腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0515

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2650-2655.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0515

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腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性

武成聪¹，荣树¹，任静¹，吴铮¹，刘涛¹，刘克廷¹，朱博¹，黄合飞¹，王芳²

¹曲靖市第一人民医院骨一科，云南省曲靖市 655000；²曲靖市第二人民医院病理科，云南省曲靖市 655000

修回日期:2018-02-01 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 王芳，硕士，医师，曲靖市第二人民医院病理科，云南省曲靖市 655000
作者简介:武成聪，男，1987年生，汉族，2014年桂林医学院毕业，硕士，医师，主要从事骨与软骨组织工程、生物材料学研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31160199)；云南省教育厅科学研究基金项目(2016ZDX074)

Transferring adenovirus vector-mediated enhanced green fluorescent protein gene into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells: effectiveness and toxicity

Wu Cheng-cong¹, Rong Shu¹, Ren Jing¹, Wu Zheng¹, Liu Tao¹, Liu Ke-ting¹, Zhu Bo¹, Huang He-fei¹, Wang Fang²

¹First Department of Orthopaedics, Qujing No. 1 Hospital, Qujing 655000, Yunnan Province, China; ²Department of Pathology, Qujing Second Hospital, Qujing 655000, Yunnan Province, China

Revised:2018-02-01 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: Wang Fang, Master, Physician, Department of Pathology, Qujing Second Hospital, Qujing 655000, Yunnan Province, China
About author:Wu Cheng-cong, Master, Physician, First Department of Orthopaedics, Qujing No. 1 Hospital, Qujing 655000, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31160199; the Science Research Foundation of the Department of Education of Yunnan Province, No. 2016ZDX074

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
感染复数：微生物学中定义为感染时噬菌体与细菌/细胞个数之比，即平均每个细菌感染噬菌体的数量。感染复数用于病毒感染细胞的研究中，其含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)：为Runt相关转录因子家族成员，优先表达成骨细胞，是间充质干细胞向成骨细胞定向分化和成熟的标志，成骨细胞和骨形成中关键的转录因子，在成骨分化信号途径中发挥重要作用。

摘要
背景：重组腺病毒对细胞生长、存活存在一定的毒性反应，其最适感染复数的确定相关研究较少。
目的：研究重组腺病毒在不同感染复数下其转染效率、细胞毒性及对骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响。
方法：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺毒载体分别以感染复数为0，50，100，150，200，250转染第5代骨髓间充质干细胞。转染24 h后观察细胞形态，锥虫蓝染色计数死亡率；转染48 h后荧光倒置显微镜下计算转染率，qPCR检测EGFP及Runx2基因表达量。MTT法评价不同感染复数转染对细胞活性的影响，确定最佳感染复数。
结果与结论：①随感染复数值增加，骨髓间充质干细胞贴壁能力减弱，部分细胞老化、死亡；②以感染复数值为0，50，100，150，200，250转染24 h，其细胞死亡率依次为5.80%，6.67%，7.95%，7.76%，10.35%，11.18%，死亡率与感染复数值成正相关；③当感染复数值为100时即可达到最大转染效率，但当感染复数增大至200时，细胞活性即受到影响；当感染复数达到250时，骨髓间充质干细胞成骨分化潜能受到影响；④通过上述结果可以认为，腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的感染复数安全范围为50-150，其最适感染复数为100。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4326-1433(武成聪)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 腺病毒, 感染复数, 细胞毒性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The recombinant adenovirus has certain toxic reactions to cell growth and survival, but the determination of the optimal multiplicity of infection (MOI) is not well documented.
OBJECTIVE: To study the effectiveness and toxicity of transfection of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by adenovirus vectors with different MOIs, and to explore the effect on osteogenic capability of the cells.
METHODS: BMSCs at passage 5 were infected with enhanced green fluorescent protein (EGFP) via adenovirus vectors with different MOI (0, 50, 100, 150, 200 and 250). Cell morphology and mortality rate were observed and calculated using trypan blue staining method at 24 hours after cell transfection. The transfection efficiency and the relative mRNA expression of EGFP and Runx2 were analyzed respectively by inverted florescent microscopy and real-time quantitative PCR at 48 hours after cell transfection. The activity of BMSCs transfected with different MOIs was evaluated by MTT, and the optimal MOI was determined thereafter.
RESULTS AND CONCLUSION: With the increase of MOI, BMSCs showed decreased adherent ability, and even some cells aged and died. The mortality rate of BMSCs transfected for 24 hours at a MOI of 0 to 250 was 5.80%, 6.67%, 7.95%, 7.76%, 10.35% and 11.18%, respectively, indicating that the mortality rate of BMSCs is positively correlated with the MOI. The transfection efficiency changed insignificantly when the MOI was greater than 100. On the contrary, the cellular viability and osteogenic differentiation capability of rabbit BMSCs were receded when the MOI level was up to 200-250. The study discovered that the suitable scope of MOI to transfect BMSCs is 50- 150, and the optimal MOI is 100.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Adenoviridae, Green Fluorescent Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

武成聪，荣树，任静，吴铮，刘涛，刘克廷，朱博，黄合飞，王芳. 腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2650-2655.

Wu Cheng-cong, Rong Shu, Ren Jing, Wu Zheng, Liu Tao, Liu Ke-ting, Zhu Bo, Huang He-fei, Wang Fang. Transferring adenovirus vector-mediated enhanced green fluorescent protein gene into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells: effectiveness and toxicity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2650-2655.

图/表（结果） 2

2.1 一般情况及死亡率 骨髓间充质干细胞复苏后生长状态良好，细胞饱满，呈梭形、漩涡状生长。第5代骨髓间充质干细胞转染后24 h，实验组培养基内杂质增多，随着感染复数值增加，部分细胞体积膨胀、变薄，贴壁能力降低，培养基内漂浮细胞增多(图1)。感染复数为0组的细胞死亡率为5.80%，感染复数为50，100，150组的细胞死亡率分别为6.67%，7.95%，7.76%，与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。感染复数为200，250组的细胞死亡率为10.35%，11.18%，较对照组增高(P < 0.05，图2)。

2.2 Ad-EGFP转染效率 倒置荧光显微镜下发现，转染后2 h各组即有少量荧光蛋白表达，相同感染复数下，随转染时间延长，荧光蛋白表达数量随之增加，转染24 h后替换为完全培养基，第48小时实验组细胞绿色荧光蛋白表达数量不再增加，保持稳定，荧光蛋白分布于细胞核及细胞质内。除对照组外，转染后48 h各组细胞均有绿色荧光蛋白表达，感染复数为50，100，150，200，250组的转染效率分别为62.4%，96.30%，95.72%，95.34%和96.15%。与对照组相比，腺病毒成功将EGFP基因转染进入骨髓间充质干细胞并表达增强绿色荧光蛋白，达到实验目的。而在实验组中，感染复数为50组转染效率明显低于其他各组(P < 0.01)。感染复数为100，150，200，250组转染效率并不随感染复数增加而增加，各组转染效率差异无显著性意义(P > 0.05，图3)。

2.3 Ad-EGFP转染后骨髓间充质干细胞活性 腺病毒感染后各组骨髓间充质干细胞并未出现大面积死亡，细胞继续分裂、增殖，但细胞感染腺病毒后其细胞生长受到了不同程度的影响，见图4。转染后72 h内各组细胞活性并未发生明显改变(P > 0.05)。第4天开始，感染复数为250组细胞出现吸光度降低，第5天感染复数为200，250组细胞生长状态与对照组相比均出现吸光度降低，提示细胞活性降低、死亡细胞增多。而感染复数为50，100，150组骨髓间充质干细胞活性并未受到明显影响。说明随感染复数的不断增加，骨髓间充质干细胞形态和活性受到的抑制作用越明显。

2.4 转染后骨髓间充质干细胞EGFP、Runx2基因表达 转染后48 h，实验组可见大量绿色荧光蛋白表达，扩增过程中未产生二聚体，转染后骨髓间充质干细胞中EGFP、Runx2基因相对表达量见表2。骨髓间充质干细胞表达大量EGFP基因，其中感染复数为50组荧光表达量明显少于其他实验组(P < 0.01)，随感染复数增加并达到感染复数为100时，EGFP基因表达量不再继续增加(P > 0.05)。相对于对照组，感染复数≤200时骨髓间充质干细胞Runx2基因表达能力无明显变化，即骨髓间充质干细胞成骨潜能无影响。而感染复数为250组Runx2基因表达量明显降低(P=0.009)，骨髓间充质干细胞成骨潜能受到明显影响。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 完全随机设计实验。

1.2 时间及地点实验于2016年10月至2017年5月在昆明医科大学附属曲靖医院中心实验室完成。

1.3 材料 兔骨髓间充质干细胞、腺病毒载体(Ad-EGFP)由桂林医学院附属医院急诊创伤科李强教授赠送；DMEM细胞培养基(Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；二甲基亚砜、四甲基偶氮唑蓝(北京艾德莱公司)；TRIzol REAGEN、HiFi-MMLV反转录cDNA合成试剂盒(上海Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒(天根生化公司)；SYBR Green^® PCR Master Mix (美国ABI公司)；RNASE-FREE ddH₂O(美国AMRESCO公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的复苏　第3代骨髓间充质干细胞参照前期实验复苏、培养^[5]，贴壁、传代至第5代进入后续研究。

1.4.2 Ad-EGFP转染兔骨髓间充质干细胞 第5代兔骨髓间充质干细胞生长达70%-80%融合时，消化、按细胞密度5×10⁴个/孔均匀接种于6孔板并编号，按抽签法随机分为6组，分别为对照组(感染复数为0)和实验组(感染复数为50，100，150，200，250)，每组3个复孔。骨髓间充质干细胞生长达60%-70%融合后，PBS全量换液。Ad-EGFP按感染复数为0，50，100，150，200，250混入体积分数为15%胎牛血清的完全培养基2 mL转染骨髓间充质干细胞，24 h后更换为完全培养基继续置37 ℃、体积分数为5%CO₂及饱和湿度孵育箱中培养。

1.4.3 Ad-EGFP转染骨髓间充质干细胞的死亡率 转染24 h收集各组细胞并制作为细胞悬液，锥虫蓝染色2 min，重悬，牛鲍氏计数板充池，白细胞计数区编号，由2名研究者在倒置显微镜下抽签选择3个方格，人工计数1个大方格内被染成淡蓝色的死细胞数和拒染的活细胞数并计算细胞死亡率。转染后骨髓间充质干细胞的死亡率=死亡细胞总数/视野内细胞总数×100%。

1.4.4 Ad-EGFP转染效率 转染后48 h倒置荧光显微镜下观察6孔板内骨髓间充质干细胞生长状态，9点法标记培养孔，抽签选择3点，2名研究者按蛇形计数200倍视野内EGFP表达细胞数及细胞总数计算转染率。转染效率(%)=绿色荧光蛋白细胞数/视野内细胞总数×100%。

1.4.5 MTT法检测转染后骨髓间充质干细胞活性 第5代骨髓间充质干细胞以1×10⁴个/孔接种96孔板并抽签法编组，每组设42个复孔。细胞贴壁后按上述分组转染骨髓间充质干细胞。各组每天取6孔，加入MTT溶液、二甲基亚砜振荡，酶标仪测定490 nm波长下吸光度值，重复7 d。每组各孔吸光度值代表其细胞活性。

1.4.6 Real-time PCR检测EGFP、Runx2基因表达 第5代骨髓间充质干细胞以5×10⁴个/孔接种于6孔板，每组3个复孔，转染后48 h收集骨髓间充质干细胞，Trizol法分离、提取总RNA，反转录为cDNA备用。设计EGFP(720 bp)、Runx2(157 bp)特异性PCR引物(表1)，以GAPDH(351 bp)作为内参照，引物合成由Invitrogen公司(上海)生物技术有限公司合成并通过质量检测。

利用SYBR GreenⅠ进行定量PCR扩增，PCR反应体系为：SYBR Green^® PCR Master Mix 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7 μL，按50 ℃ 2 min、95 ℃ 15 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40个循环进行PCR扩增，每个样本设3个复孔，PCR扩增结束后得到循环阈值(Ct值)，基因的表达水平采用2^-^??Ct进行分析。所有样品PCR反应结束后，均进行1次熔解曲线检测，2^-^??Ct=2^-[(Ct^目的基因^-^Ct^内参基因^)]^实验组^-^[(Ct^目的基因^-^Ct^内参基因^)]^对照组。

1.5 主要观察指标 转染后各组骨髓间充质干细胞的生长状态、死亡率、细胞活性、转染效率及其向成骨细胞分化的潜能。

1.6 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件分析，死亡率及转染率进行卡方检验；基因表达量及细胞吸光度值以x(_)±s表示，进行方差分析(ANOVA)对组间差异进行显著性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

基因转染技术是目前组织工程中新兴技术及常用技术，广泛应用于心血管系统、运动系统、神经系统等领域研究。其中进行基因修饰、转染的关键是基因载体，非病毒载体(质粒、脂质体等)因其转染效率不高、表达时间短且靶细胞局限等原因而较少运用^[6]。反转录病毒介导的基因转移技术只整合入增殖期的靶细胞，插入突变的可能性较大，仅限于应用于部分研究^[7]。慢病毒载体能够将自身RNA反转录后整合、插入至靶细胞染色体，能在体内长时间稳定表达^[8]，其存在基因突变、插入随机性风险。腺相关病毒可整合入人细胞基因组而存在导致肝癌风险^[9]。然而，腺病毒为线状双链DNA病毒，其基因组及其携带的外源基因不插入靶细胞的基因组中，可携带大量目的基因在宿主细胞内获得大量表达，避免潜在基因突变和随机效应^[10]。王晓旭等^[11]利用腺病毒载体介导转化生长因子β1基因转染兔自体前交叉韧带，术后发现转化生长因子β1基因产物可持续表达到术后第8周。由于临床损伤修复过程往往只需几周至几个月的阶段性治疗，基因工程技术通过转染目的基因使得多向分化潜能的骨髓间充质干细胞经过细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化最终发育成为骨细胞修复骨损伤。在修复骨缺损过程中往往不需要目的基因长期整合入宿主细胞基因组中而造成基因过表达，故实验选择腺病毒做为后续相关研究载体。

目前运用于基因工程的腺病毒载体主要由2型和5型构建，通过柯萨奇-腺病毒受体进入细胞^[12]，表达腺病毒结构蛋白，引发机体产生强烈的炎症反应或免疫反应^[13]。虽然目前腺病毒包装已由第1代发展到第3代，免疫反应严重程度已得到改善^[14]。但仍存在腺病毒毒性风险，其导致的免疫反应主要由炎性介质、中性粒细胞、CD11b⁺细胞等介导，细胞出现凋亡。而理想的转染载体必须满足高效率、低毒性、不影响分化潜能的要求。

为研究其转染效率及细胞毒性，实验借助EGFP示踪转染效果。EGFP报告基因具有良好的稳定性、易检测性，能在原核和真核细胞中表达^[15]。EGFP基因转染后对细胞生物学特性和增殖能力无明显影响，能在活细胞中直接观察而广泛应用于基因工程中^[16]，通过检测EGFP的表达，可以间接反映目的基因蛋白的表达情况^[17]。该研究中，转染后2 h荧光显微镜下即可观察到受蓝光激发产生的梭形、团块状绿色荧光，表明采用腺病毒转染目的基因成功。相同时间内，感染复数越大，转染效率越高。张琼宇等^[18]认为增加感染复数有利于腺病毒经胞吞作用进入T细胞使腺病毒感染效率提高。而研究认为腺病毒可能通过靶细胞膜上的表面肝素聚糖蛋白为受体介导转染，受体数目和功能有限^[19]。当感染复数为100时可达到转染率96.30%，即大部分骨髓间充质干细胞已全部转染成功，再增大转染复数已不再能够增加细胞的转染效率。

这种结果在后续qPCR实验中得到证实，通过计算目的基因的相对表达量(2^-^??Ct)，感染复数为100组的EGFP基因表达已达到最高值，与感染复数为250组相比，其EGFP基因的表达量并未增加。其原因可能是当病毒与受体结合达平衡时，已发挥最大生物效应，再增大病毒数量也不会提高转染效率。而且感染复数能显著影响细胞的生长代谢，感染复数值越高对细胞生长的抑制作用越强^[20]。该实验中，随感染复数的不断增加，骨髓间充质干细胞死亡率不断增加。与对照组相比，当感染复数≥200时，细胞死亡数量明显增加，说明当感染复数为100时即可达到转染最高效率，而没有必要盲目增加感染复数而促进转染。

从转染后骨髓间充质干细胞的生长状态、活性和其成骨分化信号通路中核心基因Runx2的表达也能说明该问题。MTT能被活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶还原为甲臜并沉积在细胞中，结晶形成量与活细胞数成正比的关系。该实验中，转染后4 d内，各组骨髓间充质干细胞吸光度持续增加，各组骨髓间充质干细胞活性并无明显区别。但第5天开始，高病毒浓度组(感染复数为200，250)出现了明显的细胞活性降低，通过光镜下观察，这种现象可能由于高浓度腺病毒转染时靶细胞老化、膨胀有关。高浓度的病毒载体可能对细胞的活性产生不良影响^[21]，研究认为营养物的消耗及代谢副产物的积累是影响细胞密度及产物产率的主要因素^[22]。Runx2参与调节成骨细胞分化及骨形成，被认为是成骨分化调控网络中的关键节点，参与组成该网络的各信号通路都直接或间接作用Runx2节点，并最终调控其下游靶基因的表达^[23]。已有研究证实腺病毒载体及EGFP基因对大鼠骨髓间充质干细胞形态及体外多向分化潜能无明显影响^[24]。该研究中发现，除感染复数为250组Runx2基因表达量下降外，余组未出现骨髓间充质干细胞成骨分化能力改变。感染复数为250组出现Runx2表达降低原因可能由于转染激发了某条信号通路导致Runx2节点发生改变，亦或因病毒引起细胞中毒、生长状态不佳所致，仍需要进一步研究。综上所述，腺病毒以不同感染复数转染兔骨髓间充质干细胞，其转染效果与感染复数值密切相关，感染复数值在100左右已能达到最大转染效率，随感染复数增大，将会影响兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化潜能，提示腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的感染复数安全范围为50-150，其最适感染复数为100，可作为后续研究的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性

Transferring adenovirus vector-mediated enhanced green fluorescent protein gene into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells: effectiveness and toxicity

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