运动性骨骼肌损伤大鼠膜修复蛋白dysferlin的作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0219

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (16): 2502-2507.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0219

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运动性骨骼肌损伤大鼠膜修复蛋白dysferlin的作用机制

黄巧婷1，2，许杰1，林家仕3

1成都大学，四川省成都市 610106；2北京体育大学，北京市 100084；3集美大学，福建省厦门市 361021

收稿日期:2018-03-03 出版日期:2018-06-08 发布日期:2018-06-08
通讯作者: 许杰，博士，讲师，成都大学，四川省成都市 610106
作者简介:黄巧婷，1986年生，女，汉族，福建省人，2016年北京体育大学毕业，博士，现于成都大学体育学院工作，讲师。
基金资助:
国家自然科学基金(31401017)；成都大学自然基金(2017XJR12)；中央高校基本科研业务费专项资金(2015BS004)

Mechanism by which dysferlin promotes repair of exercise-induced skeletal muscie injury in rats

Huang Qiao-ting1, 2, Xu Jie1, Lin Jia-shi3

1Chengdu University, Chengdu 610106, Sichuan Province, China; 2Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 3Jimei University, Xiamen 361021, Fujian Province, China

Received:2018-03-03 Online:2018-06-08 Published:2018-06-08
Contact: Xu Jie, Ph.D., Lecturer, Chengdu University, Chengdu 610106, Sichuan Province, China
About author:Huang Qiao-ting, Ph.D., Lecturer, Chengdu University, Chengdu 610106, Sichuan Province, China; Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31401017; the Natural Science Foundation of Chengdu University, No. 2017XJR12; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2015BS004

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
运动性肌损伤：运动性骨骼肌损伤(exercise-indused muscle damage，EIMD)是指进行大强度、长时间或不习惯运动后所产生的骨骼肌超微结构损伤，通常的表现为延迟性肌肉酸痛，即肌肉酸痛并不发生在运动期间或运动后即刻，而是在运动后的24 h逐渐加剧。
Dysferlin：Dysferlin是一种与肌肉修复有关的Ⅱ型跨膜蛋白，主要存在肌纤维膜和肌纤维囊泡中，其由DYSF基因编码，又被称为与dystrophy有关的fer-1-like蛋白，在骨骼肌细胞膜修复过程中起关键作用。

摘要
背景：目前关于dysferlin的研究多集中在肌肉疾病(如肌营养不良)上，而针对运动后肌损伤发生后细胞膜的修复与dysferlin的关系鲜有研究。
目的：观察急性离心运动后大鼠腓肠肌细胞膜通透性及膜修复蛋白dysferlin及calpain3表达变化，为深化肌组织再生分子机制及肌肉疾病的运动治疗提供理论参考。
方法：将32只大鼠随机分为对照组、运动后24，48，72 h组。采用免疫组织化学染色、Western blot及qRT-PCR等方法检测大鼠腓肠肌细胞膜完整性和dysferlin，calpain3蛋白及基因表达。
结果与结论：与对照组相比，运动后24 h组血清肌酸激酶活性、Calpain3 mRNA，dysferlin蛋白表达及骨骼肌细胞膜损伤程度均增高(P < 0.05或P < 0.01)；运动后 24，48 h组大鼠dysferlin mRNA表达量高于运动后72 h组(P < 0.05)。结果说明，离心运动后24 h，骨骼肌细胞膜损伤最为严重，人体通过Ca2+内流，激活了细胞内钙激活酶calpain3基因表达，进而通过促进膜特异性修复蛋白dysferlin表达修复受损的骨骼肌细胞膜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6407-6993(黄巧婷)

关键词: 运动性肌损伤, 离心运动, 肌酸激酶, Dysferlin, Calpain3, 延迟性肌肉酸痛, SNARE复合体, 免疫组织化学染色, Western blot, RT-qPCR, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies concerning dysferlin focus on muscle diseases (such as muscular dystrophy), but the relationship between membrane repair after exercise-induced muscle damage and dysferlin is little reported.
OBJECTIVE: To observe the cell membrane permeability and expression levels of dysferlin and calpain3 in the rat gastrocnemius after acute eccentric exercise, so as to provide an theoretical reference for exploring the molecular mechanism of muscle regeneration and the exercise therapy of muscular diseases.
METHODS: Thirty-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups including control, 24, 48 and 72 hours post exercise groups. The membrane permeability and expression levels of dysferlin and calpain3 were determined by immunohistochemistry, western blot assay and qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The activity of serum creatine kinase, and expression levels of calpain3 mRNA and dysferlin protein, as well as membrane permeability at 24 hours post exercise were significantly greater than those in the control group (P < 0.05 or 0.01). The expression level of dysferlin mRNA at 24 and 48 hours post exercise was significantly higher than that at 72 hours post exercise (P < 0.05). Therefore, the damage to the skeletal muscle cell membrane was the most severe at 24 hours after eccentric exercise. Due to Ca2+ influx, expression of calpain3 mRNA was activated, and then the damaged cell membrane was repaired by increasing the expression of dysferlin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Sports Medicine, Cell Membrane

中图分类号:

R318

黄巧婷，许杰，林家仕. 运动性骨骼肌损伤大鼠膜修复蛋白dysferlin的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2502-2507.

Huang Qiao-ting1, 2, Xu Jie1, Lin Jia-shi3. Mechanism by which dysferlin promotes repair of exercise-induced skeletal muscie injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2502-2507.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠32只，无死亡或感染，均进入结果分析。

2.2　离心运动后大鼠血清肌酸激酶活性的变化高强度间歇离心运动后，大鼠血清肌酸激酶活性逐渐升高，运动后24 h组与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.01)。随后血清肌酸激酶活性逐渐下降，至运动后72 h，略低于对照组，但组间差异无显著性意义。详细情况见图1。

2.3 Dysferlin蛋白免疫荧光染色结果对照组dysferlin荧光信号较弱，主要分布在骨骼肌细胞膜附近，且分布较为均匀。高强度间歇训练后，dysferlin荧光信号逐渐增强，虽然也主要分布在肌纤维膜周围，但在细胞内可以明显地观测到呈弥散性分布的荧光信号，以运动后24，72 h组尤为显著。见图2。

2.4 间歇性离心运动对大鼠腓肠肌dysferlin及calpain3 mRNA表达的影响与对照组相比，间歇性离心运动后dysferlin mRNA表达量持续增加，于运动后48 h达到峰值，随后逐渐下降至略低于对照组水平。

运动后48 h组dysferlin mRNA表达量与运动后72 h相比较差异具有非常显著性意义(P < 0.01)；运动后24 h组dysferlin mRNA表达量与运动后72 h相比较差异有显著性意义(P < 0.05)。Calpain3 mRNA表达水平在运动后24 h达到峰值，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，随后逐渐下降，见图3。

2.5 间歇性离心运动后大鼠腓肠肌dysferlin及calpain3蛋白表达变化采用蛋白免疫印迹法对各组大鼠腓肠肌dysferlin及calpain3蛋白表达量进行测定，经过图像分析软件处理后得出积分吸光度值，以对照组积分吸光度值平均数作为基数，其他组积分吸光度值除以基数作为蛋白变化结果，如图4所示。

运动后24，48，72 h组dysferlin蛋白表达量均高于对照组，但仅有24 h组与对照组相比，具有显著性差异，而各组大鼠calpain3蛋白表达量均差异无显著性意义。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年3月至12月在北京体育大学实验室完成。

1.3 材料健康8周龄SPF级别雄性SD大鼠32只，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-001。体质量(196.75±8.14) g。

所有大鼠国家标准啮齿类动物饲料喂养，分笼饲养，自由饮食、进水，室温22-24 ℃，相对湿度50%-70%，模拟自然条件对动物进行自然光照射，12 h/d。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及运动训练将32只大鼠随机分为对照组、运动后24，48，72 h组，每组8只。对照组正常饲养不训练，其他大鼠进行适应性跑台训练和一次间歇性离心运动，运动参数为：速度26.8 m/min，坡度-16°，运动5 min×10次，组间间歇1 min^[9]，运动后24，48，72 h组分别于运动后24，48，72 h取材。

1.4.2 取材各组分别于运动后24，48，72 h用体积分数2%的戊巴比妥钠(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉。腹主动脉取血后，分离腓肠肌，迅速称质量。于冰上切取约50 mg样品投入RNA保存液(Sigma，R0901)，4 ℃保存，以备基因检测使用；切取约3 mm×3 mm×5 mm大小样品，放入提前加入OCT包埋剂的胶囊壳上，均匀包埋后投入用液氮预冷正己烷(南京建成)(-70 ℃)内速冻，锡纸包好放入液氮保存，用于制作冰冻切片；将剩余样品用锡纸编号、包好，迅速投入液氮中，-80 ℃冰箱保存，待用。

1.4.3　血清肌酸激酶测试采用ELISA双抗夹心法检测大鼠血清肌型肌酸激酶(creatine kinase，muscle，CKM)水平。

具体操作方法如下：每孔加入10 μL样品(或标准品)，根据预实验结果，如果样品浓度高，可用standard dilution稀释至终体积为100 μL，用standard dilution作为空白对照。封板，37 ℃孵育30 min。倒掉溶液，Wash Buffer洗5次，每次200 µL。在吸水纸上轻弹板子，液体倒干净，待用。进行抗体-抗原-抗体反应，每孔加入100 μL HRP-Conjugate，37 ℃ 30 min。倒掉溶液，Wash Buffer洗5次，每次200 μL。在吸水纸上轻弹板子，液体倒干净，待用，显色反应。每孔加入50 μL的Chromogen Solution A 和Chromogen Solution B，37 ℃ 5-20 min。看到显色反应，加入50 μL Stop Solution。在酶标仪紫外光450 nm测定吸光度值。

1.4.4 免疫荧光组织化学染色将冷冻样本置于Leica 冰冻切片机(CM 1850，德国)内进行腓肠肌横向连续切片，切片厚度6 μm，进行免疫荧光染色。

体积分数10%牛血清封闭切片2 h，去封闭液，滴加一抗(dysferlin，sigma，SAB4200453，1∶2 000)，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，暗室加入二抗羊抗兔lgG(H+L)(FITC，中杉金桥，北京，ZF-0311，1∶100)，37 ℃避光孵育1 h，PBS 漂洗3次后用防荧光淬灭剂封固并立即用激光共聚焦显微镜观察。

1.4.5 RT-qPCR检测dysferlinm及calpain3 mRNA表达用Trizol提取组织样本中总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，DNase Ⅰ试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat# CW2090)对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理及HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)进行反转录。并根据GenBank数据库中公开发表的基因序列设计引物(奥科生物公司合成)并采用 20 μL的反应体系，ABI 7500型荧光定量PCR仪进行定量分析，反应结束后，采用Opticon Monitor 2.03 analysis software专用软件观察扩增曲线和熔解曲线并将其转换为Ct值，拷贝至Excel 2007处理。

采用18S rRNA 作为内标。将内标减去指标所得的Ct差值(?Ct)取反对数(2^?Ct)，进行统计学处理，引物序列见表1。

1.4.6 Western blot法测定dysferlin及calpain3蛋白表达表达研磨好的组织粉称质量，以重1∶9比例加入裂解液， 13 000 r/min、4 ℃高速离心后取上清。

用BCA方法测蛋白浓度，根据目的蛋白的相对分子质量，以上样量20 μg/孔为一次上样量。配制8%，12%分离胶和5%浓缩胶，浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。湿转法进行转膜，转膜条件为300 mA恒流，P-IRS1转膜时间为2 h。随后将膜完全浸没体积分数3% BSA-TBST(Amresco)中室温轻摇30 min，并用3% BSA-TBST稀释后的一抗dysferlin(Sigma，SAB4200453，1∶2 000)，calpain3(Santa，sc-50334，1∶1 000)室温孵育10 min，4 ℃冰箱过夜。次日将膜室温孵育30 min后，TBST洗膜5次，每次3 min。用体积分数5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗(山羊抗兔IgG(H+L)HRP(1∶20 000)，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1:10 000)，室温轻摇40 min，TBST洗膜6次。

胶片曝光，显影、定影，用YLN-2000凝胶影像分析系统拍照。Image J 软件选取条带，β-tubulin作为内参，读取积分吸光度值。

1.5 主要观察指标各组dysferlin，calpain3蛋白及基因的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件通过单因素方差分析及独立样本t 检验进行各组间的差异显著性检验，所有数据均以x(_)±s表示。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

当外界机械负荷超过骨骼肌自身的可承受能力，可导致细胞膜的微细损伤^[10]，如离心运动，易引起骨骼肌细胞内出现肌浆网空泡化及Z线结构紊乱等^[11]，因此多数研究者选用该运动方式来观察运动性肌损伤^[9^，^12]。

血清肌酸激酶作为人体内大分子蛋白，当骨骼肌细胞发生微损伤时，细胞膜通透性发生改变，肌酸激酶可透过组织细胞膜进入血液循环^[13]，因此常用来判断骨骼肌细胞膜通透性改变。高志强等^[14]研究发现，大鼠离心运动后即刻、运动后12，24 h，血清肌酸激酶活性依次呈现显著上升趋势，至运动后48 h的肌酸激酶活性下降。实验结果显示，离心运动后24 h大鼠血清肌酸激酶活性出现峰值，细胞膜通透性最大，损伤最为严重。

Dysferlin作为一种主要分布于骨骼肌细胞内的跨膜蛋白^[15]，主要存在于骨骼肌细胞膜和囊泡内，常被称为与dystrophy有关的fer-1-like蛋白^[16]，参与了细胞膜的损伤修复过程^[1，17]。已有研究证实，dysferlin蛋白-COOH有一个横跨膜区域，人体可通过该区域将dysferlin蛋白锁定在细胞膜上^[4]，另外，由于dysferlin与神经元细胞中的突触结合蛋白具有结构上的同源性，因此dysferlin也可通过促进Ca²⁺内流^[18]，调节细胞内囊泡的转运、融合来进一步调节骨骼肌细胞膜的修复功能。若该蛋白缺失或结构异常，则会引起膜修复的障碍而导致细胞死亡^[20]。如Glover等^[19]研究报道，dysferlin基因敲除小鼠的肌细胞膜无法进行自我修复，并且dysferlin缺陷小鼠易发展成严重的肢带型肌营养不良(LGMD)。Millay等^[21]研究发现SD大鼠在受到15次连续离心收缩后3 d，骨骼肌的所有功能将全部恢复。而dysferlin缺陷大鼠，在急性运动损伤后，骨骼肌细胞膜的损伤程度与正常组大鼠比较，具有显著性差异^[22]。

根据骨骼肌细胞膜的损伤修复机制，实验可以推测，当骨骼肌细胞膜完整性受到破坏时，需要大量dysferlin参与膜损伤修复，故dysferlin含量对细胞膜的修复具有时效性。另外，有研究证明，dysferlin缺陷大鼠在急性运动损伤后3 d其蛋白水平下降至正常对照组的15%，甚至更少，而正常组大鼠骨骼肌中并未发现此种现象^[23]。此外，长期有规律的进行跑台训练的大鼠，骨骼肌细胞内并未发现dysferlin蛋白水平显著差异于对照组^[24]。

实验免疫荧光染色的结果显示，对照组dysferlin蛋白的荧光主要分布在细胞膜和邻近细胞膜区域，且荧光强度较弱，极个别细胞胞浆内显示极弱的荧光。结合dysferlin Western blot和RT-qPCR的结果，实验发现对照组中dysferlin蛋白和mRNA表达量均表现较低水平，提示，正常骨骼肌细胞中，dysferlin的表达水平较低。间歇性离心运动后，各组大鼠dysferlin蛋白的荧光信号强度较对照组均有明显的增加，虽然荧光信号也主要分布在细胞膜及细胞膜周围，但在细胞内可以明显地观测到呈弥散性分布的荧光信号，以运动后24，48 h组尤为显著。Dysferlin mRNA结果显示，离心运动后各组大鼠dysferlin mRNA表达量持续增加，与对照组比较，虽无显著差异，但仍具有较为明显的增加趋势。

从dysferlin Western blot结果实验可以看出，离心运动后各组dysferlin蛋白表达量均高于对照组，但仅有运动后24 h组显著高于对照组，提示离心运动后24 h，大鼠腓肠肌细胞膜损伤最为严重，人体通过快速增加dysferlin基因及蛋白表达，以达到修复细胞膜的目的。

人体内细胞膜的自我修复可通过细胞外Ca²⁺内流，激发细胞膜上的分子感受器，促使细胞膜上囊泡募集融合，从而达到“补丁修复”的效果^[1]。如神经元细胞中的出胞过程，融合信号触发了Ca²⁺的流动，使Ca²⁺在突触结合蛋白的C2区域上结合^[25]，进而转移至突触前膜的磷脂双分子层上，随后调节囊泡质膜和突触前磷脂膜的融合^[19]，此过程除了依赖于Ca²⁺的调节外，囊泡的募集、转运及融合还需要多种蛋白参与，如Mg53^[26-28]，dysferlin^[29-30]、annexin A2等^[31-33]。

Calpain3作为是一种骨骼肌特异性钙激活酶，与Ca²⁺内流密切相关^[8]。实验结果显示，间歇性离心运动后，calpain3 mRNA表达水平在运动后24 h达到峰值，但各组大鼠calpain3蛋白表达量却差异无显著性意义。提示，离心运动后24 h，大鼠腓肠肌细胞膜通透性最大，导致大量Ca²⁺内流，激活了细胞内钙激活酶calpain3基因表达，随着细胞内外新的Ca²⁺浓度平衡的建立，calpain3基因也逐渐回落至原有水平。

综上所述，间歇性离心运动后24 h，骨骼肌细胞膜损伤最为严重，人体通过Ca²⁺内流，激活了细胞内钙激活酶calpain3基因表达，进而通过促进膜特异性修复蛋白dysferlin的表达形成囊泡并聚集至膜损伤部位，修复细胞膜以保持细胞膜的完整性。

目前关于dysferlin的研究多集中在肌肉疾病(如肌营养不良)上，而针对骨骼肌细胞膜功能受损以及受损后恢复与dysferlin的关系鲜有研究，尤其是运动性肌损伤恢复期dysferlin的作用机制未见报道。

因此实验系统分析了较大强度的运动引起的肌损伤后细胞膜自我修复机制问题，为肌组织工程研究及肌肉疾病的运动疗法提供理论参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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