结直肠癌干细胞增殖及侵袭中ABCG2基因的效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0503

摘要/Abstract

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文题释义：
ABCG2转运蛋白：是一种与肿瘤MDR有关的新的药物出泵，具有维持结直肠癌干细胞稳定性功能，并且低氧环境下ABCG2上调能增加结直肠癌干细胞对于化疗药物的抗药性能。
结直肠癌患者预后不良的主要因素：由于结直肠癌干细胞的激进局部增长模式和高强度侵袭性引起。结直肠癌干细胞的侵袭涉及一系列复杂的宿主与肿瘤相关过程，包括肿瘤细胞转移与肿瘤基质分解。而细胞外基质(ECM)分解则是结直肠癌肿瘤细胞侵袭的前提条件，能为转移细胞提供了途径。

摘要
背景：ABCG2转运蛋白能介导多重耐药，高表达ABCG2蛋白能提高干细胞对于化疗药物的耐受性，但是ABCG2基因对结直肠癌干细胞增殖、侵袭机制尚未证实。
目的：探讨ABCG2基因在结直肠癌干细胞增殖、侵袭中的作用。
方法：常规培养结直肠癌细胞系HCT116，将其随机分为4份：其中2份采用免疫磁珠法分离CD133阳性细胞(结直肠癌干细胞)，分别用ABCG2-siRNA和ABCG2过表达质粒转染，构建结直肠癌干细胞ABCG2蛋白低表达与过表达模型，设为ABCG2蛋白低表达和过表达组；另2份HCT116细胞分别设为细胞正常组、空质粒转染后对照组。用MTT、Transwell法测定不同模型下结直肠癌干细胞的增殖、侵袭变化；利用酶联免疫吸附实验及PCR法测定两种不同细胞模型下基质金属蛋白酶与mRNA表达水平。
结果与结论：①流式细胞仪检测显示CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占2.4%，经免疫磁珠分选纯化后其比例升至94.51%，证实分离培养的细胞为结直肠癌干细胞；②转染前4组细胞MTT值比较无差异(P > 0.05)；ABCG2蛋白低表达细胞模型转染后MTT值低于过表达组(P < 0.05)；③Transwell结果表明：ABCG2蛋白低表达组细胞迁移能力受到明显的抑制；而ABCG2过表达组穿过基底膜数目相对较多，细胞的迁移及侵袭能力明显增强(P < 0.05)；④酶联免疫吸附实验显示ABCG2蛋白低表达组基质金属蛋白酶水平低于过表达组(P < 0.05)；PCR测试mRNA结果与酶联免疫吸附实验相似；⑤提示：下调ABCG2蛋白表达能抑制结直肠癌干细胞增殖、侵袭，ABCG2基因通过调控基质金属蛋白酶水平影响结直肠癌干细胞活性。

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ORCID: 0000-0001-6309-8699(孙锋)

关键词: ABCG2基因, 结直肠癌, 干细胞增殖, 基质金属蛋白酶, 酶联免疫吸附实验, PCR法, 质粒转染, 免疫磁珠法

Abstract:

BACKGROUND: ABCG2 transporter can mediate multidrug resistance. ABCG2 overexpression can enhance the tolerance of stem cells to chemotherapeutic drugs. However, the mechanism of ABCG2 gene in the proliferation and invasion of colorectal cancer stem cells has not been confirmed.
OBJECTIVE: To investigate the role of ABCG2 gene in the proliferation and invasion of colorectal cancer stem cells.
METHODS: Colorectal cancer cell lines HCT116 were routinely isolated and cultured, and were randomly divided into four groups. CD133 positive cells were isolated by immunomagnetic beads method, and were transfected with ABCG2-siRNA and ABCG2 overexpression plasmids to construct colorectal cancer stem cell models with ABCG2 low expression and overexpression, and were set as low expression group and overexpression groups, respectively. The remaining HCT116 cells were set as normal and empty plasmid transfected control groups. The proliferation and invasion of colorectal cancer stem cells in different models were determined by MTT assay and Transwell assay, respectively. Expressions of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) mRNA and protein were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR), respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Flow cytometry results showed that: CD133 positive cells in colorectal cancer cell line HCT116 accounted for 2.4%, while increased to 94.51% of the cell line after being sorted by immunomagnetic beads, suggesting that isolated and cultured cells were colorectal cancer stem cells. (2) MTT assy showed no significant difference between the four groups of cells prior to the cell transfection (P > 0.05). However, MTT value in the low expression group was significantly lower than that in the overexpression group after cell transfection (P < 0.05). (3) Results from the Transwell assay showed that the cells in the low expression groups did not have the ability of migration; on the contrary, in the overexpression group, the number of cells crossing the basement membrane was relatively increased and the ability of cell migration and invasion was enhanced significantly (P < 0.05). (4) The MMP-9 protein level was lower in the low expression group than in the overexpression group (P < 0.05). Similar results were yielded in the PCR detection. To conclude, down-regulation of ABCG2 protein expression can inhibit colorectal cancer stem cell proliferation and invasion. ABCG2 gene can change the viability of colorectal cancer stem cells by regulating the MMP-9 expression.

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Key words: Colorectal Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Matrix Metalloproteinase 9, Transfection, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

孙锋. 结直肠癌干细胞增殖及侵袭中ABCG2基因的效应[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2057-2062.

Sun Feng. Role of ABCG2 gene in proliferation and invasion of colorectal cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2057-2062.

图/表（结果） 1

2.1 CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中的比例及免疫磁珠鉴定结果 流式细胞仪检测结果表明：CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占2.4%，与其他肿瘤干细胞分布具备类似的特点，提示：分离培养的细胞为结直肠癌干细胞。免疫磁珠法鉴定结果表明：经免疫磁珠分选纯化后CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占94.51%，见图1。

2.2 ABCG2蛋白低表达与过表达模型细胞MTT结果比较 ABCG2蛋白低表达组、过表达组、空质粒转染后对照组及细胞正常组转染前MTT结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)；空质粒转染后对照组和细胞正常组转染后MTT结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)；ABCG2蛋白低表达细胞模型转染后MTT值低于过表达组(P < 0.05)，见表1。

2.3 不同模型下细胞迁移、侵袭能力结果比较 由于细胞正常组与空质粒转染后对照组未参与建模，细胞不具备迁移、侵袭能力，未进行迁移、侵袭能力试验。ABCG2蛋白过表达与低表达组Transwell法结果表明：ABCG2蛋白低表达细胞模型下细胞穿过基底膜的数目较少，细胞迁移能力受到明显的抑制；而ABCG2过表达细胞模型细胞穿过基底膜数目相对较多，细胞的迁移及侵袭能力得到明显的增强(P < 0.05)，见表2和图2。

2.4 各组细胞MMP-9与mRNA表达水平比较 酶联免疫吸附结果 ABCG2蛋白低表达组MMP-9阳性率低于ABCG2蛋白过表达组(t=10.294，P < 0.05)、高于空质粒转染后对照组和细胞正常组(t=14.692，8.385，P < 0.05)，见图3。

PCR结果表明：ABCG2蛋白低表达组MMP-9 mRNA活性较低，而ABCG2蛋白过表达组MMP-9 mRNA活性显著增强，ABCG2基因调控结直肠癌干细胞MMP-9活性有关，见图4。

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引言

结直肠癌属于全球发生率较高的恶性肿瘤之一，每年约有140万新确诊病例，超过60万患者死于结直肠癌，而中国结直肠癌发生率也呈上升及年轻化趋势，严重影响居民健康^[1]。目前，临床上对于结直肠癌以外科手术、放化疗为主，虽然能提高患者生存率，但是对于晚期或发生远处转移患者治疗尚未取得突破性进展^[2]。国内学者研究表明：结直肠癌环绕肠一周需要1.5年^[3]，且癌细胞过度增殖、肿瘤细胞转移、侵袭是患者生存率降低的重要原因，如何采取有效的措施抑制癌细胞的生长、转移，促进结直肠癌细胞增殖对改善预后具有重要的意义^[4]。结直肠癌发病机制复杂，其发生、发展及侵袭转移是一个多因素过程，涉及多种基因、产物的相互作用，而原癌基因的激活及其下游信号通路的异常传导发挥了重要的作用^[5]。

结直肠癌患者预后不良主要是由于结直肠癌干细胞的激进局部增长模式和高强度侵袭性引起。结直肠癌干细胞的侵袭涉及一系列复杂的宿主与肿瘤相关过程，包括：肿瘤细胞转移与肿瘤基质分解^[6]。而细胞外基质(ECM)分解则是结直肠癌肿瘤细胞侵袭的前提条件，能为转移细胞提供了途径。结直肠癌患者发病后基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)在内诸多不同蛋白水解酶在肿瘤生长过程中呈过度表达，能分解、摧毁周围组织基质蛋白，能消除转移、侵袭的结构障碍^[7]。

肿瘤干细胞与耐药性研究是国际前沿研究的热点，结直肠癌的耐药性是由于化疗药物难以清除肿瘤干细胞，少许的干细胞能在初次治疗后重新形成肿瘤，并且多数复发的肿瘤均具有多药耐药性^[8]。ABCG2转运蛋白是一种与肿瘤MDR有关的新的药物出泵，具有维持结直肠癌干细胞稳定性功能，并且低氧环境下ABCG2上调能增加结直肠癌干细胞对于化疗药物的抗药性能^[9-10]。国内学者研究表明：ABCG2表达与结直肠癌干细胞化疗效果关系密切，ABCG2表达水平越高，化疗效果越差^[11]。同时，ABCG2转运蛋白能介导多重耐药，高表达的ABCG2能提高结直肠癌干细胞耐受性，而降低ABCG2表达能促进结直肠癌干细胞对于化疗药物的敏感性，但是ABCG2基因在结直肠癌干细胞增殖、侵袭中的作用存在争议。

因此，本课题以购置的结直肠癌细胞系 HCT116作为研究对象，探讨ABCG2基因在结直肠癌干细胞增殖、侵袭中的作用及机制，报道如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 干细胞制备及处理实验。

1.2 时间及地点 于2015年3月至2016年4月在广州中医药大学第一附属医院完成。

1.3 材料 课题使用仪器和试剂主要有：低温冰箱(美国 Thermo公司)、DMEM/F12细胞培养液(美国Gibco)、倒置相差显微镜成像系统(德国蔡司)、Eppendoff高速冷冻离心机(美国 Eppendoff公司)、流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯光学株式会社)、酶标仪、Real-time PCR仪、超净工作台(苏州净化制品有限公司)、.25%胰酶和1 mmol/L EDTA消化液(北京索莱宝生物有限公司)、DMEM-F12培养基(美国Gibeco生物公司)、结直肠癌细胞系HCT116(广州中医药大学基研所细胞库)。

1.4 方法

1.4.1 结直肠癌细胞分离培养 取购置的结直肠癌细胞系HCT116(该细胞系是一种能全面模拟结直肠癌细胞生理活性的细胞系)，将细胞放置在DMEM-F12培养基(1.2 mmol/L硫代甘油、2 mmol/L甘氨酸、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、体积分数10%胎牛血清)中连续进行5 d培养，然后将细胞种植在6孔板培养瓶中，将其放置在37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中。待细胞融合80.0%后开始对细胞进行传代培养，倒置显微镜下观察细胞形成，待细胞形态从伸展状态回缩到卵圆形时加入DMEM-F12培养基种植胰酶消化，反复吹打后保证细胞均匀。取细胞悬液，去除上层清液，离心后再次加入DMEM-F12培养基，将其分装在培养瓶中，备用^[12]。

1.4.2 CD133阳性细胞分离 采用免疫磁珠法分离CD133阳性细胞。取上述分离培养的结直肠癌细胞，加入0.25%胰酶与1 mmol/L EDTA消化液完成细胞消化，取对数生长的结直肠癌细胞，PBS冲洗悬浮后制备300 μL细胞悬液。向细胞内加入100 μL FcR阻断剂，加入100 μL CD133标记的微磁珠，完成细胞亚群的分离，充分混合后静置30 min，温度为4 ℃；向混合后细胞中加入1.0-2.0 mL buffel缓冲液，10 min离心，速度为5 000 r/min，加入500 μL的buffle缓冲液，制成1×10⁸ L^-¹细胞悬液；向微分选器中放置合适的LS分选柱，缓慢加入细胞(避免产生气泡)，完成CD133阳性细胞的收集。向分选柱中加入1 mL MACS缓冲液，利用分选柱配备活塞压出磁珠标记的阳性细胞。取 100 μL CD133阳性细胞，调整细胞悬液2×10⁵加入10 μL 133/2-PE混合均匀，10 min避光孵育，加入buffle缓冲液，10 min离心，速度为3 000 r/min^[13-14]。

1.4.3 结直肠癌干细胞ABCG2蛋白低表达与过表达模型建立 取分离培养的CD133阳性细胞，按5×10⁶的密度接种在6孔板中，待细胞生长融合到70.0%时换用不含有FBS的DMEM/F12细胞培养液，分别向细胞中加入100 pmol ABCG2 siRNA与FAM siRNA及50 mL不含FBS的DMEM-F12培养基，放入DMEM-F12培养基，利用移液器轻柔后吹打，室温下进行20 min孵育，然后放入37 ℃ 浓度5%CO₂培养箱中，荧光显微镜观察CD133阳性细胞是否转染成功^[15]。

取另2份购置的结直肠癌细胞系HCT116分别设为细胞正常组、空质粒转染后对照组。

1.4.4 ABCG2基因在结直肠癌干细胞增殖、侵袭中的作用 利用MTT、Transwell法测定不同模型下结直肠癌干细胞的增殖、侵袭变化。

MTT实验：取ABCG2蛋白低表达与过表达模型细胞，每孔中接种10³-10⁴细胞，对细胞进行常规消化后制备细胞悬液，并将细胞接种在96孔板中，放置在培养箱中。待细胞贴壁后利用移液器去除每孔中的细胞培养液，连续进行72 h培养液向每孔中加入5 g/L MTT，继续进行4 h培养，向每孔中加入150 μL DMSO，混合均匀15-20 min后测量，倒置显微镜下观察细胞增殖数量。

Transwell法：利用直径为6.5 mm、孔径为8 μm的Transwell小室完成细胞迁移、侵袭能力测定。取ABCG2蛋白低表达与过表达模型细胞，以5×10⁴/孔密度接种在上室，加入0.6 μLDMEM培养液，实验进行时在上室底部预铺1 g/mL的Matrigel胶，连续进行24 h培养，温度控制在37 ℃，24 h后利用棉签将上室中未侵袭的细胞去除，对于侵袭到基底膜背面细胞利用0.1%结晶紫进行30 min染色，倒置显微镜下观察细胞侵袭数量^[16-17]。

1.4.5 MMP-9与mRNA表达水平测定

MMP-9表达水平：利用酶联免疫吸附试验测定ABCG2蛋白低表达与过表达模型细胞，有关操作严格遵循仪器操作说明书完成。

MMP-9 mRNA表达：采用PCR法测定两种不同细胞模型下MMP-9mRNA表达水平。取两种不同细胞模型下的细胞，调整细胞密度5×10⁵个/孔，待细胞融合90.0%-95.0%后加入不含FBS的DMEM-F12培养基，连续进行12 h培养，完成结直肠癌干细胞转染操作后去除DMEM-F12培养基，利用Trizol提取两组细胞总mRNA^[18-19]。设置反转录条件：16 ℃下30 min，42 ℃下30 min，85 ℃下5 min，最后在4 ℃下保持恒温，将反转录产物采用RT-PCR系统完成定量检测，保证整个反应体系为20 μL，设置PCR检测反应条件：95 ℃下10 min，95 min下15 s，60 ℃下1 min，连续进行40个循环。最后通过PCR自带软件获得基线与阈值后，将miR16作为内参，读取相应miR16、miR21循环阈值，计算两种循环阈值，从而获得mRNA值。

1.5 主要观察指标 ①观察CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中的比例及免疫磁珠鉴定情况；②观察ABCG2蛋白低表达与过表达模型细胞MTT结果；③观察ABCG2蛋白低表达组与过表达组细胞迁移、侵袭数量；④观察不同模型下细胞MMP-9与mRNA表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n/%表示，行卡方检验，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

结直肠癌具有较高的发病率，居全球癌症的第3位，且临床上尽管外科手术、放化疗等治疗方法不断更新、完善，但是难以取得预期的治疗效果，而肿瘤的复发与转移是造成结直肠癌治疗失败的根本原因^[20]。ABC转运家族是目前发现成员最多的快转运蛋白家族，属于ATP依赖性的转运分子，转运过程中在消耗ATP的同时能将代谢物、细胞内剩余的营养物质及药物等转运到细胞外^[21]。而ABCG2蛋白属于ABC家族的重要成员，具有保守性和五中间同质性等多种作用，能在侧群细胞表面呈高表达状态。国内学者研究表明：ABCG2蛋白能调控干细胞的增殖、侵袭，不仅能作为分离、鉴定细胞的重要标志物，并且加强ABCG2蛋白水平调控能实现干细胞生物学行为干预^[22]。本课题中，应用结直肠癌细胞系HCT116完成结直肠癌干细胞的分离、制备，结果表明：流式细胞仪检测CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占2.4%，与其他肿瘤干细胞分布具备类似的特点，经免疫磁珠分选纯化后CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占94.51%，由此看出：课题中分离培养的细胞为结直肠癌干细胞，能为实验进行奠定基础。

目前，临床上研究更多的集中在ABCG2基因表达水平与肿瘤细胞恶性行为的关系，并且取得突破性进展。国内学者研究表明：在多数实体肿瘤中均能发现ABCG2蛋白表达，并且均呈高表达^[23]。国外学者研究表明：利用ABCG2-siRNA能下调ABCG2蛋白表达，有助于降低肿瘤干细胞的增殖能力及增殖水平^[24]。本研究中，转染前各组细胞MTT结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)；空质粒转染后对照组和细胞正常组MTT结果差异无显著性意义(P > 0.05)；而转染后ABCG2蛋白低表达组MTT值低于ABCG2蛋白过表达组(P < 0.05)；Transwell结果表明ABCG2蛋白低表达组穿过基底膜的数目较少，而ABCG2蛋白过表达组细胞穿过基底膜数目相对较多，不同模型下Transwell法结果比较有统计学意义(P < 0.05)，提示下调ABCG2蛋白表达能抑制结直肠癌干细胞增殖、侵袭。国内学者研究表明：在结直肠癌干细胞表明存在ABCG2基因表达，并且ABCG2基因表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关性^[25]。分子生物学研究进一步揭示了ABCG2基因活性与结直肠癌生物学行为的相关性。国外学者分别从不同的角度阐明：ABCG2能调节PTEN/PI3K/AKt细胞信号通路，影响边缘细胞类型的转换^[26-27]。同时，过度的ABCG2表达会加剧结直肠癌干细胞的增殖与侵袭，对患者治疗预后具有明显的影响。从本课题结果看出：CD133阳性的直肠癌细胞系HCT116中ABCG2蛋白呈高表达，但是结直肠癌干细胞ABCG2蛋白低表达模型经过转染后ABCG2蛋白开始下调，并且干细胞的增殖、侵袭及增殖能力得到明显的抑制。

MMP-9属于是一种明胶酶，能降解V型胶原蛋白^[28]。国内学者研究表明：在几乎所有的恶性肿瘤中均存在MMP-9表达，并且其表达水平与肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移有关^[29]。本研究中，ABCG2蛋白低表达细胞模型下MMP-9水平低于ABCG2蛋白过表达组(P < 0.05)；PCR结果表明：ABCG2蛋白低表达细胞模型下MMP-9 mRNA活性较低，而ABCG2过表达细胞模型下MMP-9 mRNA活性显著增强，ABCG2基因调控结直肠癌干细胞MMP-9活性有关。国内学者研究表明：MMP-9在肿瘤细胞增殖、分化、早期浸润等多种方面均能发挥调节作用。国外学者研究表明：过度表达的MMPS及活性增加有助于促进结直肠癌干细胞的浸润、迁移与增殖^[30]。本课题结果看出：下调ABCG2蛋白表达能降低结直肠癌干细胞内的MMP-9水平，从而能抑制细胞的侵袭和转移。

但是，本课题尚存在诸多不足，虽然证实ABCG2与MMP-9之间存在紧密的关系，能上调或抑制结直肠癌干细胞的生物行为，但是课题中并未涉及具体的分子生物学机制，均需要进一步研究与探讨。

综上所述，下调ABCG2蛋白表达能抑制结直肠癌干细胞增殖、侵袭，ABCG2基因通过影响机制金属蛋白酶水平影响结直肠癌干细胞活性，针对ABCG2基因靶向治疗结直肠癌可能具有广泛应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程