法舒地尔干预原代神经干细胞的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1638

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
法舒地尔：是一种ROCK抑制剂，已被证实能减轻蛛网膜下腔出血、脊髓损伤、脑卒中和帕金森病等一系列中枢神经系统疾病的临床症状，是目前唯一经临床批准的用于中枢神经系统疾病治疗的ROCK抑制剂。法舒地尔不仅可通过将小胶质细胞转变为促进组织修复的抗炎性M2表型细胞来延缓疾病的进展并减轻严重程度，还可以通过激活星形胶质细胞分泌粒细胞集落刺激因子并抑制谷氨酸诱导的神经毒性。在体外缺血模型中法舒地尔对神经元具有保护作用并动员内源性神经干细胞增殖，还能通过抑制神经干细胞凋亡来提高细胞存活率。近年来的研究也表明，法舒地尔在体内可动员内源性神经干细胞增殖，在体外诱导永生化的神经干细胞分化为神经元与神经胶质细胞。然而，法舒地尔对原代培养的神经干细胞增殖与分化的影响及其可能机制则鲜有报道。
神经干细胞：在成人大脑中，神经干细胞主要存在于齿状回和侧脑室的脑室下区等。内源性神经干细胞的增殖与分化在脑损伤时明显增加，神经干细胞通过自我修复取代受损细胞，新生的细胞迁移到受损区域，分化为功能性神经元和神经胶质细胞。然而，中枢神经系统的自我修复能力不足以治疗神经损伤或退行性疾病。虽然神经营养因子通过促进内源性神经干细胞增殖与神经元形成在中枢神经系统疾病及创伤治疗中具有潜力，却由于血脑屏障的存在限制了其应用。如何影响神经干细胞的增殖与分化一直是神经系统疾病治疗的研究热点。

摘要
背景：受损大脑和脊髓的自我修复能力有限，寻找促进神经干细胞增殖与分化的潜在治疗剂，对神经系统疾病的干细胞治疗具有重要意义。
目的：探讨法舒地尔对原代神经干细胞增殖及分化的影响及其可能机制。
方法：体外分离、培养15 d龄胎鼠脑组织获得神经干细胞，免疫荧光检测细胞中Nestin的表达；以不同浓度(50，100，200 µmol/L)法舒地尔干预神经干细胞 24，48，72 h，MTT检测细胞增殖率，流式细胞术检测细胞凋亡率；进一步应用凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂、自噬抑制剂、坏死抑制剂、凋亡诱导剂、铁死亡诱导剂干预神经干细胞，MTT检测细胞增殖率，生化法检测细胞丙二醛水平；最后，应用200 µmol/L法舒地尔干预神经干细胞10 d，Western blot和免疫荧光检测神经干细胞中Nestin、DCX、MAP-2、GFAP蛋白的表达。
结果与结论：①分离培养的原代神经干细胞表达Nestin；②随着法舒地尔浓度升高及作用时间延长，神经干细胞的增殖率逐渐增高(P < 0.05)；③凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂可提高神经干细胞的增殖率(P < 0.05)；④法舒地尔可提高凋亡诱导剂和铁死亡诱导剂干预的神经干细胞的增殖率(P < 0.05)；⑤法舒地尔和铁死亡抑制剂均能降低神经干细胞中丙二醛水平，铁死亡诱导剂则使神经干细胞中丙二醛水平升高(P < 0.05)；⑥经法舒地尔处理后，神经干细胞中DCX和GFAP蛋白的表达升高，Nestin的表达降低(P < 0.05)；⑦结果表明，法舒地尔可通过抑制凋亡与铁死亡提高神经干细胞的存活，并能促进神经干细胞增殖及向神经元样细胞与神经胶质细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7866-534X(孙婉莹)

关键词: 神经干细胞, 法舒地尔, 神经干细胞增殖, 神经干细胞凋亡, 神经元样细胞, 铁死亡, 神经胶质细胞

Abstract:

BACKGROUND: The self-repairing ability of damaged brain and spinal cord is limited. It is important to search for potential therapeutics to promote the proliferation and differentiation of neural stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of fasudil on the proliferation and differentiation of primary cultured neural stem cells and its potential mechanism.
METHODS: Neural stem cells were obtained from the brain tissue of 15-day-old fetal rats in vitro. The expression of Nestin in the cells was detected by immunofluorescence. After treatment with fasudil at different concentrations (50, 100, 200 µmol/L) for 24, 48 and 72 hours, the proliferation rate of neural stem cells was detected by MTT, and the apoptosis rate was detected by flow cytometry. After further treatment with autophagy inhibitor, necrosis inhibitor, apoptosis inducer and ferroptosis inducer, the proliferation rates of neural stem cells were detected by MTT and the levels of malondialdehyde were detected by biochemical method. The expression of Nestin, doublecortin, microtubule- associated protein and glial fibrillary acidic protein in neural stem cells were detected by western blot and immunofluorescence after treatment with 200 µmol/L fasudil for 10 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive expression of Nestin protein in primary cultured neural stem cells was observed. The proliferation rate of neural stem cells increased gradually with the increase of fasudil concentration as well as with the prolongation of action time (P < 0.05). Both apoptosis inhibitor and ferroptosis inhibitor can increase the proliferation rate of neural stem cells (P < 0.05). Fasudil increased the proliferation rate of neural stem cells treated by apoptosis inducer and ferroptosis inducer (P < 0.05). Fasudil and ferroptosis inhibitors both decreased the level of malondialdehyde in neural stem cells, while ferroptosis inducers increased the level of malondialdehyde in neural stem cells (P < 0.05). After treatment with fasudil, the expression of doublecortin and glial fibrillary acidic protein protein in neural stem cells increased, and the expression of Nestin decreased (P < 0.05). To conclude, fasudil can improve the survival of neural stem cells by inhibiting apoptosis and ferroptosis, and moreover, it can promote the proliferation and differentiation of neural stem cells into neuron-like cells and glial cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Cell Proliferation, Apoptosis, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

孙婉莹，唐瑛，陈美娟. 法舒地尔干预原代神经干细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1336-1341.

Sun Wanying, Tang Ying, Chen Meijuan. Effect and mechanism of fasudil on proliferation and differentiation of neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1336-1341.

图/表（结果） 1

2.1 胎鼠神经干细胞的形态和鉴定结果 原代分离的神经干细胞培养1 d后，多数细胞呈球形悬浮生长，单个散在分布，见图1A；培养3 d后，细胞聚集成团，体积较小，悬浮生长，见图1B；培养7 d后，细胞聚集呈体积较大的神经球，悬浮生长，细胞排列紧密，球体中央细胞边界不清，未见明显突起形成，见图1C；细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物Nestin呈阳性表达，见图1D，提示分离培养的细胞是未分化的神经干细胞。

2.2 法舒地尔提高神经干细胞的增殖活性 随着法舒地尔浓度升高及作用时间延长，神经干细胞的增殖率逐渐增高，见图2，提示法舒地尔可能通过减少凋亡或增加活性提高神经干细胞的增殖率，且呈剂量与时间依赖性。

2.3 法舒地尔抑制神经干细胞凋亡和铁死亡 随着法舒地尔浓度增高和作用时间延长，神经干细胞的凋亡率没有明显变化，见图3A。

凋亡抑制剂z-vad-fmk和铁死亡抑制剂ferrostatin-1可提高神经干细胞的增殖率，而坏死抑制剂与自噬抑制剂不发挥作用，见图3B。

法舒地尔可提高凋亡诱导剂CCCP和铁死亡诱导剂Erastin处理的神经干细胞增殖率，提示法舒地尔可能抑制神经干细胞的凋亡和铁死亡，见图3C。

2.4 法舒地尔通过降低脂质过氧化水平提高神经干细胞增殖活性 法舒地尔和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1均能降低神经干细胞中丙二醛水平，铁死亡诱导剂Erastin则使神经干细胞中丙二醛水平升高，见图4，提示法舒地尔可能通过降低脂质过氧化水平提高神经干细胞增殖活性。

2.5 法舒地尔促进神经干细胞向神经元与神经胶质细胞分化 Western blot检测结果显示，法舒地尔作用后，神经干细胞中DCX和GFAP的表达升高，Nestin的表达降低(P < 0.05)；免疫荧光染色结果也显示，法舒地尔组DCX和GFAP阳性细胞比例高于对照组，Nestin阳性细胞比例低于对照组(P < 0.05)，见图5。以上结果提示法舒地尔可能促进神经干细胞向神经元与神经胶质细胞分化。

参考文献

[1] 黄志,张良明,陈瑞强,等.Purmorphamine对神经干细胞分化的影响及其机制[J].中国组织工程研究,2018,22(29):4675-4680.

[2] Matsuda S, Nakagawa Y, Amano K, et al. By using either endogenous or transplanted stem cells, which could you prefer for neural regeneration. Neural Regen Res. 2018;13(10):1731-1732.

[3] Kashem MA, Sultana N, Balcar VJ. Exposure of Rat Neural Stem Cells to Ethanol Affects Cell Numbers and Alters Expression of 28 Proteins. Neurochem Res. 2018;43(9):1841-1854.

[4] Zheng PD, Mungur R, Zhou HJ, et al. Ginkgolide B promotes the proliferation and differentiation of neural stem cells following cerebral ischemia/reperfusion injury, both in vivo and in vitro. Neural Regen Res. 2018;13(7):1204-1211.

[5] Wang Y, Pan J, Wang D, et al. The Use of Stem Cells in Neural Regeneration: A Review of Current Opinion. Curr Stem Cell Res Ther. 2018;13(7):608-617.

[6] Henzi R, Guerra M, Vío K, et al. Neurospheres from neural stem/neural progenitor cells (NSPCs) of non-hydrocephalic HTx rats produce neurons, astrocytes and multiciliated ependyma: the cerebrospinal fluid of normal and hydrocephalic rats supports such a differentiation. Cell Tissue Res. 2018;373(2):421-438.

[7] Abdanipour A, Jafari Anarkooli I, Shokri S, et al. Neuroprotective effects of selegiline on rat neural stem cells treated with hydrogen peroxide. Biomed Rep. 2018;8(1):41-46.

[8] Toyoda T, Kimura A, Tanaka H, et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 2017;9(2):419-428.

[9] 李超,付红杰,张建军,等.亚低温干预下神经干细胞的RhoA/ROCK通路[J]. 中国组织工程研究, 2017,21(13):2094-2099.

[10] Lai AY, McLaurin J. Rho-associated protein kinases as therapeutic targets for both vascular and parenchymal pathologies in Alzheimer's disease. J Neurochem. 2018;144(5):659-668.

[11] Pireddu R, Forinash KD, Sun NN, et al. Pyridylthiazole-based ureas as inhibitors of Rho associated protein kinases (ROCK1 and 2). Medchemcomm. 2012;3(6):699-709.

[12] Ding J, Li QY, Yu JZ, et al. Fasudil, a Rho kinase inhibitor, drives mobilization of adult neural stem cells after hypoxia/reoxygenation injury in mice. Mol Cell Neurosci. 2010;43(2):201-208.

[13] Nizamudeen ZA, Chakrabarti L, Sottile V. Exposure to the ROCK inhibitor fasudil promotes gliogenesis of neural stem cells in vitro. Stem Cell Res. 2018;28:75-86.

[14] Li YH, Yu JW, Xi JY, et al. Fasudil Enhances Therapeutic Efficacy of Neural Stem Cells in the Mouse Model of MPTP-Induced Parkinson's Disease. Mol Neurobiol. 2017;54(7):5400-5413.

[15] Yu JW, Li YH, Song GB, et al. Synergistic and Superimposed Effect of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Combined with Fasudil in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Mol Neurosci. 2016; 60(4):486-497.

[16] Chen S, Luo M, Zhao Y, et al. Fasudil Stimulates Neurite Outgrowth and Promotes Differentiation in C17.2 Neural Stem Cells by Modulating Notch Signalling but not Autophagy. Cell Physiol Biochem. 2015;36(2):531-541.

[17] Ji YT, Chen DY, Jiang SL, et al. Effect of fasudil hydrochloride on the post-thaw viability of cryopreserved porcine adipose-derived stem cells. Cryo Letters. 2014;35(5):356-360.

[18] Satoh S, Ikegaki I, Kawasaki K, et al. Pleiotropic effects of the rho-kinase inhibitor fasudil after subarachnoid hemorrhage: a review of preclinical and clinical studies. Curr Vasc Pharmacol. 2014;12(5):758-765.

[19] Shi J, Wei L. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology: the effect of fasudil. J Cardiovasc Pharmacol. 2013; 62(4):341-354.

[20] Chen M, Liu A, Ouyang Y, et al. Fasudil and its analogs: a new powerful weapon in the long war against central nervous system disorders. Expert Opin Investig Drugs. 2013;22(4):537-550.

[21] Gao H, Dou L, Shan L, et al. Proliferation and committed differentiation into dopamine neurons of neural stem cells induced by the active ingredients of radix astragali. Neuroreport. 2018;29(7):577-582.

[22] Hu YD, Zhao Q, Zhang XR, et al. Comparison of the properties of neural stem cells of the hippocampus in the tree shrew and rat in vitro. Mol Med Rep. 2018;17(4):5676-5683.

[23] Karimzadeh S, Hosseinkhani S, Fathi A, et al. Insufficient Apaf-1 expression in early stages of neural differentiation of human embryonic stem cells might protect them from apoptosis. Eur J Cell Biol. 2018;97(2): 126-135.

[24] Wang C, Lu CF, Peng J, et al. Roles of neural stem cells in the repair of peripheral nerve injury. Neural Regen Res. 2017;12(12):2106-2112.

[25] Pakvasa M, Alverdy A, Mostafa S, et al. Neural EGF-like protein 1 (NELL-1): Signaling crosstalk in mesenchymal stem cells and applications in regenerative medicine. Genes Dis. 2017;4(3):127-137.

[26] Zhang F, Duan X, Lu L, et al. In Vivo Long-Term Tracking of Neural Stem Cells Transplanted into an Acute Ischemic Stroke model with Reporter Gene-Based Bimodal MR and Optical Imaging. Cell Transplant. 2017; 26(10):1648-1662.

[27] Dong H, Lin X, Li Y, et al. Genetic deletion of Rnd3 in neural stem cells promotes proliferation via upregulation of Notch signaling. Oncotarget. 2017;8(53):91112.

[28] Rajan TS, Scionti D, Diomede F, et al. Prolonged Expansion Induces Spontaneous Neural Progenitor Differentiation from Human Gingiva- Derived Mesenchymal Stem Cells. Cell Reprogram. 2017;19(6):389-401.

[29] 宋国斌,席国萍,尉杰忠,等.Fasudil促进体外培养骨髓源神经干细胞的增殖与存活[J].细胞与分子免疫学杂志, 2015,31(11):1488-1496.

[30] Fearnhead HO, Vandenabeele P, Vanden Berghe T. How do we fit ferroptosis in the family of regulated cell death. Cell Death Differ. 2017; 24(12):1991-1998.

[31] Latunde-Dada GO. Ferroptosis: Role of lipid peroxidation, iron and ferritinophagy. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017;1861(8):1893-1900.

[32] Dixon SJ. Ferroptosis: bug or feature. Immunol Rev. 2017;277(1):150-157.

[33] Angeli JPF, Shah R, Pratt DA, et al. Ferroptosis Inhibition: Mechanisms and Opportunities. Trends Pharmacol Sci. 2017;38(5):489-498.

[34] Chen S, Luo M, Zhao Y, et al. Fasudil Stimulates Neurite Outgrowth and Promotes Differentiation in C17.2 Neural Stem Cells by Modulating Notch Signalling but not Autophagy. Cell Physiol Biochem. 2015;36(2): 531-541.

[35] 沈雷,张博爱,贾延劼,等.盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响[J].山东医药,2010,50(9):28-29.

引言

神经干细胞是神经元和神经胶质细胞的来源，大多数在神经发育过程中自我更新，始终保持各自独特的分化形式^[1]。在成人大脑中，神经发生贯穿始终，神经干细胞主要存在于齿状回和侧脑室的脑室下区等^[2]。研究发现，内源性神经干细胞的增殖与分化在脑损伤时明显增加，通过自我修复取代受损细胞，新生细胞可以迁移到受损区域，分化为功能性神经元和神经胶质细胞^[3-4]。然而，中枢神经系统的自我修复能力不足以治疗神经损伤或退行性疾病^[5]。虽然神经营养因子能促进内源性神经干细胞增殖与神经元形成，在中枢神经系统疾病及创伤治疗中具有潜力，却由于血脑屏障的存在限制了其应用^[6]。因此，如何影响神经干细胞的增殖与分化一直是神经系统疾病治疗的研究热点^[7]。

Rho蛋白是小分子G蛋白超家族的一员，主要分布于细胞膜和细胞质，在细胞的增殖、分化与迁移，炎症细胞的黏附与吞噬，以及细胞信号转导中发挥重要作用^[8]。Rho相关激酶(Rho-associated kinases，ROCK)是Rho下游的直接效应物，属于Ras超家族Rho GTP酶的成员，主要包括ROCK1和ROCK2亚型，后者主要在中枢神经系统中表达^[9]。近来的研究已证实，ROCK2的过表达与神经元轴突再生及神经元分化抑制和神经系统肿瘤细胞增殖密切相关^[10]。存在于神经元中的髓鞘相关抑制因子可通过与神经细胞膜上存在的受体或受体复合物结合而激活Rho-ROCK信号通路，进而活化ROCK2，导致分布于中枢神经系统内的神经元突起缩短和轴丘塌陷，最终引起神经再生抑制^[11-12]。因此，Rho信号通路抑制剂正逐渐成为治疗神经系统疾病的潜在靶点。

法舒地尔(Fasudil)是一种ROCK抑制剂，已被证实能减轻一系列中枢神经系统疾病的临床症状，包括蛛网膜下腔出血、脊髓损伤、脑卒中和帕金森病等^[13]。尽管体内和体外实验研究显示，包括C3转移酶在内的其他ROCK抑制剂具有与法舒地尔相似的促神经组织修复作用，但法舒地尔是目前唯一经临床批准的用于中枢神经系统疾病治疗的ROCK抑制剂^[14]。以往研究表明，法舒地尔不仅可通过将小胶质细胞转变为促进组织修复的抗炎性M2表型细胞来延缓疾病的进展并减轻严重程度，还可以通过激活星形胶质细胞分泌粒细胞集落刺激因子并抑制谷氨酸诱导的神经毒性^[15-17]。在体外缺血模型中法舒地尔对神经元具有保护作用并动员内源性神经干细胞增殖^[18]。近年来的研究也表明，法舒地尔在体内可动员内源性神经干细胞增殖，在体外诱导永生化的神经干细胞分化为神经元与神经胶质细胞^[19-20]。然而，法舒地尔对原代培养的神经干细胞增殖与分化的影响及其可能机制则鲜有报道。因此，该研究在体外原代培养神经干细胞，观察法舒地尔对神经干细胞增殖与分化的影响，探讨其可能机制，以期为神经系统疾病的干细胞治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞干预实验。

1.2 时间及地点 2017年9月至2018年5月在西南医科大学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6-8周龄SD大鼠10只，清洁级，雌雄各半，体质量220-240 g，购于西南医科大学动物实验中心。将雌雄大鼠成对合笼喂养，每日观察雌鼠有无孕栓，自发现之日记为孕0 d，至孕15 d时取材进行实验。

1.3.2 实验试剂与仪器 法舒地尔(中国天津红日公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清、Neurobasal培养基(美国Gibco公司)；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子(美国PeproTech公司)；胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜、碘化丙啶(美国Sigma-Aldrich公司)；B27细胞培养添加剂(美国Invitrogen公司)；铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、凋亡抑制剂z-vad-fmk、坏死抑制剂Necrostatin-1、自噬抑制剂3-methyladenine、铁死亡诱导剂erastin、凋亡诱导剂Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)(美国Selleck Chemicals公司)；抗Nestin、DCX、MAP-2、GFAP、β-actin抗体(美国Abcam公司)；DAlexa Fluor 488标记的山羊抗兔/鼠二抗、DAPI(美国Santa Cruz公司)；超净工作台(中国苏州净化设备厂)；CO₂细胞培养箱(日本SANYO公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；全自动酶标仪(中国上海光谱公司)；倒置相差显微镜、荧光显微镜、光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠神经干细胞的分离与培养 无菌条件下取出SD孕鼠腹中15 d龄胎鼠，在体视显微镜下分离胎鼠的脑室下区、脑室管膜和海马组织，冰上剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化30 min，过40 μm细胞筛网，用含胎牛血清的DMEM/F12完全培养基终止消化，将细胞以1×10⁸ L^-1细胞浓度接种于预先涂有明胶的培养皿中，用含20 μg/L表皮生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、1%B27和100 U/mL青-链霉素的DMEM/F12培养液在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每3 d半量换液1次，每7 d传代1次。

1.4.2 大鼠神经干细胞的鉴定 应用免疫荧光法检测神经干细胞标记物Nestin的表达，用0.25%胰蛋白酶消化液将第3代神经干细胞制成细胞悬液，PBS洗涤3次，每次3 min，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，每次3 min，0.3% Triton X-100通透细胞膜15 min，体积分数为10%山羊血清室温封闭1 h，加入兔抗鼠Nestin抗体(1∶500)避光孵育，4 ℃过夜，加入荧光标记的二抗，避光孵育1 h，DAPI染核5 min，封固，荧光显微镜下观察、照相。

1.4.3 MTT法检测神经干细胞增殖活性 ①为了观察法舒地尔对神经干细胞活性的影响，用50，100，200 μmol/L法舒地尔对细胞进行孵育，分别在干预24，48，72 h后用MTT法检测神经干细胞的活性；②为了探讨神经干细胞是否因为存在其他方式死亡而影响增殖，应用50 µmol/L凋亡抑制剂z-vad-fmk、50 nmol/L铁死亡抑制剂ferrostatin-1、10 µmol/L坏死抑制剂Necrostatin-1和50 µmol/L自噬抑制剂3-Methyladenine分别作用于神经干细胞，24 h后应用MTT检测细胞增殖率；③进一步探讨法舒地尔对神经干细胞凋亡与铁死亡的影响，将200 µmol/L法舒地尔分别与50 mmol/L凋亡诱导剂CCCP及5 µmol/L铁死亡诱导剂erastin单独或共同处理神经干细胞，24 h后MTT检测细胞增殖率。取各组神经干细胞悬液，以5×10⁴ L^-1细胞浓度接种于96孔培养板的各孔内，每孔体积100 μL，先用Neurobasal培养基培养，24 h后换成DMEM/F12培养基，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，避光孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜混匀，以二甲基亚砜为空白对照，用酶标仪检测570 nm波长各孔吸光度值，计算细胞存活率。

1.4.4 流式细胞术检测神经干细胞凋亡 为了观察法舒地尔能否通过抑制神经干细胞凋亡影响细胞的存活，应用流式细胞术检测神经干细胞的凋亡情况，分别用50，100，200 μmol/L法舒地尔干预神经干细胞，在24，48，72 h后检测神经干细胞凋亡。取各组神经干细胞悬液移入离心管，1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤3次，缓冲液重悬细胞，每管分装500 μL，每管加入10 μL FITC标记的AnnexinⅤ和5 μL PI混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪在488 nm波长检测细胞凋亡。

1.4.5 生化法检测神经干细胞脂质过氧化水平 为了进一步探讨法舒地尔抑制神经干细胞发生铁死亡的可能机制，分别用200 µmol/L法舒地尔、50 nmol/L铁死亡抑制剂ferrostatin-1及5 µmol/L铁死亡诱导剂erastin处理神经干细胞24 h，应用生化法检测法舒地尔对神经干细胞脂质过氧化水平的影响。

取各组细胞悬液，10 000 r/min离心5 min，PBS漂洗、匀浆5 min，10 000 r/min离心5 min，取细胞上清按照试剂盒说明书步骤应用酶标仪在532 nm波长下检测各组吸光度值，计算丙二醛水平。

1.4.6 Western blot检测神经干细胞中Nestin、DCX、MAP-2、GFAP蛋白的表达 为了观察法舒地尔对神经干细胞分化的影响，用200 µmol/L法舒地尔干预神经干细胞10 d，Western blot检测神经干细胞标志物Nestin、未成熟神经元标志物DCX、成熟神经元标志物MAP-2、神经胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达。

收集各组细胞，用全细胞裂解液裂解细胞，10 000 r/min离心10 min，取上清液检测所提取蛋白样品的浓度，将其煮沸变性，调整上样量，10%SDS-PAGE电泳、转膜、3%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入Nestin(1∶500)、DCX(1∶500)、MAP-2(1∶400)、GFAP(1∶400)和β-actin(1∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶500)，室温孵育1 h，应用化学发光试剂盒在凝胶成像仪中显影，以β-actin为内参，用Quantiy One软件分析条带灰度，对目的蛋白进行半定量检测。

1.4.7 免疫荧光法检测神经干细胞中Nestin、DCX、MAP-2和GFAP蛋白的表达比例 为了观察法舒地尔对神经干细胞分化的影响，用200 µmol/L法舒地尔干预神经干细胞10 d，应用免疫荧光法检测神经干细胞标志物Nestin、未成熟神经元标志物DCX、神经胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达。方法同1.4.2，一抗分别为Nestin(1∶400)、DCX(1∶200)、GFAP(1∶100)、MAP-2(1∶100)。摄片后，用Image J软件对各组随机选取的5个低倍视野中阳性细胞进行计数，计算阳性细胞比例。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞增殖活性；②神经干细胞凋亡率；③神经干细胞内脂质过氧化水平；④神经干细胞中Nestin、DCX、MAP-2、GFAP蛋白的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件统计分析实验数据，计量数据用x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，两组间比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

神经干细胞移植已被证实能有效治疗神经系统损伤，其作用机制多种多样^[21-23]。影响神经再生及突触形成的关键因素是移植神经干细胞的增殖与分化^[24]。目前，有效控制神经干细胞增殖、分化与迁徙的机制尚不明确，如何使分化的神经细胞具有成熟神经元特性、神经干细胞来源与数量不足等问题尚未解决，再生神经细胞的存活时间及增殖活性等尚需检验^[25-27]。该研究应用法舒地尔体外作用于神经干细胞，MTT检测结果显示经法舒地尔处理的神经干细胞的增殖活性均有明显提高，并呈时间与剂量依赖性，提示法舒地尔可促进神经干细胞增殖，对神经干细胞没有毒性。以往研究发现，在神经干细胞体内增殖过程中不时会有细胞凋亡的发生^[28]。该研究的细胞凋亡检测结果显示，不同浓度法舒地尔作用不同时间后，神经干细胞的凋亡率并没有明显变化，说明法舒地尔可能不完全通过抑制细胞凋亡来提高神经干细胞存活率。以上结果与宋国斌等^[29]的研究结果一致，他们发现法舒地尔通过减少细胞死亡促进骨髓来源神经干细胞的增殖与存活。

为探讨神经干细胞是否存在其他死亡方式，该研究用不同细胞死亡方式的抑制剂处理神经干细胞，MTT检测结果显示，凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂、法舒地尔处理的神经干细胞的增殖活性高于对照组，法舒地尔处理的神经干细胞增殖活性最高，提示法舒地尔可能同时通过抑制凋亡和铁死亡提高神经干细胞的增殖活性，进一步应用凋亡诱导剂和铁死亡诱导剂分别与法舒地尔共同处理神经干细胞，MTT检测结果显示，法舒地尔可提高经凋亡诱导剂和铁死亡诱导剂处理的神经干细胞的增殖率，提示法舒地尔可能抑制凋亡和铁死亡。铁死亡是不同于凋亡、坏死和自噬等细胞死亡途径的铁依赖的氧化性死亡方式，其主要机制是细胞内脂质过氧化物积聚引起的细胞内膜类结构的损伤，降低细胞内脂质过氧化物水平则能避免细胞发生铁死亡^[30-33]。该研究神经干细胞内脂质过氧化水平检测结果显示，法舒地尔可降低神经干细胞中丙二醛水平，说明法舒地尔可能通过降低神经干细胞内丙二醛水平抑制铁死亡发生，从而提高神经干细胞的活性。

Nestin是神经干细胞的特征性标志物，一般不表达于成熟神经元中，已被广泛地用于神经干细胞的鉴定及分化判断。该研究的细胞免疫荧光结果显示，从新生鼠脑组织分离出的细胞多数表达Nestin，说明分离获得的细胞是神经干细胞，经法舒地尔作用10 d后，Western blot结果显示细胞中的nestin表达较对照组降低，提示法舒地尔可能促进神经干细胞分化。Chen等^[34]研究发现法舒地尔可促进神经干细胞向神经胶质细胞分化。沈雷等^[35]研究则证实法舒地尔促进神经干细胞向神经细胞分化。为了进一步观察法舒地尔促进神经干细胞分化的方向，该研究分别检测各组细胞中未成熟神经元的标志物DCX、成熟神经元的标志物MAP-2、神经胶质细胞的标志物GFAP的蛋白表达，结果显示法舒地尔处理后神经干细胞中有DCX和GFAP的表达，未见MAP-2的表达。此外，免疫荧光染色结果也显示，法舒地尔组DCX和GFAP阳性细胞比例高于对照组，Nestin阳性细胞比例低于对照组。以上结果提示法舒地尔可促进神经干细胞向神经元及神经胶质细胞分化。

总之，该研究成功分离神经干细胞，法舒地尔可通过抑制凋亡与铁死亡提高神经干细胞的存活，并能促进神经干细胞向神经元与神经胶质细胞分化。但体外培养无法模拟体内复杂的微环境，在体内法舒地尔能否发挥同样作用还需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程