内皮素1调控P19细胞向心脏传导细胞分化的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0812

摘要/Abstract

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文题释义：
内皮素1：内皮素(endothelin，ET)广泛存在于各种组织和细胞中，心血管系统起主要作用的是内皮素1。内皮素1是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。
P19细胞：P19细胞是一类来源于C3H/He小鼠、具有多分化潜能的胚胎癌细胞。P19细胞体外培养条件简便，并且能够被诱导分化为骨骼肌细胞、心肌细胞和神经胶质细胞等多种细胞类型。由于P19细胞易于转染并稳定表达目的基因，因此常借助转基因或基因敲除等操作技术来深入了解细胞增殖和诱导分化的具体调控机制。

摘要
背景：内皮素1作为一种来源于心内膜和动脉血管内皮的旁分泌信号，能够诱导心脏传导细胞的分化成熟。
目的：探讨内皮素1在体外诱导P19细胞向心脏传导细胞分化的作用。
方法：P19 细胞分别与1%二甲基亚砜和100 nmol/L浓度内皮素1孵育，通过Western blot、免疫荧光和qRT-PCR鉴定早期心肌细胞特征性转录因子GATA4、MEF2C和心肌细胞分化标志物MHC-α、cTnT，以及重要的传导细胞转录因子Nkx2.5、Tbx5和分化标志物Cx40、ANP的变化。qRT-PCR鉴定内皮素1特异性受体阻断剂和阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路对内皮素1诱导P19细胞分化的影响。
结果与结论：①内皮素1能够上调P19细胞早期心肌转录因子、心肌结构基因和传导系统特征表型表达；②与二甲基亚砜相比，内皮素1能够确实诱导P19细胞向心脏传导细胞分化；③内皮素1主要通过ETA通路上调 Nkx2.5 和Cx40表达水平从而诱导P19细胞向传导细胞分化，ETB通路可能还参与了一条负反馈调节通路；④内皮素1能够通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控Nkx2.5表达进而影响传导细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6026-3780(陈浩)

关键词: 内皮素1, 组织构建, 分化, 二甲基亚砜, P19细胞, 心脏传导细胞, 心肌细胞

Abstract:

BACKGROUND: Endothelin-1, as a paracrine cytokine derived from endocardium and vascular endothelial cells, can promote the differentiation and maturation of cardiac conduction cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of endothelin-1 on P19 cells differentiating into cardiac conduction cells in vitro.
METHODS: P19 cells were cultured with 1% dimethyl sulfoxide or 100 nmol/L endothelin-1. Afterwards, the changes of early cardiomyocyte transcription factors MEF2C and GATA4, differentiation markers MHC-α and cTnT, important conduction cell transcription factors Nkx2.5 and Tbx5, and differentiation markers Cx40 and ANP were identified by western blot assay, immunofluorescence and real-time PCR. Specific antagonists of endothelin-1 receptors, and blocking PI3K-AKT-mTOR signaling pathway on the differentiation of P19 cells induced by endothelin-1 were evaluated by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Endothelin-1 significantly up-regulated the levels of early cardiac transcription factors, cardiomyocyte structure factors and characteristic conduction system markers. Compared with dimethyl sulfoxide, endothelin-1 was prone to enhance the differentiation of cardiac conduction cells derived from P19 cells. Up-regulation of Nkx2.5 and Cx40 by endothelin-1 was mainly attributed to the ETA signaling pathway. ETB signaling pathway may be also involved in a negative feedback regulation pathway. The PI3K-AKT-mTOR signaling pathway can play an important role in the differentiation from P19 cells to cardiac conduction cells triggered by endothelin-1.

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Key words: Embryonal Carcinoma Stem Cells, Heart Conduction System, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈浩，张武，王浩，张恒一，徐志伟. 内皮素1调控P19细胞向心脏传导细胞分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1915-1921.

Chen Hao1, Zhang Wu2, Wang Hao1, Zhang Heng-yi1, Xu Zhi-wei1. Mechanism by which endothelin-1 regulates the differentiation of P19 cells into cardiac conduction cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1915-1921.

图/表（结果） 2

2.1 P19细胞分化过程的形态学变化正常体外培养的P19细胞胞体小，胞质较多，外形呈椭圆或正多边形，边缘有时有细小突起。将P19细胞移入细菌培养皿悬浮培养，同时加入1%二甲基亚砜或内皮素1诱导分化后，P19细胞开始聚集成类似体内拟胚体结构的细胞团继续生长(图1A，B)。诱导4 d后，将P19细胞聚集体移入细胞培养皿中，以无二甲基亚砜和内皮素1的普通生长培养液培养。24 h内多数细胞重新贴壁生长，细胞聚集体由球形变为扁平状多细胞层结构(图1C)。部分发生分化的P19细胞胞核变大，外形由椭圆或正多边形转变为长梭形或纺锤形。

2.2 内皮素1诱导P19细胞分化的浓度选择检测了不同浓度内皮素1对早期心肌分化特征性基因Nkx2.5和MEF2C表达的影响。与对照组相比，10-50 nmol/L的内皮素1对Nkx2.5表达没有明显影响，浓度上升为100 nmol/L时Nkx2.5表达增加明显，200 nmol/L时Nkx2.5表达与其余各组相比均有显著差异(图2A)。另一方面，当内皮素1浓度由10 nmol/L上升为100 nmol/L时，MEF2C表达亦相应增加，100 nmol/L浓度时MEF2C表达与其余各组差异明显；但浓度增加至200 nmol/L时，MEF2C表达反而降低(图2B)。因此，实验选择100 nmol/L内皮素1进行诱导分化实验。

2.3 内皮素1和二甲基亚砜诱导P19细胞向早期心肌细胞分化除Nkx2.5和MEF2C，还选取了早期心肌分化的另一个特征性基因GATA-4，运用Real-time PCR对二甲基亚砜和内皮素1诱导P19细胞分化过程中以上基因的表达进行了检测。结果发现，二甲基亚砜和内皮素1组Nkx2.5表达水平在第8-10天达到峰值后逐渐减低；双因素重复测量方差分析显示，内皮素1组Nkx2.5表达水平与对照组和二甲基亚砜组相比均有明显差异(图3A)。虽然内皮素1组早期GATA-4表达水平有所降低；但总体而言，两组细胞GATA-4表达水平均呈逐渐升高趋势，后期表达水平均显著高于对照组。此外，10-14 d期间内皮素1组GATA-4表达也明显超过二甲基亚砜组(图3B)。作为早期心肌特征性转录因子，MEF2C对调控心室肌分化有重要作用。结果显示，两组细胞第8天起MEF2C表达水平逐渐增加并在第12天达峰；同样，内皮素1组的峰值水平要显著高于二甲基亚砜组和对照组(图3C)。结果说明，二甲基亚砜和内皮素1均能显著上调P19细胞早期心肌分化相关基因的表达水平。Nkx2.5基因升高出现时间最早，达峰时间也最早，在第8天左右；GATA-4和MEF2C基因的表达时间稍晚于Nkx2.5，达峰时间在第12天左右。

2.4 内皮素1能够进一步诱导P19细胞向心肌传导细胞分化随后检测了代表成熟工作心肌的肌节结构基因MHC-α的表达情况。与上述结果不同，虽然第8天起两组细胞MHC-α表达水平均开始增加并在第12天达峰，但内皮素1组表达水平明显不及二甲基亚砜组；并且与对照组相比，内皮素1组的表达水平并无显著提高(图3D)。相反，与对照组和二甲基亚砜组相比，内皮素1则能够显著上调P19细胞体内作为心脏传导细胞特征基因Cx40的表达水平，呈明显升高趋势(图3E)。

与Nkx2.5不同，Tbx5是心脏传导细胞的关键转录因子；而ANP和cTnT作为特征性心肌结构因子，前者在传导细胞的含量要明显高于后者。运用蛋白免疫印迹法分别检测了诱导后8 d Nkx2.5、Tbx5以及12 d cTnT、ANP的表达情况。与对照组相比，上述因子表达均明显增加，并且内皮素1组Nkx2.5和Tbx5的表达水平显著高于二甲基亚砜组(图4A)。免疫荧光检测则发现，内皮素1组Nkx2.5、Tbx5和ANP的阳性反应较强，尤其是Tbx5和ANP的荧光反应强度明显高于二甲基亚砜组(图4B-D)。这些结果提示内皮素1能够明显上调心脏传导细胞特征基因的表达，从而更有利于P19细胞向心脏传导细胞分化。

2.5 内皮素1通过与受体ET_A和ET_B结合调控P19细胞分化为了解内皮素1特异性受体ET_A和ET_B参与调控P19细胞分

化的不同作用，在内皮素1诱导分化时分别加入ET_A特异性阻断剂BQ123(1×10^-6mol/L)和ET_B特异性阻断剂BQ788 (1×10^-6 mol/L)，在体外共同培养8 d或14 d后检测各组细胞Nkx2.5、MEF2C和Cx40基因的表达情况。结果发现，BQ123和BQ788本身并不影响MEF2C和Cx40表达，BQ123和BQ788对内皮素1调控MEF2C和Cx40表达的抑制作用无明显差异(图5A，B)；提示ET_A和ET_B均参与了内皮素1调控P19细胞向包括传导细胞在内的心肌细胞分化过程，内皮素1能够分别作用与ET_A和ET_B受体而发挥上述调控作用。结果还发现，虽然BQ788+ET-1组中Nkx2.5的表达水平也明显低于内皮素1组，但BQ788本身却会增加Nkx2.5的表达水平(图5C)；这进一步提示，虽然ET_A和ET_B

对于内皮素1调控P19细胞心肌分化同样重要，但在具体调控机制方面存在一定差异。

2.6 内皮素1通过PI3K-AKT-mTOR信号通路诱导P19细胞向心脏传导细胞分化为了解内皮素1诱导P19细胞向心脏传导细胞分化的可能机制，分别采用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂WM(2×10^-6 mol/L)、Src抑制剂PP2(5×10^-6 mol/L)和雷帕霉素靶蛋白抑制剂Ra(1×10^-6 mol/L)做进一步研究。结果发现，单纯添加WM、PP2或Ra并不影响Nkx2.5和Cx40基因的表达水平。与内皮素1诱导组相比，WM、PP2和Ra均能明显抑制内皮素1诱导上述传导细胞基因的表达水平；而WM+ET-1组、PP2+ET-1组和Ra+ET-1组这3组之间上述基因的表达水平没有显著差异(图6A，B)。以上结果提示，WM、PP2和Ra能够分别与对应受体结合而抑制内皮素1诱导P19细胞向传导细胞分化。由于WM、PP2和Ra分别对应PI3K-AKT-mTOR信号通路中的3个重要激酶，并且WM+ET-1组、PP2+ET-1组和Ra+ET-1组这3组之间的抑制水平无显著差异，因此可以认为，PI3K-AKT-mTOR信号通路在内皮素1调控P19细胞向传导细胞分化过程中起到了重要作用。

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引言

心脏传导细胞作为一类特殊的心肌细胞，不同于成熟的工作心肌细胞，虽然两者均来源于胚胎早期发育阶段原始心管中的多能心脏干细胞，但前者的发育形成与心血管系统血流负荷关系密切。血流负荷增加能够促进心脏传导系统功能成熟，而负荷降低则延缓了心脏干细胞向传导细胞分化，而血流负荷变化所带来的物理剪切力因素最终是通过包括内皮素1在内、主要来源于心内膜和动脉血管内皮的旁分泌信号来影响传导细胞的分化成熟。

内皮素1主要表达于心脏组织中的心肌细胞，在心室肌小梁和传导系统部位的含量尤其明显。研究发现，敲除内皮素1基因的胚胎心脏发生室间隔缺损和传导阻滞的概率明显增加，甚至造成胚胎死亡；而上调胚胎心肌内皮素1表达能够诱导前者向传导细胞分化，明显增加正常心脏传导部位以外异位和早熟的传导组织形成。体外实验进一步发现，内皮素1能够明显上调胚胎干细胞中传导细胞特征性表型的表达，诱导分化所得的细胞形态也更接近于包括起搏细胞在内的传导细胞而非心肌细胞。

P19细胞是一类来源于C3H/He小鼠、具有多分化潜能、在分化过程中能够褪去原先癌细胞的表型特点而获得分化细胞相应特征的胚胎癌细胞。P19细胞体外培养条件简便，与胚胎干细胞和心脏干细胞相比无需饲养层和生长因子支持，历经多次传代还能继续保持未分化状态这一干细胞特性。不仅如此，P19细胞还可通过改变培养条件被诱导分化为包括骨骼肌细胞、心肌细胞和神经元在内的多种细胞类型。许多研究业已证实，P19细胞能够被二甲基亚砜、催产素或5-氮杂胞苷等细胞因子或化学试剂诱导分化为心肌细胞；并且，由于P19细胞在向心肌细胞分化过程中其相关特征基因的表达及电生理特性与正常小鼠胚胎心肌发育过程相似，P19细胞常被用作心肌细胞分化与发育研究的良好体外模型。

目前，心脏传导系统修复的临床研究开展较少，而传导细胞分化机制的实验研究进展较为缓慢是不可忽视的重要因素。研究尝试利用内皮素1诱导P19细胞向心脏传导细胞分化，并探讨其分化过程中的调控机制。

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材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年5月在上海市瑞金医院血液学研究所实验室完成。

1.3 材料 P19小鼠胚胎癌细胞株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心(ATCC)提供；α-MEM培养液购自美国Invitrogen公司、胎牛血清、胰酶消化液购自美国Gibco公司；二甲基亚砜、内皮素1、内皮素受体A(ETA)阻断剂BQ123、内皮素受体B(ETB)阻断剂BQ788、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Wortmannin(WM)、Src抑制剂PP2、雷帕霉素靶蛋白抑制剂Rapamycin(Ra)、Trizol、DEPC购自美国Sigma公司；Phototope-HRP Western Blot试剂盒购自美国Millipore公司；Western成像系统购自日本Fujifilm公司；Real-time PCR试剂盒购自美国Promega公司；Stepone Plus实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；细胞培养箱购自日本Sanyo公司；荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司；羊抗Nkx2.5、羊抗Tbx5、羊抗GATA-4、羊抗ANP、羊抗cTnT、鼠抗α-actinin购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的对应种属二抗购自美国Merck-Calbiochem公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及分化诱导复苏后的P19细胞置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中孵育，每2 d更换普通生长培养液1次(α-MEM培养液、体积分数10%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、链霉素100 g/L )。倒置相差显微镜下观察，正常P19细胞生长达到80%-90%汇合时传代。

二甲基亚砜诱导分化步骤如下：1 d，收集复苏后第7代贴壁生长的P19细胞，以1×10⁹L^-1细胞浓度悬浮培养于含10 mL二甲基亚砜诱导分化培养液的10 cm细菌培养皿中(α-MEM培养液、1%二甲基亚砜、体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/L )；2 d，轻轻吹打细胞悬液，防止细胞贴壁或细胞聚集体(拟胚体)过大；3 d，用7 mL二甲基亚砜诱导分化培养液置换出同等量的旧培养液，再次轻轻吹打细胞悬液；4 d，吸取细胞聚集体，离心弃去上清，6 mL普通生长培养液重悬细胞聚集体，按1∶6接种于6 cm细胞培养皿，或按1至2细胞聚集体/孔接种于24孔培养皿中，使其贴壁生长，每2 d更换普通生长培养液1次。

内皮素1诱导分化步骤类似二甲基亚砜，内皮素1诱导分化培养液配方为：α-MEM培养液、1×10^-7mol/L内皮素1、体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/L。

在受体阻断和信号通路抑制实验中，相应浓度的内皮素受体阻断剂BQ123、BQ788以及PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂( WM、PP2和Ra )分别加入普通生长培养液和内皮素1诱导分化培养液继续培养。

1.4.2 免疫荧光检测取细胞样品滴于玻片上，室温离心后晾干，DAKO笔画出细胞圆形边界。预冷的40 g/L多聚甲醛固定，室温孵育30 min后加入TritonX-100室温透化 45 min。PBS清洗后加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后加入FITC标记二抗，避光室温孵育1 h。PBS和双蒸水清洗后室温晾干，加入含DAPI的封片剂封固，用荧光显微镜观察并获取图像。

1.4.3 Western blot检测分化指标收集细胞样品，冷PBS清洗2次，SDS裂解液重悬细胞，95-100 ℃煮5 min使细胞充分裂解，Bradford比色法测定蛋白质浓度。蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，电泳后用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上。将转好后的PVDF膜放置到考马斯亮蓝染液中染色，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入5%脱脂奶粉/TBST稀释好的一抗抗体，4 ℃孵育过夜。回收一抗抗体，加入TBST缓冲液，缓慢摇动洗涤，以1∶5 000比例，加入HRP标记的对应种属二抗，室温孵育1 h。最后用Phototope- HRP试剂盒检测目的蛋白表达。

1.4.4 Real-Time PCR检测分化表达按照Invitrogen公司Trizol试剂盒提供的方法提取细胞总RNA。采用Oligo和Primer-5程序设计引物，设计好的引物由Invitrogen公司合成。将提取出的mRNA进行反转录，成为cDNA模板，进行实时定量荧光PCR。所有数据采用ABI PRISM SDS 2.0软件分析，该软件计算出的阈值表示达到高于本底一定数值的荧光强度所需的循环数。各样本目的mRNA和内参(β-actin)分别进行Real-Time PCR反应(所用Real-Time PCR引物参照下表)。应用2^-^Δ^CT法计算不同组间表达差异。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因	Forward primers (5'-3')	Reverse primers (5'-3')	长度 (bp)
Nkx2.5	CCA ACA GCA ACT TCG TGA AC	TCC CTA CCA GGC TCG GAT	116
GATA-4	GAA GGC AGA GAG TGT GTC AAT	GCC GTT CAT CTT GTG ATA GAG	111
MEF2C Cx40 MHC-α β-actin	GCC AAA TCT CCT CCC CCT AT GGG CTA CTC CTC AAG TCT C ACC AAC AAC CCA TAC GAC TAC GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G	CCA ATG ACT GAG CG ACT G GGG GGT CTA TCT GGT ATG TT AGC ACA TCA AAG GCA CTA TC TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA G	139 143 107 216

1.5 主要观察指标 ①P19细胞分化过程的形态学变化；②免疫荧光和Real-time PCR检测P19细胞分化；③内皮素1诱导P19细胞向心脏传导细胞分化的信号通路检测。

1.6 统计学分析数据结果采用x(_)±s表示，应用SPSS 19.0统计分析软件进行统计学处理。经方差齐性检验后，同一时间点多组数据比较采用单因素方差分析，不同时间点多组数据比较采用双因素重复测量方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

心脏传导系统中浦肯野纤维网与其周围的工作心肌均来源于相同的心肌前体细胞。传导细胞在形成时由前体细胞增殖阶段中撤出而多停留于G₀期，减弱或失去继续分裂增殖的能力，采纳相对幼稚的心肌表型而募集形成^[1-3]。这一发生和分化过程尤其受到以内皮素1为主的旁分泌信号的调控^[4]。内皮素1前体蛋白被心肌细胞、内皮细胞和心脏间质细胞分泌的内皮素转化酶1修饰为功能成熟的内皮素1活性结构，通过与特异性受体ET_A和ET_B结合，最终促成浦肯野纤维特征基因的表达^[5]。以往体外实验研究发现，内皮素1能够诱导胚胎干细胞和胚胎心脏干细胞向早期心肌细胞分化，并且其基因表型和细胞电生理属性更加类似于心脏传导细胞而非工作心室肌细胞^[6-8]。本研究结果也证实，内皮素1在体外能够诱导P19细胞向类似浦肯野细胞的心脏传导细胞分化。因此，可以认为，内皮素1在心肌前体细胞分化为传导细胞过程中可能扮演了关键的触发开关角色。

Nkx2.5、Tbx5、GATA-4和MEF2C等多个特征性转录因子在胚胎早期心脏前体细胞向心肌细胞和传导细胞分化过程中发挥了重要的调控作用。尤其是Nkx2.5和Tbx5，既是心脏发生的主要早期标志物，又是包括传导细胞在内的早期心肌细胞定向分化的重要前提。Nkx2.5表达缺失会导致严重的心脏发育缺陷使胚胎在心脏成袢后不久即死亡^[9]。敲低Nkx2.5表达则会导致由于房室结或房室束发育不足引起的先天性房室传导缺陷^[10]。Harris等^[11]发现，浦肯野纤维网的分化时间与Cx40出现和Nkx2.5首次峰值时间均彼此对应，提示Nkx2.5单独或与Tbx5一道上调了Cx40表达并诱导心室传导系统分化。不仅如此，Nkx2.5在心室传导系统中的表达水平随胚胎发育进一步升高并在出生前后达到第二次高峰，说明心室传导功能的成熟还具有明显的Nkx2.5剂量和时间依赖性；在此过程中干扰Nkx2.5表达同样会造成传导系统功能异常^[12]。Tbx5是心脏发育过程中左心室形态发生的重要保证，Tbx5杂合子缺失会导致PR间期延长和左右束支缺陷等类似Holt-Oram综合征的表现^[13]。研究发现，Tbx5和Nkx2.5通过转录因子Id2协同作用上调Cx40和ANP等心室特异性基因表达，对于心室传导组织尤其是浦肯野纤维网的分化形成意义重大；Tbx5单倍剂量不足会下调ANP和Cx40表达从而影响心腔和房室传导系统发育^[14]。

以往多项体外实验结果表明，内皮素1能上调心脏特征性转录因子Nkx2.5和GATA-4以及传导细胞特征表型ANP和Cx40的表达，从而说明内皮素1能进一步诱导干细胞越过早期或胚胎心肌细胞阶段最终向传导细胞分化^[4-5^，^15-16]。在实验中采用P19细胞体外培养模型探讨内皮素1的诱导分化功能。结果发现，内皮素1不仅能够上调GATA-4和MEF2C等心肌特征性转录因子表达，与二甲基亚砜相比还能够进一步提高与传导细胞分化更为密切的转录因子Nkx2.5和Tbx5的表达水平。在诱导心肌特征性结构基因表达方面，内皮素1不仅能够明显提高cTnT和ANP表达，而且与二甲基亚砜相比能够进一步提高传导细胞特征表型ANP和Cx40表达。结果还发现，虽然内皮素1诱导12 d后转录因子Nkx2.5、GATA-4和MEF2C的表达水平均高于二甲基亚砜组，但心室肌特征结构因子MHC-α的表达水平却较弱。作者猜测这一方面因为诱导早期(第4-8天)二甲基亚砜组转录因子GATA-4和MEF2C的表达水平接近甚至部分还高于内皮素1组，从而能够协同作用使接下来MHC-α的表达水平在时间和程度上高于内皮素1组^[17]；另一方面也提示内皮素1组更为明显增高的Nkx2.5和Tbx5水平似乎更有利于促进靶基因Cx40表达而相对关闭MHC-α^[18-19]。Linhares等^[20]认为，Nkx2.5和GATA-4能够协同上调Cx40的表达而Tbx5则会阻碍Nkx2.5/GATA-4介导的Cx40调控作用；本实验结果尚不能对此作出明确判断。综合以上实验结果，作者认为：内皮素1能够上调Nkx2.5、Tbx5、GATA-4和MEF2C等心肌特征性转录因子的表达使P19细胞向早期心肌细胞分化；并且在此基础上升高更为明显的Nkx2.5和Tbx5表达水平进一步促进Cx40和ANP的表达从而使P19细胞完成向传导细胞分化。

内皮素1需要与特异性受体ET_A和ET_B结合而发挥生物学作用。研究发现，受体ET_A和ET_B在胚心中的表达范围不同：ET_A在胚心中广泛表达，而ET_B在心房和左心室的表达水平高于右心室^[21-23]。分布范围的不同意味着二者对心脏发育的影响也不尽相同。结果发现，特异性阻断ET_A受体(BQ123)或ET_B受体(BQ788)并不影响转录因子MEF2C和传导细胞特征性因子Cx40表达；并且，BQ123和BQ788均能够明显抑制内皮素1对MEF2C和Cx40的上调作用。与对照组相比，BQ123并不影响Nkx2.5表达水平；但BQ788则增加了Nkx2.5的表达水平，提示激活ET_B通路可能会抑制Nkx2.5表达。据此作者猜测，内皮素1主要通过ET_A通路上调了Nkx2.5和MEF2C表达水平从而诱导P19细胞向传导细胞分化。ET_B通路虽然也参与了上述基因的调控，但这里可能还存在一条ET_B参与的负反馈调节通路可以阻止过多的早期心肌细胞向以浦肯野细胞为代表的快传导细胞分化，这条通路可能在以窦房结和房室结为代表的慢传导系统所在区域发挥作用。

PI3K-AKT-mTOR信号通路主要包括磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等3个重要信号分子。研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号通路不仅能够维持胚胎干细胞存活和增殖，在诱导干细胞分化过程中也扮演了重要角色。PI3K-AKT-mTOR信号通路对于脂肪、骨骼、平滑肌以及神经元等间充质细胞的分化成熟密不可分^[24-27]。Wortmannin可透过细胞膜和P110催化亚基结合而特异性抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路上游分子PI3K，PP2抑制信号通路中游分子AKT磷酸化进而影响mTOR信号通路的激活，雷帕霉素则与FKBP12形成复合物后和mTOR结合而抑制信号通路下游蛋白的磷酸化和激活。作者发现，针对PI3K-AKT-mTOR信号通路的这3类特异性阻断剂均能明显抑制内皮素1对Nkx2.5和Cx40的上调作用。Nkx2.5是调控心肌细胞尤其是心脏传导细胞亚型分化的关键基因，Cx40则是识别心脏快传导细胞表型的重要标志。虽然没有进一步验证AKT激酶和mTOR通路下游基因的磷酸化水平，但根据以上结果也可以推测，内皮素1能够通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控Nkx2.5基因的表达水平进而影响传导细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程