3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0868

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (18): 2813-2819.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0868

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3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损

杜国庆，孙健，李亚莉，陈立强，陈晨，邓楠，吴雨桐，李莉，王志浩

青岛大学附属医院口腔颌面外科，青岛大学口腔数字医学与3D打印工程实验室，山东省青岛市 266003

收稿日期:2018-01-15 出版日期:2018-06-28 发布日期:2018-06-28
通讯作者: 孙健，博士，教授，主任医师，硕士生导师，青岛大学附属医院口腔颌面外科，青岛大学口腔数字医学与3D打印工程实验室，山东省青岛市 266003
作者简介:杜国庆，男，1990年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学口腔医学院在读硕士，主要从事正颌外科与组织工程骨方面的研究。
基金资助:
山东省科技发展计划(2014GSF118108)

Reconstruction of mandibular defects with tissue-engineered bone using 3D bionic printing technology

Du Guo-qing, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Chen Chen, Deng Nan, Wu Yu-tong, Li Li, Wang Zhi-hao

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Laboratory of Oral Digital Medicine and 3D Printing Engineering, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2018-01-15 Online:2018-06-28 Published:2018-06-28
Contact: Sun Jian, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Laboratory of Oral Digital Medicine and 3D Printing Engineering, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Du Guo-qing, Master candidate, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Laboratory of Oral Digital Medicine and 3D Printing Engineering, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Development Plan of Shandong Province, No. 2014GSF118108

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

3D仿生打印：3D仿生打印机可调控打印仓内温度等相关参数来维持仓内细胞及生长因子的活性。在3D仿生打印机A桶、B桶同期喷涂支架材料与细胞生长因子，使细胞生长因子在支架材料内部装载充分且分布均匀。这种同期体外一体化的修复体构建方式，可通过对打印喷头推料速度的精确调控，满足修复体对各种打印原材料各组分不同配比的要求。在本实验中，通过计算机辅助编程设计，制造出13 mm×6 mm×4 mm骨修复体，达到个性化可控定制的需求。

人重组骨形态发生蛋白2纳米壳聚糖缓释微球复合体：实验利用壳聚糖对人重组骨形态发生蛋白2进行包裹，并组装成纳米级缓释微球系统，采用壳聚糖制备温和多孔水凝胶，将负载人重组骨形态发生蛋白2的纳米级壳聚糖缓释微球包裹入水凝胶内，对人重组骨形态发生蛋白2进行二次控释，形成负载人重组骨形态发生蛋白2纳米壳聚糖缓释微球复合体。这种人重组骨形态发生蛋白2控释方式接近体内生理状态下的缓慢释放过程。

背景：体外实验证实，3D仿生打印聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(polylactic-co-glycolicacid/ nano-hydroxyapatite，PLGA/nHA)支架负载人重组骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球缓释载体组织工程骨支架具有良好的生物学、机械性能及控释人重组骨形态发生蛋白2的生物活性。

目的：进一步观察3D仿生打印PLGA/nHA负载人重组骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球缓释载体组织工程骨支架修复兔下颌骨缺损的效果。

方法：取27只新西兰大白兔，制作双侧下颌骨缺损模型，一侧植入3D仿生打印PLGA/nHA负载人重组骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球缓释载体的组织工程骨支架(实验组)，另一侧植入3D打印PLGA/nHA组织工程骨支架(对照组)。植入后30，60，90 d，取材下颌骨标本行大体观察、Micro CT、锥体束CT、组织学及免疫组织化学检查。

结果与结论：①Micro CT检测：实验组植入后不同时间点的新生骨组织体积、骨小梁相对数目较对照组高 (P < 0.05)，骨小梁分离度较对照组低(P < 0.05)；②锥体束CT检测：植入后90 d，实验组骨缺损区密度接近周围骨质，新生骨充满原骨缺损区，骨小梁排列较规则；对照组骨缺损区可见虫蚀样不连续低密度类骨样成骨，成骨效果不及实验组；③组织学观察：植入后90 d，实验组成骨区见大片成熟板层状骨，骨小梁排列规则、毛细血管丰富，支架材料已被完全吸收；对照组为低密度、疏松网格状、不规则编织状骨，少见毛细血管，支架材料大部分被吸收；④免疫组织化学观察：植入后90 d，实验组骨钙素染色面积明显大于对照侧；⑤结果表明：3D仿生打印PLGA/nHA负载人重组骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米微球缓释载体组织工程骨支架可满足兔实验性下颌骨缺损的修复重建。

ORCID: 0000-0002-0182-9203(杜国庆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D仿生打印, 壳聚糖纳米缓释系统, PLGA/nHA, 组织工程骨, 下颌骨缺损, 山东省科技发展计划, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: The 3D printed polylactic-co-glycolicacid/nano-hydroxyapatite (PLGA/nHA) scaffold carrying human recombinant bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2)/chitosan (CS) sustained release tissue-engineering bone has good biological activity, mechanical properties, and biological activity of its controlled release rhBMP-2.

OBJECTIVE: To investigate the repair of mandibular defects with PLGA/nHA scaffold/rhBMP-2/CS sustained release tissue-engineering bone manufactured using 3D bionic printing technology.

METHODS: Animal models of bilateral critical mandibular bone defects were established in 27 New Zealand white rabbits, followed by implantation of a 3D-printed PLGA/nHA scaffold/rhBMP-2/CS sustained release tissue-engineering bone on one side (experimental side), and a 3D-printed PLGA/nHA scaffold on the other side (control side). Mandibular specimens were harvested at postoperative days 30, 60 and 90 to carry out cone-beam CT, Micro CT, histological and immunohistochemical examinations.

RESULTS AND CONCLUSION: The results from micro-CT analysis revealed that the volume of newly formed bone volume and the amount of bone trabeculae on the experimental side were significantly higher than those on the control side at different postoperative time points

(P < 0.05). The results from cone-beam CT examination showed that at 90 postoperative days, bone density of the bone defect on the experimental side was close to that of the surrounding bone, new bone tissues were full of the original bone defect area, and the trabecular bone arranged regularly, while on the control side, worm-eaten discontinuous low-density osteoid tissues were visible in the bone defect area. Osteogenesis on the experimental side was better than that on the control side. Histological findings demonstrated that on the experimental side, a large amount of mature lamellae were detected in the bone defect area, with well-arranged trabecular bones and abundant capillaries, and moreover, the scaffold material had been completely absorbed. However, low-density, loose-meshed, irregular braided bone tissues with rare capillaries were observed on the control side, and the scaffold material had been mostly absorbed. Immunohistochemical findings indicated that the osteocalcin-dyed area on the experimental side was significantly larger than that of the control side at postoperative 90 days. To conclude, 3D-printed PLGA/nHA scaffold/rhBMP-2/CS sustained release tissue-engineering bone is favorable for the repair and reconstruction of experimental mandibular defects in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Mandible, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杜国庆，孙健，李亚莉，陈立强，陈晨，邓楠，吴雨桐，李莉，王志浩. 3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(18): 2813-2819.

Du Guo-qing, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Chen Chen, Deng Nan, Wu Yu-tong, Li Li, Wang Zhi-hao . Reconstruction of mandibular defects with tissue-engineered bone using 3D bionic printing technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(18): 2813-2819.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 27只新西兰大白兔均进入结果分析。

2.2 一般情况观察术后4 d，实验兔术区肿胀，皮温稍高，未见明显渗血渗液，术后7 d切口一期愈合。

2.3 下颌骨锥体束CT三维重建结果见图2。

实验组：植入后30 d，骨缺损区呈稀薄云雾状，未见明显钙化新骨生成；植入后60 d，骨缺损区密度较前增高，能观察到不同密度的钙化新骨生成；植入后90 d，骨缺损区密度接近周围骨质，新生骨充满原骨缺损区，骨小梁排列较规则。

对照组：植入后30 d，骨缺损区呈现低密度透光区；植入后60 d，缺损区边缘见少量不规则新骨生成，骨缺损中央区未见骨质形成；植入后90 d，骨缺损区可见虫蚀样不连续低密度类骨样成骨，其成骨效果与实验组比差异明显。

2.4 Micro CT骨组织微结构检测结果通过图像分析系统软件对标本进行形态计量学分析得出，同一时间点实验组新生骨体积比、骨小梁厚度、骨小梁数目均大于对照组(P < 0.05)，骨小梁离散度小于对照组(P < 0.05)，见表1-3。

随着时间的推移，实验组新生骨体积比(F=38 584.165，P=0)、骨小梁厚度(F=83.045，P=0)、骨小梁数目(F=20.916，P=0.002)逐渐增加，骨小梁离散度(F=131.045，P=0)逐渐减小。随着时间的推移，对照组新生骨体积比(F=14384.410，P=0)、骨小梁厚度(F=183.676，P=0)、骨小梁数目(F=7.568，P=0.023)逐渐增加，骨小梁离散度(F=27.554，P=0.001)逐渐减小，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5.1 苏木精-伊红染色植入后30 d，实验组成骨区见少量骨细胞及新生低密度类骨质形成，支架材料开始吸收；对照组未见明显变化。植入后60 d，实验组成骨区骨细胞成骨活跃，可见较规则排列骨小梁形成及较多新生毛细血管，支架材料未完全吸收；对照组见少量低密度、疏松、不规则骨小梁形成，少量骨细胞散落其中，网格状支架材料轮廓依旧清晰。植入后90 d，实验组成骨区见大片成熟板层状骨，骨小梁排列规则、毛细血管丰富，支架材料已被完全吸收，见图3A；对照组见低密度、疏松网格状、不规则编织状骨，少见毛细血管，支架材料大部分被吸收，见图3B。

2.5.2 Masson三色染色 Masson三染在染色试剂及染色顺序一定的情况下，最终着色的颜色取决于于骨组织的成分^[18-19]，骨组织中主要存在Ⅰ型胶原，其成熟度直接影响Masson染色的结果，成熟骨Masson染色其胶原被染成鲜红色，在新生骨向成熟的过度中为红-蓝相间着色，由此可用Masson染色来衡量骨的成熟度，新生骨质多呈蓝染红染少，成熟骨多呈红染蓝染少^[20] 。

植入后30 d，实验组成骨区截骨线边缘见少量蓝染新生骨形成，着色较浅，支架材料开始降解；对照组未见明显改变。植入后60 d，实验组蓝染新生骨增多，开始出现红染成熟骨，支架材料被大部分降解；对照组仅见少量类骨质或未成熟骨结构，未见成熟骨，支架材料开始降解。植入后90 d，实验组骨缺损区支架材料被大量红染成熟板层骨代替，其间夹杂蓝染成熟新生骨，见图4A；对照组材料大部分降解，见少量稀疏蓝染新生骨，呈不规则疏松网格状排列，未见明显红染成熟骨形成，见图4B。

2.6 植入后不同时间点实验组与对照组成骨区免疫组织化学检测结果植入后30 d，实验组骨缺损区可见微量骨钙素被染成棕褐色，染色区域呈斑点样分布；对照组骨缺损区未见明显染色变化。植入后60 d，实验组骨缺损区可见骨钙素明显增多，染色区域呈条索样棕褐色斑块分布；对照组见少量点状棕褐色骨钙素形成。植入后90 d，实验组可见棕褐色连接成片，其骨钙素染色面积明显大于对照组，见图5。

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引言

颌骨缺损的修复重建研究从骨移植、骨代用材料的植入、牵引成骨、到骨组织工程和基因治疗，经历了密切关联、相互并存的发展过程^[1-3]。随着对组织工程细胞支架材料、成骨相关细胞生长因子及其缓释技术的深入研究^[4-7]，探索采用组织工程骨手段修复重建各种类型的颌骨缺损，有可能是解决骨供给来源的最佳方法。

目前构建组织工程骨较多采用的方式是支架材料+种子细胞+细胞因子^[8-9]，但采用这种方式制备的组织工程骨支架无法达到快速的个性化定制，种子细胞的提取与培养过程繁琐，周期长，在很大程度上制约着个体化、实用型组织工程骨的构建。采用支架材料负载细胞因子的方法构建组织工程骨，由于不受细胞培养因素的限制，可以进行快速个体化构建和建立骨库。大量基础实验已证明，人重组骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)等成骨生长因子根据其释放浓度的不同，具有正、负反馈调节成骨作用的特点^[10-12]，因此如何进行细胞生长因子的仿生调控是细胞生长因子能否促进成骨的关键，也是构建组织工程骨亟待解决的问题。将3D打印技术应用于组织工程骨构建，采用计算机辅助设计、个体化定制，可为今后进行快速设计和构建实用型组织工程骨进行有意义的探索和经验积累。

实验采用3D仿生打印技术将聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(polylactic-co-glycolicacid/nano-hydroxyapatite，PLGA/nHA)支架材料、rhBMP-2细胞因子缓释微球系统构建成三维多孔组织工程骨支架复合体，将支架复合体植入实验动物下颌骨缺损区，研究其通过“壳聚糖纳米微球细胞生长因子缓释系统”诱导骨髓间充质细胞分化为成骨细胞，继而形成新骨的过程和机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计自身对比动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年3至12月在青岛大学材料学院中心试验室、青岛大学附属医院动物实验中心、青岛大学附属医院病理科完成。

1.3 材料

实验动物：8-10月龄健康新西兰大白兔27只，由青岛大任富城畜牧有限公司提供，动物许可证号：SCXK(鲁) 2008002，雌雄不拘，体质量3.0-3.4 kg。所有动物均独立笼养，自由进食，观察2周后将其用于实验。

实验材料、试剂与仪器：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(济南贷罡生物有限公司)，其中丙交酯、乙交酯比例为75∶25；纳米级羟基磷灰石(美国sigma公司)，直径<200 nm；壳聚糖(上海蓝季科技发展有限公司)，其脱乙酰度>90.0%；rhBMP-2(美国Peprotech公司)；鼠抗兔骨钙素(北京博奥森公司)；山羊抗鼠IgG/HRP (北京中杉)；1，4-二氧六环溶液(上海源叶生物有限公司)；3D生物打印机Organisms 2500X(青岛尤尼科技有限公司)；齿科打磨机(韩国 STRONG90)。

1.4 实验方法

1.4.1 rhBMP-2纳米球及rhBMP-2缓释复合体的制备配置壳聚糖乙酸溶液2.5 g/L，调节pH值至5.5，将100 μg/L的rhBMP-2加入壳聚糖乙酸溶液中，将质量浓度为1 g/L的三聚磷酸钠溶液逐滴加入rhBMP-2壳聚糖溶液中，置于低温离心机内(4 ℃)，13 000 r/min离心40 min，即得负载rhBMP-2的壳聚糖纳米球；以β-甘油磷酸钠(560 g/L)作为交联剂，在20 g/L壳聚糖乙酸溶液中加入20 mg rhBMP-2壳聚糖纳米球并震荡溶解，将560 g/L β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加入混合液中，放入37 ℃恒温水浴锅内15 min，完成rhBMP-2缓释系统的制备。

1.4.2 3D打印PLGA/nHA组织工程骨支架称取5 g聚乳酸-羟基乙酸共聚物粉剂及1.25 g羟基磷灰石粉剂，按质量4∶1比例加入40 mL的1，4-二氧六环溶液当中，室温下磁力搅拌(500 r/min)16 h至完全溶解，混合液于-20 ℃冰箱中冷冻24 h，冻好的聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羟基磷灰石材料放入冷干机内冻干14 h，使1，4-二氧六环有机溶剂彻底蒸发，最终得到PLGA/nHA材料，将剪碎后的冻干材料放入3D仿生打印机A墨盒中，经计算机辅助设计成13 mm× 6 mm×4 mm长方体^[13-16]，3D仿生打印机使用直径250 µm喷头，行走速度为4 mm/min，层厚为200 µm，其按预设参数将熔融材料后在三维方向分别喷涂成形，3D打印PLGA/nHA组织工程骨支架制作完成。

1.4.3 3D打印PLGA/nHA负载rhBMP-2缓释微球组织工程骨支架按聚乳酸-羟基乙酸共聚物∶纳米羟基磷灰石按质量4∶1加入1，4-二氧六环溶液中，37 ℃搅拌溶解后冻干。将冻干材料装入3D生物打印机A桶内，并将温度调整至130 ℃，将PLGA/nHA冻干材料熔融。将rhBMP-2纳米微球缓释系统装入温度为4 ℃的B桶，保持B桶内温度。3D生物打印机采用机械式直推，打印喷头直径300 µm，层厚200 μm，推料速度2.7 mm/s，打印速度4 mm/min。复合体经电脑辅助设计成13 mm×6 mm×4 mm多孔结构长方体，其按预设指数在4 ℃低温超净台内逐层打印成形，制得PLGA/nHA负载rhBMP-2细胞因子缓释微球复合体组织工程骨支架。

1.4.4 实验动物分组取27只新西兰大白兔，于双侧下颌骨下缘制备13 mm×6 mm×4 mm的实验骨缺损区。右侧(实验组)骨缺损区植入3D仿生打印PLGA/nHA负载rhBMP-2壳聚糖纳米缓释载体组织工程骨支架；左侧(对照组)植入3D打印PLGA/nHA组织工程骨支架，实验过程中对动物处理符合动物伦理学要求^[17]。

1.4.5 建立下颌骨缺损动物模型及分组干预于兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠1 mL/kg行全身麻醉，常规备皮、消毒、铺单。2%利多卡因局部浸润麻醉，沿下颌体部下缘作平行切口，长度为2.5-3.0 cm，暴露范围前至下颌骨正中联合部，后至咬肌前缘。采用齿科打磨机以裂钻低速下制作13 mm×6 mm×4 mm的矩形全层骨缺损，不破坏骨连续性，同时去除颌骨缺损区骨膜。术中生理盐水降温，保留涉及的部分牙根及下牙槽血管神经束。生理盐水彻底冲洗创面，检查无出血点后，右侧植入3D打印PLGA/nHA支架负载rhBMP-2壳聚糖纳米缓释载体的组织工程骨，左侧植入3D打印PLGA/nHA组织工程骨(图1)。1号丝线分层缝合肌肉、皮下组织及皮肤关闭切口，术中注意保暖。

待动物苏醒后送回笼中。术后1 d起肌注青霉素钠10×10⁴ U，2次/d，连续7 d，每日创口换药，预防感染。密切观察其精神状态及活动状况。手术伤口不需要拆线，任其自行脱落。

1.5 主要观察指标

一般情况：术后观察动物的精神、饮食、活动及伤口愈合情况。

锥体束CT和Micro CT检测：植入后第30，60，90天分别随机处死3只兔，于组织工程骨成骨区外5 mm取材，拍摄锥体束CT及Micro CT，行下颌骨三维重建及成骨指标分析。

组织学观察：植入后第30，60，90天分别随机处死6只兔，于组织工程骨成骨区外5 mm取材，置于100 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h。常规脱钙、石蜡包埋，切片(纵切厚度3 μm)，行苏木精-伊红及Masson三染，200倍光学显微镜下观察两组成骨细胞、血管、新生骨组织生长情况。

免疫组织化学染色：检查按下述步骤进行免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡至水，孵育，抗原修复，山羊血清封闭加一抗鼠抗兔骨钙素，加二抗山羊抗鼠IgG/HRP，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，镜检两组中骨钙素形成情况。

1.6 统计学分析实验所得数据以x(_)±s表示，使用SPSS 22.0统计学分析软件对实验所得数据进行分析，实验组与对照组同一时间点行配对资料的t 检验；相同区组不同时间点间检测方法为单因素方差分析，再行两两比较的LSD-t 检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 组织工程骨生物学性能及物理学性能聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖、羟基磷灰石等组织工程骨构建材料，在此次研究以往的体外实验中均已被证实具有良好的生物相容性及可控降解性^[21-23]。此次实验采取体内研究的方法，将3D仿生打印组织工程骨植入实验性兔下颌骨缺损区，通过实验标本大体观察发现：实验组及对照组术后在一定时间内切口均未出现感染，实验成骨区均有新生骨组织生成。组织学观察发现：植入后30 d时，实验组支架材料开始初步降解，植入后90 d时，实验组支架材料已诱导出较成熟骨组织修复骨缺损区；与实验组同一时间点相比，对照组支架材料虽降解速度缓慢，但在植入后90 d时支架材料已大范围降解，且有部分不规则幼稚骨组织长入。以上结果均表明负载rhBMP-2缓释载体系统的组织工程骨支架，在体内表现出了较好的诱导成骨性能。在此基础上，实验通过计算机辅助设计，采用3D打印技术制备负载rhBMP-2缓释载体系统的PLGA/nHA组织工程骨支架，对组织工程骨支架的物理结构做到了可控设计和制作，经检测其平均孔径为(431.31±18.40) μm，孔隙率为(73.64±1.82)%，抗压缩强度达(4.86±0.43) MPa，外形形态规整可个体化定制，支架材料孔隙均匀且相互连通，为其作为组织工程骨支架奠定了基础^[16^，^24-25]。

3.2 rhBMP-2纳米复合体的缓释效果 rhBMP-2与骨的生长、修复重建过程密不可分，其长效、稳定释放是提高组织工程骨的成骨质量和效率的有效方法之一^[26-29]。此次实验利用壳聚糖制作包裹rhBMP-2的纳米球缓释体，同时利用壳聚糖制作温敏性微孔水凝胶，将负载生长因子的纳米球采用一次成形包裹入水凝胶内，利用水凝胶对纳米球进行第二步控释，形成rhBMP-2缓释复合体，使其得到长期稳定缓慢的释放。此次实验骨缺损区术后CT三维重建发现，同一时间点两侧相比，实验侧骨缺损区成骨质量和数量明显优于对照侧；不同时间点同侧相比，实验侧新生骨量随时间递增而增加。以上结果表明，rhBMP-2在壳聚糖纳米微球及水凝胶的双重包裹下，在体内可达到仿生缓释的效果，该控释方法模拟了体内生理状态下生长因子的释放过程，最大限度地发挥外源性细胞生长因子的作用效能^[30-33]，达到了构建组织工程骨rhBMP-2仿生控释的要求。

3.3 骨缺损的修复及其效果此次实验采用Micro CT对植入后不同时间点兔实验性下颌骨缺损区进行扫描数据重建及处理，诱导成骨区新生骨组织的微结构显示，同一时间点，实验组新生骨体积比、骨小梁厚度、骨小梁数目大于对照侧，骨小梁离散度小于对照组(P < 0.05)，这表明同一时间点实验组骨小梁排列较对照组更为规则、致密，骨缺损修复重建效果优于对照组。实验组新生骨骨体积比、骨小梁厚度、骨小梁数目随时间推移递增，骨小梁离散度随时间推移减小，对照组参数变化与实验组相同，且差异有显著性意义(P < 0.05)。同时骨钙素免疫组织化学检测显示，同一时间点与对照组相比，实验组棕褐色染色面积较大；不同时间点同侧相比，染色面积逐步扩大，骨钙素沉积增多。这表明采用3D仿生打印负载rhBMP-2缓释载体系统的组织工程骨支架，其骨缺损修复重建是一个递进的过程，骨缺损区的新骨形成随着时间的递增而逐渐接近周围正常骨组织。这也证实了负载rhBMP-2纳米微球缓释系统在体内诱导成骨过程中，其缓释结构设计能够可靠地保持rhBMP-2发挥稳定的生物活性和仿生缓释。

另一方面，组织工程骨支架植入体内后必须能够建立满足其成骨需要的血供，为成骨潜能细胞功能活动提供充足的养分，只有这样才能保证有效的诱导成骨，最终达到骨修复重建的目的^[34]。组织工程骨支架在体内诱导成骨过程中，其支架物理结构是否利于成骨潜能细胞攀附、降解速度与成骨速度的匹配程度及支架材料降解产物对构建成骨微环境影响等各方面，均是影响体内诱导成骨成功血管化的关键。此次实验通过组织学观察可见，除成骨结果与Micro CT分析所得参数表达结果相一致外，植入后60 d，苏木精-伊红及Masson染色便发现实验组有新生毛细血管生成，90 d时毛细血管显著增多，与之相比，对照组在植入后90 d时才见毛细血管生成。这表明相同时间点除成骨效果外，实验组成骨区血管化能力同样优于对照组，这与3D打印负载rhBMP-2纳米微球缓释仿生组织工程骨支架在体内所提供的仿生成骨微环境密不可分。

综上所述，实验以壳聚糖纳米微球缓释系统作为rhBMP-2载体，通过计算机辅助设计，3D仿生打印将其复合于PLGA/nHA支架上，进行组织工程骨支架-rhBMP-2缓释复合体的一体化及个性化构建。构建的组织工程骨支架植入宿主体内后，rhBMP-2能模拟生物体内释放过程，诱导骨缺损区的新骨形成和重建修复。实验结果表明，3D打印负载rhBMP-2纳米微球缓释仿生组织工程骨支架的成骨活性及体内降解性能，明显优于3D打印单纯PLGA/nHA组织工程骨支架，可满足实验性兔下颌骨缺损的修复重建，其新生骨组织的组织结构接近周围正常骨组织。“rhBMP-2缓释系统复合体+组织工程骨支架”的3D仿生一体化打印显著提高了组织工程骨的成骨效果及质量，为今后组织工程骨商业化生产及储存提供了实验依据。后续的实验研究将设计搭载多种细胞生长因子的缓释载体系统，以及研究其最佳成骨配比方案和输送方式，探索其最佳时效、量效关系和组织工程骨支架的成骨调控机制，进一步提高组织工程骨支架的诱导成骨效率和效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损

Reconstruction of mandibular defects with tissue-engineered bone using 3D bionic printing technology

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