Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0753

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胚胎干细胞：是从早期胚胎内细胞团或原始性腺中分离出来的一类全能性细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，在适当的培养条件下，可被诱导分化为三胚层来源的多种细胞类型，包括神经细胞等。由于其具有多向分化的特性，不仅作为细胞模型体外研究细胞分化和发育调控机制，而且作为一种治疗工具，应用于各种组织修复和疾病治疗的手段。
Y-27632：是一种广泛应用的、高效的Rho相关卷曲蛋白激酶抑制剂，不仅参与了细胞内多种信号通路和调控细胞多种功能，包括：通过控制肌动蛋白骨架的组装调节细胞生长、黏附、迁移、凋亡等，同时能够调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用。此外，Y-27632对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用。

摘要
背景：Y-27632是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶抑制剂，已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用。另外，其对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用。而如何提高胚胎干细胞向类神经元细胞分化是神经损伤修复和神经再生领域热点问题。
目的：探讨Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞分化效率的作用。
方法：取16代人胚胎干细胞复苏后，进行形态观察和染色鉴定，采用悬浮培养法制备类胚体，培养8 d后, 进行分组贴壁培养：对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化；Y-27632组分别在Sato培养基加入5，10，20，40 μmol/L Y-27632。培养10 d后进行染色鉴定；10-18 d后，进行免疫荧光染色检测胚胎干细胞分化效率和类神经元细胞突起生长情况。
结果与结论：①人胚胎干细胞共表达Oct4和SSEA-3干细胞特异蛋白；②悬浮分化培养8 d后，进一步贴壁培养10 d，可观察到具有神经形态，且表达Tuj-1的类神经元细胞；③经不同浓度的Y-27632诱导后，免疫荧光染色发现贴壁细胞数和Tuj-1阳性细胞数显著增加，提示胚胎干细胞向类神经元细胞分化速率加快，且在浓度为10 μmol/L时最为明显；④分化培养18 d后，免疫荧光染色显示，与对照组相比，10 μmol/L Y-27632组的Tuj-1阳性细胞数及突起数和突起长度显著增加；⑤结果说明，Y-27632不仅能够促进人胚胎干细胞向类神经元细胞分化，同时促进类神经元细胞突起的生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9096-1926(何大艳)

关键词: 胚胎干细胞, 类胚体, 诱导分化, Y-27632, 神经突起, Tuj-1, 细胞培养, 细胞分化, 免疫荧光染色, 神经损伤, 神经修复, 神经再生, 细胞鉴定

Abstract:

BACKGROUND: Y-27632 is a Rho-associated coil-formed protein kinase inhibitor that can regulate the self-renewal of stem cells, promote clonal formation and cell survival, and regulate and protect neuronal cell growth and development. How to improve the differentiation efficiency of embryonic stem cells into neuron-like cells is highly important for nerve injury repair and nerve regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Y-27632 on the differentiation efficiency and function of human embryonic stem cells into neuron-like cells.
METHODS: After resuscitation, human embryonic stem cells at passage 16 were subjected to morphological observation and staining identification. The embryoid bodies were prepared by suspension culture, and after 8 days of incubation, the cells were cultured in Sato medium containing different concentrations of Y-27632 (0, 5, 10, 20, 40 μmol/L) for 10 days and identification by staining. After induction for 18 days, the differentiation efficiency and neurite outgrowth were identified by immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The human embryonic stem cells co-expressed Oct4 and SSEA-3 stem cell specific markers. After suspension culture for 8 days and further adherent culture for 10 days, the cells could be differentiated into neuron-like cells with neurogenic morphology and expressing Tuj-1. Y-27632, especially at a concentration of 10 μmol/L, not only promoted cell proliferation (a significant increase in adherent cells an Tuj-1 positive cells), but also facilitated cell differentiation into neurons. Immunofluorescence staining findings showed that 10 μmol/L Y-27632 significantly increased the number of Tuj-1 positive cells and neurites and the length of neurites after 18 days of differentiation. These results indicate that Y-27632 not only promotes the differentiation of human embryonic stem cells into neuron-like cells, but also accelerates neurite outgrowth.

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Key words: Embryonic Stem Cells, Cell Differentiation, Nerve Regeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

何大艳，杨玉红. Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2063-2067.

He Da-yan, Yang Yu-hong. Y-27632 promotes differentiation of human embryonic stem cells into neuron-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2063-2067.

图/表（结果） 1

2.1 人胚胎干细胞形态及鉴定 人胚胎干细胞一直保持未分化状态，主要以集落形式贴壁生长，细胞排列紧密，克隆边缘清晰(图1A)。Oct4和SSEA-3是人胚胎干细胞未分化状态的重要检测指标，细胞传代后24 h，利用免疫荧光法对细胞行染色鉴定，胚胎干细胞基本都为双阳性，且与细胞核共定位(图1B-E)，说明胚胎干细胞保持未分化的状态。

2.2 人胚胎干细胞诱导分化后的细胞形态观察和荧光染色鉴定 人胚胎干细胞经胰蛋白酶消化后，采用细菌培养皿进行悬浮分化培养，加入神经分化培养液，每天换液，培养8 d后，选取形态规则，细胞分布紧密的类胚体(图2A)，放入多聚赖氨酸预处理的培养皿中进行贴壁分化培养，加入Sato诱导培养基培养10 d后，利用免疫荧光法对细胞进行神经细胞特异蛋白Tuj-1染色鉴定，结果显示，有部分细胞具有类神经元形态，且表达Tuj-1(图2B)，说明胚胎干细胞能够向类神经元细胞分化。

2.3 Y-27632促进胚胎干细胞向类神经细胞元分化的免疫荧光染色鉴定 类胚体细胞诱导分化过程中，加入不同浓度的Y-27632(0，5，10，20，40 μmol/L)，培养10 d后，进行免疫荧光染色并观察，Y-27632不仅能够促进细胞增殖(图3A)，同时促进细胞向类神经元细胞分化速率(图3B，C)，且在浓度为10 μmol/L时最为显著。

2.4 诱导后细胞形态观察和免疫荧光检测 将类胚体培养18 d后，行免疫荧光染色观察，对照组和10 μmol/L Y-27632组的胚胎干细胞均能够向类神经元细胞分化，然而10 μmol/L Y-27632组的阳性细胞数明显多于对照组，且类神经元细胞突起更多、更长(图4)，说明Y-27632不仅促进胚胎干细胞向类神经元细胞分化，同时促进类神经元细胞突起的生长。

2.5 诱导后类神经元细胞突起数和长度检测 类胚体诱导分化18 d后，对阳性表达Tuj-1的细胞进行突起数和突起长度统计，结果显示，10 μmol/L Y-27632处理后，显著增加了每一个细胞的突起数和突起长度(图5)，说明Y-27632促进类神经元细胞突起的生长。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞形态学观察。

1.2 时间及地点 实验于2015年12月至2017年2月在滁州市第一人民医院神经内科完成。

1.3 材料

实验用主要试剂：Y-27632(中国，上海赛鑫生物公司)；人白血病抑制因子(美国，Sigma公司)；Anti-Oct4、SSEA-3、Tuj-1、NeuN抗体(美国，Abcam公司)；Anti-Mouse/Rabbit荧光二抗，Hoechst(美国，TermoFisher公司)；新生牛血清(中国，四季青公司)；胚胎干细胞培养基，血清(美国，GIBCO公司)；MEM丙酮酸，HEPES(美国，Sigma公司)。

实验用主要仪器：倒置相差荧光显微镜TI(日本，尼康公司)。

1.4 方法

1.4.1 人胚胎干细胞培养及分化 取16代人胚胎干细胞(上海钰博生物科技有限公司)进行复苏，将其接种于铺有小鼠饲养层细胞的6孔培养板中，加入人胚胎干细胞培养基，置于体积分数5% CO₂ 37 ℃培养箱中，每天换液，每2 d进行传代。利用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况及细胞形态。

1.4.2 人胚胎干细胞向类神经细胞分化培养 采用细菌培养皿对消化的人胚胎干细胞进行悬浮培养。在不含人白血病抑制因子和β-巯基乙醇的诱导培养基中培养4 d后，在诱导培养基中加入5×10^-7 mol/L维甲酸继续培养4 d，选取形态规则，大小均一的类胚体于多聚赖氨酸预处理的24孔培养板中，加入含有或不含Y-27632的Sato分化培养基(体积分数5%胎牛血清，5%新生牛血清，100 mmol/L MEM丙酮酸，1 mol/L HEPES，DMEM)进行分化培养，每天换液，5-10 d后利用倒置相差显微镜观察细胞形态。

1.4.3 实验分组 将类胚体分为2组：对照组和Y-27632组，对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化，Y-27632组为Sato培养基分别加入5，10，20，40 μmol/L Y-27632，培养10和18 d后，进行免疫荧光染色观察。

1.4.4 生物学特性鉴定

人胚胎干细胞免疫荧光染色鉴定：将状态良好的人胚胎干细胞消化后铺于多聚赖氨酸预处理的玻片上进行细胞爬片，培养过夜后，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；体积分数0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；体积分数1% 牛血清室温孵育30 min后，分别加入1∶200稀释的抗-SSEA-3，抗-Oct4一抗，抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；1∶100稀释的抗鼠或抗兔荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min；Hoechst避光染色10 min，PBS洗3遍后，用抗淬灭封片剂封固，荧光显微镜下观察细胞荧光。

人胚胎干细胞诱导分化后免疫荧光染色鉴定：人胚胎干细胞向类神经元细胞诱导分化10或18 d后，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；体积分数0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；体积分数1% 牛血清室温孵育30 min后，诱导分化10 d的细胞加入1∶200稀释的Anti-Tuj-1，诱导分化18 d的细胞加入1∶200稀释的Anti-Tuj-1和Anti-NeuN一抗进行双标，抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；1∶100稀释抗鼠或抗兔荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min；Hoechst避光染色10 min，PBS洗3遍后，用抗淬灭封片剂封固，荧光显微镜下观察，利用ImageJ软件对诱导分化10 d；细胞的Tuj-1阳性细胞和细胞核进行计数和统计分析；观察Y-27632对细胞增殖和分化的影响。

诱导的类神经元细胞突起和长度的鉴定：对诱导分化18 d的胚胎干细胞进行免疫荧光染色后，利用ImageJ软件对Tuj-1和NeuN染色双阳性的细胞进行突起计数并统计分析；同时对每个细胞的突起进行测量，根据标尺计算突起长度并以细胞为单位进行统计，分析Y-27632对类神经元细胞突起长度的影响。

1.5 主要观察指标 ①人胚胎干细胞形态；②神经元特异蛋白Tuj-1和NeuN染色在人胚胎干细胞中的阳性表达率；③类神经元细胞的突起数和突起长度。

1.6 统计学分析 实验数据采用Image J软件进行采集，利用统计分析软件GraphPad Prism分析，所得数据采用x(_)±s来表示。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

胚胎干细胞分化为神经细胞经历2个过程：首先是形成具有三胚层结构的类胚体，即生物物理状态胚胎干细胞的聚集；再经过生物化学信号诱导，致使胚胎干细胞定向分化为神经细胞^[16-18]。目前，常用的诱导方法有维甲酸诱导、生长因子诱导、直接分化法等^[19]。其中，维甲酸是一种很强的分化诱导剂，在不同作用浓度和作用阶段可分化为多种细胞类型。“4^-/4⁺”诱导法已广泛应用于胚胎干细胞向类神经元细胞的诱导^[20]：即让胚胎干细胞在没有抑制分化因子如人白血病抑制因子、β-巯基乙醇的培养液中形成类胚体，4 d后在培养基中加入10 mmol/L维甲酸，再诱导4 d，之后通过贴壁培养进一步的诱导分化。在经维甲酸诱导4 d后，类胚体中出现了神经样细胞^[21-22]。然而，由于胚胎干细胞较脆弱，经历了酶和机械损伤后，后期贴壁培养过程中，极易出现部分细胞凋亡，且影响诱导效率和诱导的神经细胞生长状态，为后期机制研究和临床应用带来了困难。

ROCK是Rho GTP酶下游一个重要的效应器，Rho GTP酶参与调节神经细胞形态发生，包括迁移，轴突产生和极性等。有研究揭示，ROCK抑制剂不仅对干细胞的自我更新、克隆形成和存活具有调节作用，同时对中枢神经系统疾病具有治疗作用^[23-28]。此外，ROCK抑制剂对干细胞分化也有一定的调控作用；有报道ROCK抑制剂Y-27632能促进成体间充质干细胞向神经样细胞的分化^[29-30]。因此，实验通过经典“4^-/4⁺”诱导法，观察Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞诱导效率和诱导的神经细胞生长状态的影响。

实验中，采用无人白血病抑制因子和β-巯基乙醇的培养液中悬浮培养，4 d后出现较小的细胞团且有逐渐增大和增多的趋势；加入维甲酸继续培养4 d后，可见大小均一、形态致密的类胚体形态细胞团。将类胚体消化后，接种于多聚赖氨酸预处理的培养板中，与对照组相比，加入Y-27632后，贴壁的细胞明显增加，且与浓度呈正相关。培养5-10 d后，即可观察到神经样细胞，且Y-27632组明显多于对照组，在10 μmol/L浓度下，Tuj-1阳性细胞率最为显著。与此同时，Y-27632显著增加类神经元细胞突起数和突起长度。
综上所述，在传统诱导过程中，Y-27632的加入不仅抑制细胞凋亡，增加胚胎干细胞向类神经元细胞诱导的效率，同时显著促进了类神经元细胞突起的生长。这为改善胚胎干细胞诱导分化质量和神经退行性疾病的治疗提供了新的思路和方法。

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