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq^TM进行RT-PCR实验，于Real Time Quality PCR仪中进行反应，根据PCR结果分析各组织中SRY基因的含量。

1.5 主要观察指标 通过检测雌性大鼠体内的SRY基因相对含量来反映各个组织中供体BMSCs的归巢数量。

1.6 统计学分析 采用EXCEL 2003进行统计数据分析，数据以x(_)±s表示，组间的差异比较采用两样本t 检验。

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讨论

Krap等^[25]认为“间充质干细胞归巢”是指：间充质干细胞在靶组织的脉管中被捕获，再穿过血管内皮细胞，迁移到靶组织的过程。间充质干细胞具有帮助组织损伤修复、促进组织细胞再生的能力。间充质干细胞归巢于靶组织是其应用于临床的前提，只有保证一定的归巢率，才能保证间充质干细胞的应用疗效。目前对于间充质干细胞归巢于子宫平滑肌组织的相关研究报道很少，因此该研究希望在剖宫产手术模型中探讨间充质干细胞输入后在体内的分布、归巢情况，为进一步应用于临床改善手术切口愈合、预防剖宫产术后远期并发症提供研究资料。

已有研究表明，肺对外源性静脉注入的细胞具有良好的富集效果，间充质干细胞从静脉注入后，大部分都分布于肺组织，其次分布于肝、肾组织中^[26-27]，这可能与体内毛细血管和内皮网状系统分布有关。间充质干细胞输入到梗死心肌模型后存活率较低，梗死组织中绝大部分间充质干细胞输入后约1周之内死亡^[28-30]，这可能与心肌梗死区缺少血供和营养成分以及梗死区自由基的产生、免疫炎性反应等有关。张静等^[31]的研究提示：在大鼠心肌梗死模型中间充质干细胞输入初期组织定植数量较多，但随着时间的延长，定植细胞数量逐渐减少，于输入后第9天基本全部丢失。作者此次实验的研究结果与以往研究结果相似，即雌性大鼠肺组织中BMSCs数量较多，其次为肝、肾组织；心脏和子宫组织中BMSCs数量较少，可能与血流量相对低有关。另一方面，对比BMSCs注射后7 d和28 d的结果，可以发现：在注射28 d后，各组织中SRY基因相对含量均有所下降，由此可见，雄性大鼠的BMSCs并不能在雌性大鼠的体内长期大量存活，逐渐被宿主清除。但此种现象是由于免疫排斥原因还是其他细胞活力相关机制，尚不明确。心脏和子宫瘢痕中的SRY基因含量较低，在7 d和28 d的比较中，未见显著变化。该研究中输入后第7天和第28天心脏和子宫瘢痕处BMSCs定植量很少，可能也与检测时距离注射BMSCs时间较长有关，但同样时长肺、肝、肾组织中BMSCs还能维持一定的数量，提示BMSCs在心脏和子宫存留的时间可能比肺、肝、肾中更短暂。

LV di Bonzo等^[32]给正常裸鼠和慢性肝损伤裸鼠经尾静脉输入间充质干细胞，结果提示慢性肝损伤裸鼠间充质干细胞定植量较正常裸鼠多，肝脏内炎症环境对间充质干细胞归巢有促进作用。何秀华等^[33]分别通过尾静脉和门静脉给大鼠输入间充质干细胞，结果表明门静脉输入途径间充质干细胞定植于肝脏量较尾静脉途径多；移植途径对间充质干细胞归巢、定植到肝脏有一定影响。间充质干细胞输入时间及数量、方案均影响其归巢的效果。而此次研究中非手术对照组与剖宫产手术组相比，BMSCs输入后的体内分布情况极为相似，在子宫的定植量也未见显著区别，这说明BMSCs输入后7，28 d，剖宫产手术损伤并没有增加BMSCs归巢、定植于子宫的数量，这可能也与检测时距离注射BMSCs时间较长有关，此次研究的检测时间段没有展现BMSCs输入初期剖宫产手术损伤对其归巢的影响。该研究的初步结果提示，剖宫产术后经尾静脉注射BMSCs，其在大鼠子宫组织中定植量较少。因此，如果调整给药途径和细胞剂量，有可能提高异体BMSCs在子宫组织的归巢、定植量。

综上所述，该研究从细胞整体分布的角度评价了BMSCs在体内的分布、归巢，为间充质干细胞修复子宫手术瘢痕、预防术后远期并发症的进一步研究提供了理论依据；尽管初步结果提示该细胞在子宫瘢痕处的归巢、定植量较少，但是，体内注射后是否具有改善子宫瘢痕愈合的效果，仍需要进一步组织学评价和免疫组化分析。另外，体内注射BMSCs初期子宫瘢痕处归巢的情况还需要进一步探讨研究；给药途径和细胞剂量还需要优化，以提高BMSCs在子宫瘢痕处的归巢、定植量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

剖宫产手术不影响孕鼠体内骨髓间充质干细胞的归巢

Cesarean section has no impact on bone marrow mesenchymal stem cell homing in pregnant rats

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