四种基因位点多态性与运动员耐力表型的关联

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0863

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
基因位点：基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点。基因位数很多，而染色体的数目较少，因而一条染色体上含有许多基因。基因在染色体上呈单行直线排列。
α-辅肌动蛋白3基因：是存在于肌原纤维内的一种基因，其作用是合成α-辅肌动蛋白3，固定不同的肌动蛋白。运动员在运动训练中骨骼肌α-肌动蛋白的mRNA水平提高，另外在运动恢复过程中骨骼肌α-肌动蛋白基因的表达具有时效性。α-辅肌动蛋白3基因定位于人染色体11q13-q14。上下肢骨骼肌中有α-辅肌动蛋白3基因表达，但是在脑组织中表达量较低。

摘要
背景：研究表明至少有155个DNA位点多态性都与精英运动员的运动能力表型例如速度和耐力、肌肉力量等有关。
目的：分析辅肌动蛋白3(ACTN3)基因、核呼吸因子2(NRF2)基因、β2肾上腺素能受体(ADRB2)基因及过氧化物酶体增殖受体γ共激活剂(PPARGC1A)基因4个基因位点多态性与赛艇运动员有氧能力表型关联及其相互效应，为探讨基因多态性位点作用于耐力表型的机制提供依据。
方法：应用Case-Control实验设计，分析4个基因多态性位点在15名优秀赛艇运动员和50名普通大学新生对照组中的分布特征。运用基因型累加分值分析4个基因位点多态性与赛艇运动员有氧能力表型指标的关联。
结果与结论：运动员组的辅肌动蛋白3基因、过氧物酶体受体γ共激活剂基因及核呼吸因子2基因位点耐力表现优势基因位点频率均高于对照组，且核呼吸因子2基因位点运动员组与对照组间有显著性差异。3组不同基因型总分运动员组的最大摄氧量均值之间有显著性差异。因此推论研究中3个基因位点多态性可能是预测优秀耐力运动员运动表型的分子标记，作用机制需要进一步验证探讨。

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ORCID: 0000-0002-3723-9467(魏琦)

关键词: 基因多态性, 赛艇, 辅肌动蛋白3基因, β2肾上腺素能受体基因, 过氧化物酶体增殖受体γ共激活剂基因, 组织构建, 核呼吸因子2基因, 耐力表型, 最大摄氧量, ACTN3, NRF2, ADRB2；PPARGC1A

Abstract:

BACKGROUND: Increasing evidence shows that at least 155 genetic polymorphisms are associated with aerobic performance and elite endurance athlete status.
OBJECTIVE: To study the association of α-actin 3 (ACTN3) gene, nuclear respiratory factor 2 (NRF2), β2 adrenergic receptor (ADRB2) gene and peroxisome proliferative activated receptor gamma coactivator 1 alpha(PPARGC1A) polymorphic loci with aerobic performance of rowing athletes and their interaction effect, thereby providing basis for understanding the mechanism of genetic polymorphisms acting on endurance athlete status.
METHODS: A case-control experiment was designed to analyze the distribution characteristics of four gene polymorphism loci in 15 excellent rowing athletes and 50 common college freshmen. The association of four polymorphic loci with the aerobic performance-related indexes was analyzed using total genotype scores.
RESULTS AND CONCLUSION: The preponderant polymorphism locus distributions of ACTN3, PPARGC1A and NRF2 in the athletes group were higher than those in the control group, and the NRF2 gene loci showed significant difference between two groups. In the athletes group, the mean values of VO2 max was significantly different among three genotypes. That is to say, these three genetic polymorphisms may be the biomarkers to predict the elite endurance athlete status, but the mechanism needs to be studied in depth.

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Key words: Genes, Phenotype, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

魏琦，范家成，杜亚雯. 四种基因位点多态性与运动员耐力表型的关联[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2508-2513.

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图/表（结果） 1

2.1 四个基因多态性的分布特征研究对运动员组和对照组的ACTN3、NRF2、ADRB2、PPARGC1A四个基因多态性位点进行H-W校验，PPARGC1A的rs8192678位点多态性经校验不符合H-W平衡(P < 0.01)，而ACTN3、NRF2、ADRB2位点多态性分布符合H-W平衡(P > 0.05)，见表2- 5。结果显示运动员组ACTN3基因rs1815739位点C等位基因频率为63.35%大于T等位基因频率的36.65%，其基因型以CC/CT为主，与对照组相比无显著性差异。NFR2基因rs7181866位点的基因型以AA型为主，其次是AG型，GG型最低，A等位基因频率为70%大于G等位基因频率的30%，与对照组相比有显著性差异(P < 0.05)。ADRB2基因rs1042713位点的基因型以杂合体AG为主，纯合体AA频率大于纯合体GG，Gly16等位基因频率高于Arg16等位基因，与对照组相比无显著性差异。PPARGC1A基因的rs8192678基因型分布为纯合体GG型>AG型>AA型，Gly482等位基因频率高于Ser482，与对照组相比无显著性差异。

2.2 赛艇运动员基因多态性位点与有氧耐力表型的关联分析结果研究将赛艇运动员ACTN3、NRF2、ADRB2、PPARGC1A不同基因型与运动员的VO_{2 max}绝对值、相对值分别进行分析，不同基因型间对应VO_{2 max}绝对值、相对值比较差异均无显著性意义。

按TGS的评分公式对运动员组进行评分，结果见图1，可以看出赛艇运动员4种基因多态性的分值特点，中间分值的频率最高，不同分值组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。将TGS的评分将运动员的VO_{2 max}相对值分类得到均值并进行关联分析，结果见图2，可以看出TGS与VO_{2 max}相对值之间的相关性不是线性的，但TGS为17，83，100分之间VO_{2 max}相对值组间有显著性差异(P < 0.01)。

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引言

遗传因素被认为与运动员的运动能力表型，如爆发力、有氧能力、灵活性、协调平衡等有密切关联。尽管运动员的运动能力和中间表型有相对较高的遗传度^[1-3]，但寻找基因变异而获得优势运动能力仍是一个具有挑战性的任务。运动基因组学是一个相对较新的学科，自1968年墨西哥和1976年蒙特利尔奥运会开始报道运动能力基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究，随着基因分型、测序、DNA微阵列的使用变得普及，20年来国内外对于运动基因组学的研究取得了不少成果，对于人类基因组学的位点分析发现，几乎所有染色体(除了20号染色体外)都有与运动能力相关的遗传标记位点。最新综述研究表明，至少有155个DNA位点多态性(分布在53个常染色体、Y染色体与线粒体DNA)都与精英运动员的运动能力表型例如速度和耐力、肌肉力量等有关，其中93个与耐力表型相关^[4]。

对双生子的最大摄氧量(VO_{2 max})遗传度的研究验证了耐力相关基因的遗传度在75%以上，但是77个耐力表型相关的优势等位基因同时存在于一个人DNA序列上的概率微乎其微，国外研究者认为优秀运动员可能不是某一项的机能水平超过所有人，但在所有机能标准都必须具备相当高的水平^[5]。除了找到这些等位基因，评价这些基因单独调控效应还要研究其关联效应。William等^[6]在2008年提出了基因型总(total genotype score，TGS)的概念，假设每个基因位点单独作用，计算分值以评价人类基因异质性对于耐力表型的作用。

赛艇是一项有氧能力主导的项目，该研究通过大量文献检索，结合国内外相关研究报道，筛选出4个与有氧能力表型显著相关的基因多态性位点，包括辅肌动蛋3 (α-actinin-3，ACTN3)基因，核呼吸因子2(nuclear respiratory factor 2，NRF2)基因、β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor，ADRB2)基因及过氧化物酶体增殖受体γ共激活剂(peroxisome proliferative activated receptor gamma coactivator 1 alpha，PPARGC1A)基因^[7-10]，以期研究上述基因位点多态性与赛艇运动员耐力表型之间的关联。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2016年3至12月在湖北武汉奥林匹克体育中心科研楼完成。VO_{2 max}测试完成时间2016年6至10月，基因测序时间2016年9月。

1.3 对象湖北省队赛艇公开级男子运动员15名为运动员组，汉族，平均年龄(21.73±2.32)岁；平均身高(193.4± 1.01) cm；平均体质量(93.33±4.79) kg。50名汉族普通大学新生为对照组，平均年龄(18.1±0.62)岁，均为男生，平均身高(172.44±3.25) cm，平均体质量(72.41±5.98) kg，未经任何专业体育训练，体检均为合格。全部受试者均知情同意此次实验测试内容及用途。

1.4 方法

1.4.1 DNA制备提取安静状态下抽取受试者静脉血 5 mL，采用EDTA抗凝管，全血DNA由DNA kit试剂盒(Promaga公司)提取。

1.4.2 引物设计参照文献[7]报道的SNP序列号，在NCBI上搜索并运用软件设计扩增引物(由金开瑞公司合成)。ADRB2采用特异性引物扩增后应用ABI SDS 1.4软件中分析基因型。其他位点PCR扩增产物酶切后进行序列分析，确定基因型。引物序列和多态性扩增实验条件及验证分型条件详见表1。

1.4.3 耐力指标测试最大摄氧量测试：通过递增负荷实验，采用气体代谢测量法，实验设备为德国产肺功能测试仪MAXII连接德国h/p/puls跑台，测试获取数据为：VO_{2 max}绝对值和相对值、心率等。具体方法：①测试前要求测试者做好肌肉牵拉准备，匀速跑热身；②设置跑台坡度测试，具体设置条件为1-2级，选择坡度为0，速度分别递增至 7.5 km/h、10.0 km/h、时间保持2 min，3级选择坡度为0，速度增至12.0 km/h，保持5 min。4级坡度调至2%，速度增至12.5 km/h，保持2 min。而后视个人能力逐级递增，坡度每分钟增加2%，速度每分钟增加0.5 km/h，直至力竭。

1.4.4 基因型总分计算法 TGS是4个基因位点累加效应的数据处理。基因型总分计算法：Williams等^[6]在2008年提出的计算基因型总分来量化评价多态性对运动员的影响，采用的是把有利基因型计分给个人的简单加性模型，具体来说，每个多态性基因型分数基于基因表型使得运动员的运动能力有优势，携带优势纯合基因型计2分，优势杂合基因型计1分，无优势基因型计0分，计算公式如下：

TGS = (100/8) × (GS1 + GS2 + GS3+GS4)

总得分称为“基因型总分”(TGS)，TGS等于100分，代表了一个具备优势多基因型的精英运动员，TGS等于0代表为不太有发展成为优秀运动员的可能性。

1.5 主要观察指标 ①4个基因多态性的分布特征；②赛艇运动员基因多态性位点与有氧耐力表型的关联分析。

1.6 统计学分析数据由SPSS 20.0 for Windows 软件包进行统计分析。用基因平衡定律(Hardy-Weinberg，H-W)检验各组基因型分布是否具有群体代表性。组间等位基因频率和基因型频率分布采用χ²检验，显著性水平为P < 0.05。

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讨论

赛艇是以运动员自身有氧耐力为主，身体协调控制技术配合变化环境完成的竞技项目。VO_{2 max}是反映机体心肺功能转运氧、肌肉吸收、利用氧做功的能力，是评价运动员耐力水平的国际指标^[11-12]。研究人员认为VO_{2 max}的增高只有通过对具有先天VO_{2 max}高水平的可训练性个体进行持续运动训练方案获得，在对双胞胎和家庭的遗传学研究先天VO_{2 max}水平高低，在调整年龄、性别、体质量、体脂含量等因素研究发现欧洲久坐不动家族的VO_{2 max}指标遗传度达到51%^[13]。运动训练诱导VO_{2 max}增强的敏感性也被验证有一定显著的遗传度。研究表明在对久坐不动的年轻人进行标准化耐力训练后VO_{2 max}指标变化发现大量的个体差异性^[14]。在对双胞胎进行相同一系列的运动训练实验后发现，双胞胎VO_{2 max}的可训练型变化差异并非随机，其组间相关系数0.44-0.77之间，意味着同一对双胞胎VO_{2 max}对于训练的刺激反应变化是相似的^[15-17]。在对99个两代欧洲血统的白人家庭中481个体的VO_{2 max}增加的遗传学研究表明，家族间比较的方差值是家族内比较方差的2.5倍，最大遗传度估值约为47%^[18]。其他证据表明，久坐不动人群的潜在的VO_{2 max}值因家族性和遗传因素有所不同，且对运动训练的敏感性也不同^[19]。

ACTN3是肌动蛋白结合蛋白家族成员，目前只存在骨骼肌快肌纤维中，该蛋白位于肌纤维Z线附近帮助定位肌原纤维肌动蛋白微丝。国外发现优秀运动员ACTN3基因rs1815739多态性的RR型与爆发力高度相关^[20]。此后研究陆续验证了该基因的RR型运动员爆发力表型有一定优势^[21-25]。2005年研究发现ACTN3基因与糖原磷酸化酶共表达，通过调控糖原磷酸化酶的活化水平而影响糖原磷酸化水平，推论ACTN3基因可能与机体能量代谢水平相关^[26]。

近年来中国运动员ACTN3基因多态性研究进行Meta分析后发现，中国优秀运动员速度力量与R等位基因频率和RR基因型有显著相关性^[27]。该研究中赛艇运动员组ACTN3基因的X等位基因频率高于R等位基因频率，与对照组相比无显著性差异，但RR型的赛艇运动员的VO_{2 max}相对值均值为52.17 mL/(min·L·kg)>RX型的46.78 mL/(min·L·kg)> XX型的45.75 mL/(min·L·kg)，可能赛艇运动项目里R等位基因对于耐力指标的影响是代谢水平而非单纯的促进速度力量，基因水平上的表达即作用于肌肉的快速做功提高速度，也可能增强了有氧代谢水平。

NRF-2蛋白是随着人类同族鼠标记结合蛋白质(GABP)被发现的一个转录因子，其编码基因位于染色体15q21.2，该基因的转录会增强线粒体DNA(mtDNA)表达水平和氧化的活性磷酸化作用，其编码蛋白质可以在运动中调控ATP增加的速度，提高呼吸能力^[28-29]。研究发现以色列国家级耐力运动员NRF-2基因的AG型分布疲频率更高，该位点的多态性可能与耐力训练后VO_{2 max}升高相关^[30]，而西班牙耐力运动员无明显差异^[31]。研究发现中国汉族人群NRF-2基因多态性的AA基因型的VO_{2 max}值较高^[32]，与成年男子标准化训练后VO_{2 max}训练敏感性的个体差异相关^[33]，本研究中运动员组NFR2基因的A等位基因频率高于G等位基因频率，其中AG型运动员的VO_{2 max}相对值均值高于AA型和GG型，与对照组相比无显著性差异，可能赛艇项目运动员更偏向于AG型。

2510

ADRB2基因定位于染色体5q31-q32，其表达产物β2肾上腺素受体参与多个运动能力相关的代谢通路，因此作为运动能力表型的候选基因被研究。Wolfarth等^[34]最早报道了ADRB2基因与人类耐力表型的关联可能是通过监管能量消耗水平和脂肪组织的脂质动员来调控耐力水平，Arg16等位基因可能与高加索人群的耐力表型相关^[35]。该基因位点为Gly16等位基因的心衰患者心肌收缩调控能力下降，VO_{2 max}值较低^[36]。该研究中运动员组ADRB2基因多态性的基因型以杂合体AG为主，纯合体AA频率大于纯合体GG，Gly16等位基因频率高于Arg16等位基因，AG型 VO_{2 max}相对值均值高于GG型>AA型。

PPARGC1A是1998年发现的线粒体代谢的决定因子，研究表明PPARGC1A基因控制几个参与脂肪酸氧化关键酶编码基因的表达，主要调控肌肉适应训练诱导^[37]。PPARGC1A基因Gly482Ser多态性与优秀西班牙运动员心肺功能相关，可能是调控代谢过程的氧化磷酸化^[38]。耐力训练会增加PPARGC1A mRNA表达水平^[39]，高加索人群中携带Ser482等位基因有利于心肺功能提高^[40]，但德国和荷兰^[41]、中国北方人群的Gly482Ser多态性与VO_{2 max}不相关^[42]。Eynon等^[43]2010年研究155名以色列籍运动员发现耐力项目运动员的Ser482等位基因频率低，而GG基因型有利于有氧能力增加。Gly482Ser位点多态性在波兰和俄罗斯运动员的研究发现，其Ser482基因型频率显著低于对照组(P < 0.000 1)，推测Gly482等位基因可能是与耐力的表现相关，而Ser482等位基因则影响有氧能力^[44]。该研究中运动员组PPARGC1A基因Gly482Ser位点多态性的Gly482等位基因频率高于Ser482，基因型以纯合体GG为主，其次GA型，AA型最少，且GA型的VO_{2 max}相对值均值高于AA型和GG型，这与前期的研究结果比较一致，可能赛艇运动员Gly482基因频率较高，更有利于耐力表型。

SNP研究最早是用于遗传疾病的标记，运用于运动遗传学主要是用来研究基因与其他基因交互调节运动反应，或者如何调节与运动高度相关的表型。目前已经发现至少155遗传标记与运动耐力或者速度爆发力相关，但是人类表型受基因、环境等多种影响，通过大量运动员全基因组关联研究和全基因组测序的重复研究的进一步的验证将有助于发现大量的因果遗传变异(突变和基因多态性)来阐释运动员的运动水平和相关表型的遗传。目前有部分候选基因的等位基因和基因型频率在耐力运动员和对照组之间没有明显差异^[45-49]。而血管紧张素转换酶(angiotensin I converting enzyme，ACE)，ACTN3和PPARGC1A多态性的等位基因频率和线粒体DNA(mtDNA)单倍体存在差异^[50]。

该研究选择的4个基因位点是国外报道通过全基因组关联研究基因扫描后确定得到与耐力特征相关性的SNP多态性位点，并与VO_{2 max}分析后有相关性的标记位点^[5]。在对该研究的赛艇运动员的分析发现，ACTN3、NRF2、PPARGC1A基因位点报道的优势等位基因分布对于中国汉族赛艇运动员的耐力表型较一致，而运动员的ADRB2基因位点倾向于杂合体，对于4个基因位点是否能作为中国赛艇项目耐力表型的分子标记还需要进一步扩大样本量进行验证。

该研究中对4个位点进行TGS的分析结果与耐力表型指标之间并无明显相关性，原因可能有两种：①对于耐力表型有影响的基因位点，基因水平的影响作用不仅在分子水平的多态性上，可能还有表达调控、蛋白质水平等作用于肌肉功能和人体代谢水平调控等多方面；②基因位点多态性之间的相互效应并非线性累加，不是具备全部优势基因的个体的耐力表型更优，基因多态性不是孤立作用与运动表型，而是多个基因交互作用调控运动表型。基因多态性可能不是单独调控运动表型，而是通过基因—基因的相互作用扩大对运动表型的影响，即为不是单个基因多态性优势位点的存在，而是一些特殊基因多态性的组合有利于相关的运动表型特征。而且运动能力相关的遗传基因多态性不能完全解释运动员特征，还要考虑如罕见突变和表观遗传标记(即稳定遗传基因表达的变化)，另外研究设计、样本大小、人口分层和基因型/质量表型的测量也是非常重要的。

因此此次研究中ACTN3、NRF2、PPARGC1A基因位点的多态性与赛艇运动员耐力表型可能作为预测优秀耐力运动员运动表型的分子标记，但基因位点多态性对于耐力表型的影响还需要进一步的机制研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程