17β-雌二醇联合淫羊藿苷促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0879

摘要/Abstract

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文题释义：
成骨分化观察指标的选择：骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程可分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化3个阶段。每个阶段的特征和生物标志有所不同。碱性磷酸酶是早期骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的生物标志物之一。在体外大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导第3天碱性磷酸酶就开始表达，并在7-9 d其表达量会逐渐减少。骨钙素是成熟成骨细胞合成的一种非胶原骨蛋白，具有高度特异性，只在基质矿化期开始以后其基因才开始表达，是成骨分化成熟的标志，可作为成骨细胞分化的中期指标。Ⅰ型胶原是矿化骨组织中惟一的胶原类型成骨细胞标志物，矿化结节能直接反映成骨细胞体外矿化的能力。
淫羊藿苷：是从中国传统中药淫羊藿中提取出来的黄酮类化合物，是淫羊藿的主要有效成分。大量研究证明，淫羊藿苷具有促进骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化，抑制破骨细胞分化成熟和抑制骨质疏松等作用。由于来源广泛，价格低廉以及毒副作用小等特点，淫羊藿苷在骨组织工程研究中的应用越来越广泛。

摘要
背景：以往研究表明，17β-雌二醇、淫羊藿苷均能够促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，二者联合应用的报道较少。
目的：观察17β-雌二醇联合淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的影响。
方法：运用全骨髓贴壁分离法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪进行骨髓间充质干细胞表面标志物(CD29，CD45，CD90)的鉴定。将培养细胞分为对照组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、联合诱导组，进行相应成骨诱导。各组细胞经成骨诱导 7，14，21 d后分别进行碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素浓度检测及茜素红染色观察钙结节形成量。
结果与结论：①17β-雌二醇联合淫羊藿苷作用下细胞成骨能力均增强；②成骨诱导7 d后，各组碱性磷酸酶活性均表达，联合诱导组>17β-雌二醇组>淫羊藿苷组>对照组；③成骨诱导14 d后，各组Ⅰ型胶原活性均表达，联合诱导组>17β-雌二醇组=淫羊藿苷组>对照组；④诱导21 d后，各组骨钙素均表达，联合诱导组>17β-雌二醇组>淫羊藿苷组>对照组；⑤茜素红染色镜下钙结节数量：联合诱导组> 17β-雌二醇组=淫羊藿苷组>对照组；⑥结果表明，17β-雌二醇联合淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨细胞方向分化，且具有协同作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7039-3415(杨燕兵)

关键词: 17β-雌二醇, 淫羊藿苷, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 碱性磷酸酶, Ⅰ型胶原, 骨钙素, 钙结节, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that 17β-estradiol and icariin can both promote the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), but their combined use is rarely reported.
OBJECTIVE: To observe the effects of 17β-estradiol combined with icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs.
METHODS: BMSCs were isolated and cultured by whole-bone marrow adherence separation. Surface markers (CD29, CD45, CD90) of BMSCs were identified by flow cytometry. Cultured cells were divided into control group, 17β-estradiol group, icariin group, combined induction group, followed by corresponding treatments. At 7, 14 and 21 days after osteogenic induction, alkaline phosphatase activity, levels of collagen type I and osteocalcin were detected, and alizarin red staining was performed to observe the formation of calcium nodules.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteogenic ability of BMSCs treated with 17β-estradiol combined with icariin was enhanced. After 7 days of osteogenic induction, the alkaline phosphatase activity was detected in all groups, and ranked as follows: combined induction group > 17β-estradiol group > icariin group > control group. After 14 days of osteogenic induction, the expression of collagen type I was observed in all groups and ranked as follows: combined induction group > 17β-estradiol group=icariin group > control group. After 21 days of osteogenic induction, osteocalcin was expressed in all groups and ranked as follows: induction group > 17β-estradiol group > icariin group > control group. The number of calcium nodules as determined by alizarin red staining was ranked as follows: induction group > 17β-estradiol group=icariin group > control group. Therefore, 17β-estradiol and Icariin have synergistic effects to induce BMSCs to differentiate into bone cells.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Epimedium, Estradiol, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨燕兵，靳宪辉，王海萍. 17β-雌二醇联合淫羊藿苷促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3299-3303.

Yang Yan-bing, Jin Xian-hui, Wang Hai-ping . 17Beta-estradiol combined with icariin promotes the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3299-3303.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态 镜下可见初分离的大鼠骨髓悬液细胞密集，12 h后细胞开始贴壁，部分细胞形态伸展、体积增大，贴附于瓶壁(图1A)，72 h可见部分细胞伸出突起，突起圆钝而光滑，细胞呈梭形、菱形或多边形，核大而饱满，外观似成纤维细胞样(图1B)。培养14 d后，细胞融合成片，分界变得较为模糊，胞体增大，形态则变为短梭形和不规则形，部分细胞聚集成灶(图1C)，培养21 d，诱导细胞部分出现散在的矿化结节，中心透光度较差(图1D)。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞鉴定结果 细胞表面抗原CD45阳性表达率为0.5%，细胞表面抗原CD29阳性表达率99.6%，细胞表面抗原CD90阳性表达率99.7%，其结果符合大鼠骨髓间充质干细胞特征(图2)。

2.3 碱性磷酸酶活性 诱导第7天细胞培养上清中碱性磷酸酶活性由高到低排序为：联合诱导组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、对照组，见表1。

2.4 Ⅰ型胶原蛋白相对浓度 诱导第14天，各组细胞培养上清Ⅰ型胶原蛋白相对浓度差异有显著性意义(P < 0.05)，且浓度由高到低顺序为：联合诱导组、17β-雌二醇组及淫羊藿苷组(差别无显著性意义)、对照组，见表1。

2.5 骨钙素相对浓度 诱导第21天，各组细胞培养上清骨钙素浓度由高到低排序为：联合诱导组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、对照组，见表1。

2.6 钙结节数量 诱导第21天，经茜素红钙结节染色后光镜下观察均为阳性(图3A-D)，且大小不一，分布不均匀，4组间钙结节数量差异有显著性意义。17β-雌二醇组和淫羊藿苷组差异无显著性意义，17β-雌二醇组和淫羊藿苷组的钙结节数量多于对照组，联合诱导组的钙结节数量多于17β-雌二醇组、淫羊藿苷组(P < 0.05)，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 材料

1.2.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠，3周龄，体质量40 g左右，由河北医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置均符合伦理学准则^[6]。

1.2.2 实验试剂 IMDM培养基(美国GIBCO公司)；胎牛血清(澳大利亚GIBCO公司)；大鼠骨钙素酶联免疫试剂盒(CUSABIO公司)；大鼠Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒(CUSABIO公司)；碱性磷酸酶测试盒(南京建成公司)；CD29-PE/CD45-FITC/CD90-PE-CyTM7(美国BD公司)；淫羊藿苷(Cayman公司)；雌激素(北京百灵威公司)；地塞米松(上海TCI公司)；β-甘油磷酸钠(Cayman公司)；L-抗坏血酸(上海TCI公司)；茜素红染剂(南京建成公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 骨髓间充质干细胞的原代分离、培养及传代 颈椎脱臼法处死大鼠，置于体积分数为75%乙醇中浸泡5 min后，无菌条件下分离出四肢的股骨及肱骨，并放入缓冲液(含青霉素-链霉素)中浸洗3次，去除长骨的骨骺端，用IMDM完全培养基反复冲洗骨髓腔，并将含骨髓细胞的培养基加入15 mL离心管中，室温离心，弃上清液，加入完全培养基，均匀接种于25 mL培养瓶，置入37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中，48 h后首次换液，弃除不贴壁的悬浮细胞，此后每48 h换液1次。待贴壁细胞长至80%-90%融合时，胰酶消化，以1∶2的比例传代，培养至第3代备用^[7]。

1.3.2 倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态学观察 每日于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态和形态变化并拍照记录。

1.3.3 流式细胞仪进行骨髓间充质干细胞的鉴定 取第4代骨髓间充质干细胞，先用PBS浸洗2遍然后用胰酶消化，镜下见细胞回缩后用IMDM完全培养基终止消化并吹打混匀，移至15 mL无菌离心管中，室温1 000 r/min离心7 min，弃上清后PBS浸洗1次，再次离心，细胞重悬并计数，使细胞浓度调整为1×10¹⁰L^-1分装至5支5 mL离心管中，每管200 μL，依次加入CD29-PE抗体25 μL，CD45-FITC抗体10 μL，CD90-PE-CyTM7抗体25 μL，CD29-PE抗体25 μL+ CD45-FITC抗体10 μL+CD90-PE-CyTM7抗体25 μL，阴性对照加入适量PBS，4 ℃避光孵育30 min后再次离心，弃上清液，PBS浸洗1次，各组等量加入500 μL PBS后使细胞悬浮。运用流式细胞仪技术鉴定骨髓间充质干细胞表面特定抗原的表达。

1.3.4 骨髓间充质干细胞体外诱导分化 取第4代骨髓间充质干细胞，消化后调整细胞浓度至1×10⁷ L^-1，接种于25 mL培养瓶中，将培养细胞分为对照组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、联合诱导组。培养24 h后进行定向诱导，对照组加入基础成骨诱导剂(地塞米松1×10^-8 mol/L、β-甘油磷酸钠1×10^-2 mol/L、抗坏血酸5×10^-2 g/L)，17β-雌二醇组加入基础成骨诱导剂和17β-雌二醇1×10^-9mol/L，淫羊藿苷组加入基础成骨诱导剂及淫羊藿苷1×10^-4mol/L，联合诱导组加入基础成骨诱导剂、17β-雌二醇1×10^-9 mol/L及淫羊藿苷1×10^-4 mol/L。持续诱导21 d，隔天半量换液，7 d传代1次。

1.3.5 碱性磷酸酶活性测定 将骨髓间充质干细胞以1×10⁷ L^-1细胞浓度接种到培养瓶中，按上述实验分组进行成骨诱导，各组细胞于成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶活性测定。吸取各组培养液上清，离心，取上清标本，按照碱性磷酸酶测试盒说明书操作，酶标仪在520 nm波长处测定各组样本的吸光度值。根据公式：碱性磷酸酶活性(金氏单位/100 mL)=(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)×酚标准品浓度×100 mL，计算出各组碱性磷酸酶相对活性。

1.3.6 大鼠Ⅰ型胶原蛋白浓度测定 将骨髓间充质干细胞以1×10⁷ L^-1细胞浓度接种到培养瓶中，按上述实验分组进行成骨诱导，各组细胞于成骨诱导第14天进行Ⅰ型胶原蛋白浓度测定。吸取各组培养液上清，离心，取上清标本，按照大鼠Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒说明，对样品进行稀释，等比调节各组样品质量浓度为7.8-500 ng/L，之后按照说明书操作，并用酶标仪在450 nm波长处测定各组样本的吸光度值。利用Curve Expert 1.3软件，以标准品浓度为纵坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。根据样本吸光度值及标准曲线计算出各样本相应的浓度。

1.3.7 大鼠骨钙素浓度测定 将骨髓间充质干细胞以1×10⁷L^-1细胞浓度接种到培养瓶中，按上述实验分组进行成骨诱导，各组细胞于成骨诱导第21天进行骨钙素浓度测定。吸取各组培养液上清，离心，取上清标本，按照大鼠骨钙素酶联免疫试剂盒说明，对样品进行稀释，等比调节各组样品质量浓度为0.312-20 ng/L，之后按照说明书操作，并用酶标仪在450 nm波长处测定各组样本的吸光度值。利用Curve Expert 1.3软件，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。根据样本吸光度值及标准曲线计算出各样本相应的浓度。

1.3.8 茜素红钙结节染色 将骨髓间充质干细胞以1× 10⁷ L^-1细胞浓度接种到培养瓶中，按上述实验分组进行成骨诱导，各组细胞分别于成骨诱导第21天进行茜素红钙结节染色。PBS漂洗3遍后，体积分数为95%乙醇固定15 min，0.1%茜素红染色10 min，蒸馏水冲洗，干燥，封固，光学显微镜观察拍照。

1.4 统计学分析 运用SPSS 19.0统计软件进行处理。计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P < 0.05差异有显著性意义。

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讨论

因创伤、肿瘤、骨质疏松等造成的骨不连、骨缺损等一直是骨科医师需要解决的难题，骨组织工程学的长足发展有望在未来攻克这一问题。任何组织工程骨构建均由种子细胞、培养环境与支架材料组成。骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类干细胞，其在体外具有多方向分化潜能，存在于骨髓内并具有明显贴壁能力，可分化为成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种细胞，其在骨代谢调节中起着较为关键的作用^[8]。机体增加骨量和维持骨量的细胞来源主要为骨髓间充质干细胞分化成的成骨细胞，是人体骨骼维持健康的重要因素^[9-17]。骨髓间充质干细胞比较容易获得，体外扩增后仍无免疫原性，且易转染外源性基因并能长期传代表达^[18-19]。另外，应用骨髓间充质干细胞进行自体移植实验和治疗时几乎不受伦理学限制。体外骨髓间充质干细胞的增殖分化可以受多因素的准确调控，因此它一直被视为移植实验和治疗首选的干细胞。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程可分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化3个阶段^[20]。不同生物标志物可以代表不同的骨分化阶段。碱性磷酸酶是早期骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的生物标志物之一。在体外大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导第3天碱性磷酸酶就开始表达，并在7-9 d其表达量会逐渐减少。Ⅰ型胶原是矿化骨组织中惟一的胶原类型成骨细胞标志物，这为进行成骨细胞的鉴定提供了依据。

第4代骨髓间充质干细胞分为4组，分别为对照组、17β-雌二醇组、淫羊藿苷组、联合诱导组。对照组加入基础成骨诱导剂(地塞米松1×10^-8 mol/L、β-甘油磷酸钠1×10^-2 mol/L、抗坏血酸5×10^-2 g/L)，17β-雌二醇组加入基础成骨诱导剂和17β-雌二醇1×10^-9 mol/L，淫羊藿苷组加入基础成骨诱导剂及淫羊藿苷1×10^-4 mol/L，联合诱导组加入基础成骨诱导剂、17β-雌二醇1×10^-9 mol/L及淫羊藿苷1×10^-4mol/L，持续诱导21 d。实验结果显示，17β-雌二醇及淫羊藿苷都可以增强大鼠骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的能力，且联合用药明显优于单独用药。

由于实验局限于细胞水平研究，雌激素及淫羊藿苷在体内的作用可能会受到多种因素的影响，且可能会对机体产生多种不良反应。两种药物联合对大鼠骨髓间充质干细胞的作用机制有待于从分子水平进一步研究，以便为临床中西药物联合治疗骨质疏松等疾病提供理论依据，从而能够为临床用药提供指导。

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