RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1623

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1342-1348.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1623

• 肿瘤干细胞 cancer stem cells • 上一篇下一篇

RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

张莹莹¹，王英磊²，孟琳²，肖琳²，李忠海²，赵战魁²，吴厚苛²

济宁医学院附属医院，¹儿科，²泌尿外科，山东省济宁市 272000

修回日期:2018-11-17 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 王英磊，硕士，副主任医师，济宁医学院附属医院泌尿外科，山东省济宁市 272000
作者简介:张莹莹，女，1982年生，汉族，山东省滨州市人，主要从事泌尿系肿瘤方向研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(2016WSB34018)，项目负责人：王英磊

RNA interferes with Id2 gene expression to inhibit proliferation and invasion of PC-3 prostate cancer stem cells

Zhang Yingying¹, Wang Yinglei², Meng Lin², Xiao Lin², Li Zhonghai², Zhao Zhankui², Wu Houke²

¹Department of Pediatrics, ²Department of Urology, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272000, Shandong Province, China

Revised:2018-11-17 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Wang Yinglei, Master, Associate chief physician, Department of Urology, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272000, Shandong Province, China
About author:Zhang Yingying, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272000, Shandong Province, China
Supported by:
the Medical and Health Scientific Development Program of Shandong Province, No. 2016WSB34018 (to WYL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
上皮-间质转化：指上皮细胞到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和入侵的能力，不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。
Id因子：是Perk等于1990年首先从鼠红白血病细胞cDNA文库中克隆出来的蛋白质，因其能抑制转录因子与DNA结合，又称为DNA结合抑制因子，属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族，其中最受关注、作用最广泛的是Id2和Id3因子。

摘要
背景：Id基因是碱性螺旋-环-螺旋因子的内源性负性调节因子。该因子参与细胞的增殖、分化和生存，并在不同类型肿瘤的进展和浸润过程中表现出功能的多样性。
目的：探讨沉默Id2基因表达对人前列腺肿瘤干细胞增殖和侵袭能力的影响。
方法：取对数生长期的PC-3人前列腺癌细胞，采用无血清悬浮培养法分离肿瘤干细胞球，流式细胞仪检测肿瘤干细胞表面标记CD44⁺CD24^-表达。构建shRNA-Id2表达载体，转染至前列腺肿瘤干细胞，以未转染的前列腺肿瘤干细胞为对照。转染后48 h，采用RT-PCR与Western blot实验检测前列腺肿瘤干细胞Id2基因及蛋白的表达；采用MTT法、Transwell小室检测前列腺肿瘤干细胞的增殖和侵袭能力；采用Western blot与RT-PCR检测前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白、间质细胞标志物波形蛋白及上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist的表达。
结果与结论：①采用无血清悬浮培养法成功分离出肿瘤干细胞球，第3代前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44⁺CD24^-表达率为(85.69±8.96)%，显示培养的肿瘤干细胞球高表达肿瘤干细胞表型；②转染后48 h，shRNA-Id2转染组细胞Id2基因及蛋白表达明显低于未转染组(P < 0.05)，显示成功干扰了前列腺肿瘤干细胞Id2表达；③shRNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的增殖速度和侵袭能力低于未转染组(P < 0.05)；④shRNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的上皮标志物E-钙黏蛋白表达高于未转染组(P < 0.05)，间质细胞标志物波形蛋白、上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist表达低于未转染组(P < 0.05)；⑤结果表明，RNA干扰Id2基因表达可通过调控E-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist表达抑制前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1498-439X(张莹莹)

关键词: 前列腺肿瘤, 肿瘤干细胞, 前列腺肿瘤干细胞, Id2基因, RNA干扰, 细胞增殖, 细胞侵袭

Abstract:

BACKGROUND: The Id2 gene is an endogenous negative regulator of basic helix-loop-helix factor, which is involved in the cell proliferation, differentiation and existence. Id2 also shows functional diversity in the progression and infiltration of different types of tumors
OBJECTIVE: To observe the changes of proliferation and invasiveness of PC-3 human prostate cancer stem cells after shRNA-Id2 transfection.
METHODS: PC-3 human prostate cancer stem cells in logarithmic growth phase were harvested to isolate tumor stem cell spheres by serum-free suspension culture. The expression of CD44⁺CD24^- on the surface of tumor stem cells was detected by flow cytometry. The shRNA-Id2 expression vector was constructed and transfected into PC-3 human prostate cancer stem cells. Untransfected PC-3 human prostate cancer stem cells were used as control. At 48 hours after transfection, the expression of Id2 gene and protein in shRNA-Id2 transfected prostate cancer stem cells, NC-shRNA empty vector transfected prostate cancer stem cells and untransfected prostate cancer stem cells were detected by RT-PCR and western blot, respectively. The proliferation and invasion of shRNA-Id2 transfected prostate cancer stem cells and untransfected prostate cancer stem cells were detected by MTT assay and Transwell chamber, respectively. The expressions of E-cadherin, vimentin and Twist were detected by western blot and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Tumor stem cell spheres were successfully isolated by the serum-free suspension culture. The expression rate of CD44⁺CD24^- on the surface of the third-generation PC-3 human prostate cancer stem cells was (85.69±8.96)%, indicating that the cultured tumor stem cell spheres overexpressed the phenotype of tumor stem cells. At 48 hours after transfection, the expression of Id2 gene and protein was significantly lower in the shRNA-Id2 transfection group than the non-transfection group (P < 0.05), indicating that the expression of Id2 was successfully interfered with the expression of PC-3 prostate cancer stem cells. The invasive ability of the cells in the shRNA-Id2 transfection group was significantly lower than that in the non-transfection group (P < 0.05). Western blot and RT-PCR detection showed that the expression of E-cadherin, an epithelial marker of PC-3 prostate cancer stem cells, in the shRNA-Id2 transfection group was significantly higher than that in non-transfection group (P < 0.05), while the expression of vimentin, a marker of mesenchymal stem cells, and Twist, a transcription factor regulating cell-mesenchymal transformation, in the shRNA-Id2 transfection group was significantly lower than that in the non-transfection group (P < 0.05). These findings indicate that RNA interference with Id2 gene can inhibit the proliferation and invasion of PC-3 prostate cancer stem cells by regulating the expression of E-cadherin, vimentin and Twist.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Prostatic Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, RNA Interference, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

张莹莹，王英磊，孟琳，肖琳，李忠海，赵战魁，吴厚苛. RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1342-1348.

Zhang Yingying, Wang Yinglei, Meng Lin, Xiao Lin, Li Zhonghai, Zhao Zhankui, Wu Houke. RNA interferes with Id2 gene expression to inhibit proliferation and invasion of PC-3 prostate cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1342-1348.

图/表（结果） 5

2.1 前列腺肿瘤干细胞分离培养与表型鉴定结果 见图1。

接种1 d后，可见悬浮肿瘤干细胞球的体积较小，且较松散，第7天开始可见直径> 60 μm的悬浮细胞球，随着时间的延长，悬浮细胞球逐渐增多、增大，见图1A，B。流式细胞仪检测结果显示，第1代PC-3人前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44⁺CD24^-表达率为(50.69±6.97)%，第3代PC-3人前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44⁺CD24^-表达率为(85.69± 8.96)%，显示培养的肿瘤干细胞球高表达人前列腺癌干细胞表型，且随着传代增加纯度提高，见图1C。

2.2 Id2基因转染效果 RT-PCR检测结果显示，shRNA-Id2转染组细胞Id2基因表达明显低于NC-shRNA转染组、未转染组(P < 0.05)，见图2。Western blot检测结果显示，转染组细胞Id2蛋白表达明显低于NC-shRNA转染组、未转染组(P < 0.05)，NC-shRNA转染组、未转染组Id2基因及蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.3 细胞增殖能力检测结果 MTT检测结果显示，随着培养时间的延长，shRNA-Id2转染组与未转染组PC-3人前列腺肿瘤干细胞吸光度值逐渐升高，至培养第3天开始，shRNA-Id2转染组细胞吸光度值明显低于转染组(P < 0.05)，显示shRNA-Id2转染组细胞增殖速度与未转染组相比明显变慢，见图4。

2.4 细胞侵袭能力检测结果 转染48 h后，shRNA-Id2转染组穿膜细胞数明显低于未转染组，差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图5。

2.5 Western blot检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist蛋白的表达 与未转染组比较，shRNA-Id2转染组PC-3人前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白表达水平升高，间质细胞标志物波形蛋白表达降低，上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist蛋白表达降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.6 RT-PCR检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist蛋白的mRNA表达 与未转染组比较，shRNA-Id2转染组PC-3人前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白基因表达水平升高，间质细胞标志物波形蛋白基因表达降低，上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist基因表达降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图7，与Western blot检测结果一致。

参考文献

[1] 韩苏军,张思维,陈万青,等.中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J]. 临床肿瘤学杂志, 2013,18(4):330-334.

[2] Rycaj K, Tang DG. Molecular determinants of prostate cancer metastasis. Oncotarget. 2017;8(50):88211-88231.

[3] Perk J, Iavarone A, Benezra R. Id family of helix-loop-helix proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 2005;5(8):603-614.

[4] Patel D, Morton DJ, Carey J, et al. Inhibitor of differentiation 4 (ID4): From development to cancer. Biochim Biophys Acta. 2015;1855(1):92-103.

[5] Ling F, Kang B, Sun XH. Id proteins: small molecules, mighty regulators. Curr Top Dev Biol. 2014;110:189-216.

[6] 李亚卓,赵坡.Id2与NF-κB/P65在胃癌中的表达及临床病理意义[J].中华医学杂志,2018,98(11):846-850

[7] Gray MJ, Dallas NA, Van Buren G, et al. Therapeutic targeting of Id2 reduces growth of human colorectal carcinoma in the murine liver. Oncogene. 2008;27(57):7192-7200.

[8] Lasorella A, Rothschild G, Yokota Y, et al. Id2 mediates tumor initiation, proliferation, and angiogenesis in Rb mutant mice. Mol Cell Biol. 2005;25(9):3563-3574.

[9] Coma S, Amin DN, Shimizu A, et al. Id2 promotes tumor cell migration and invasion through transcriptional repression of semaphorin 3F. Cancer Res. 2010;70(9):3823-3832.

[10] 汪萍,李晓军,贾丽,等.分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达[J].医学研究生报,2007,20(1):20-23.

[11] 汪洋,冯杨焜,吴岩,等.人前列腺癌PC-3细胞系中肿瘤干细胞的富集、鉴定以及生物学特征的初步研究[J].中国男科学杂志, 2018, 32(2):20-29.

[12] 岳黎敏,张莽,程书珍,等. Id2和VEGF的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系研究[J].现代中西医结合杂志 2015,24(33): 3662-3664,3684.

[13] 温晓芬,许宏武,Min Chen,等.分化抑制因子2的生物学功能及其在乳腺癌中的研究进展[J].中华乳腺病杂志(电子版), 2016,10(6): 366-369.

[14] 邱建龙,杨维群,徐海刚. Id2在上皮性卵巢肿瘤中的表达及意义[J].临床肿瘤学杂志, 2011,16(12): 1088-1091.

[15] 杨忠信,李晓宇,蔡静,等.Xklp2靶蛋白对肺癌细胞裸鼠成瘤能力的影响及机制研究[J].实用医院临床杂志,2018,15(2):4-8.

[16] 赵泓帝,张振,邵志强,等. 沉默EMMPRIN对肾透明细胞癌增殖的影响[J].现代肿瘤医学,2018,26(7): 992-997.

[17] 鲁保才,卢振民,张爱民,等.干扰性小核糖核酸靶向抑制趋化因子受体4基因表达对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响[J].新乡医学院学报,2018,35(1):30-34.

[18] 赵振宇,贺华,卢亦成,等.Id2shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响[J].第二军医大学学报, 2011, 32(6):598-602.

[19] 姚春飞.恶性肿瘤侵袭与转移的病理探讨[J].养生保健指南, 2018, (7):246,276.

[20] 薛无涯,王舰梅,夏天,等.miR-204-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响[J].西南医科大学学报, 2018,41(2): 104-110.

[21] 杜媛鲲,米源,陈阁,等.Gli通过PI3K/AKT途径促进肺腺癌A549细胞侵袭转移的研究[J].河北医科大学学报,2018,39(1):24-28.

[22] 李艳,陈琼霞,王绪明. 敲低Stat5对甲状腺癌TT细胞侵袭及上皮间质转化的影响[J].国际肿瘤学杂志, 2018,45(1):1-4.

[23] Lo UG, Lee CF, Lee MS, et al. The Role and Mechanism of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Prostate Cancer Progression. Int J Mol Sci. 2017;18(10): E2079.

[24] 刘婷,吴俊成,陆伦根,等.STAT3加重TGF-β1诱导的肝癌细胞上皮-间质转化的发生[J].肝脏,2018,23(2):128-132.

[25] Ivanova K, Ananiev J, Aleksandrova E, et al. Expression of E-Cadherin/Beta-Catenin in Epithelial Carcinomas of the Thyroid Gland. Open Access Maced J Med Sci. 2017;5(2): 155-159.

[26] Da C, Wu K, Yue C, et al. N-cadherin promotes thyroid tumorigenesis through modulating major signaling pathways. Oncotarget. 2017;8(5):8131-8142.

[27] Calangiu CM, Simionescu CE, Stepan AE, et al. The expression of CK19, vimentin and E-cadherin in differentiated thyroid carcinomas. Rom J Morphol Embryol. 2014;55(3): 919-925.

[28] 付海丹.宫颈上皮内瘤变组织中转录因子Twist、Snail的表达及与上皮间质转化、细胞增殖的关系[J].海南医学院学报, 2016,22(13): 1339-1342.

[29] 高原,郑小玉. Twist和Snail在子宫腺肌病患者异位内膜组织中的表达及意义[J].临床医学研究与实践,2018,3(14):1-3,10.

[30] Kwok WK, Ling MT, Lee TW, et al. Up-regulation of TWIST in prostate cancer and its implication as a therapeutic target. Cancer Res. 2005;65(12):5153-5162.

引言

前列腺癌是男性常见的泌尿系统恶性肿瘤，在欧美国家男性恶性肿瘤发病率中居首位，在中国的发病率虽然不及西方国家高，但是近些年呈现逐渐增高的趋势^[1]。前列腺癌晚期患者会发生严重的组织和器官转移，是治疗失败和导致患者死亡的重要原因^[2]。因此，医学工作者一直致力于研究前列腺癌的发生与发展机制，寻找新的治疗靶点，以提高诊断水平及开发新的药物和治疗方法。

随着生物技术的发展，肿瘤干细胞学说经历了从设想到验证的漫长历程，它的提出为研究肿瘤细胞的生物学特性和肿瘤临床治疗提供了新的思路。研究发现肿瘤干细胞具有无限增殖、自我更新、多系分化、耐药性、高度致瘤性等干细胞特性，但是肿瘤干细胞大部分都处于休眠状态，而传统的肿瘤放疗、化疗只能针对处于增殖状态的肿瘤细胞，而对休眠的肿瘤干细胞无作用，因此人们推测肿瘤干细胞对传统治疗方法的抵抗是肿瘤治疗失败的主要原因，发展针对肿瘤干细胞的药物和治疗方法具有重要意义。

Id因子是Perk等^[3]于1990年首先从鼠红白血病细胞cDNA文库中克隆出来的蛋白质，因其能抑制转录因子与DNA结合，又称为DNA结合抑制因子，属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族，其中最受关注、作用最广泛的是Id2和Id3因子。Id自身缺乏DNA结合必需的碱性结构域，在抑制细胞分化、促进细胞增殖、诱导细胞凋亡、促进血管形成中发挥重要作用^[4-5]，并在不同类型的肿瘤进展和浸润过程中表现出功能的多样性，例如：李亚卓等^[6]研究认为Id2和NF-κB/P65在胃癌的发生发展、转移中存在协同促进作用，可考虑作为胃癌临床评价肿瘤生物学行为及评估预后的有用指标；在结肠癌中，Gray等^[7]证明Id2在40%原发灶和肝转移灶中表达，但是在正常的结肠黏膜层却未被检测到，并且Id2表达水平越高，其肿瘤越大，转移能力越强；还有研究发现Id2诱发促进脑垂体瘤的发展^[8]，通过阻断E47与脑信号素3F启动子E-box结合，抑制SEMA-3F表达，从而促进神经胶质瘤的侵袭^[9]。研究证实，PC-3人前列腺癌细胞中高表达Id2基因^[10]，体外特异性干预Id2的表达，可有效地抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。该研究采用无血清培养液悬浮细胞聚球法分离前列腺肿瘤干细胞，观察沉默Id2基因表达对前列腺肿瘤干细胞增殖能力与侵袭能力的影响，进一步探讨Id2与前列腺癌发生及发展的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年2至12月在济宁医学院实验室完成。

1.3 材料 人前列腺癌PC-3细胞株(上海细胞生物学研究所)；胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27(苏州赛业生物科技有限公司)；脂质体Lipofectmine 2000(美国Invitrogen公司)；小鼠抗人CD44、CD24抗体(北京启维益成科技有限公司)；FITC或者PE标记的荧光二抗(北京全式金生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)；鼠抗人单克隆抗体Id2、E-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail(奥维亚生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 前列腺肿瘤干细胞的分离培养 复苏液氮冻存的PC-3人前列腺癌细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于含体积分数5%CO₂的恒温培养箱中培养，5-7 d传代1次(1∶2)，两三天换1次液。

参照文献[11]介绍的方法分离培养PC-3人前列腺肿瘤干细胞。取处于对数生长期的PC-3人前列腺癌细胞，PBS清洗2遍，用含0.2 g/L EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞，重悬于含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、体积分数20% B27的DMEM/F12培养基，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-1。将细胞接种于超低黏附6孔板中，1×10³/孔，加入含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、20% B27的DMEM/F12培养基，为阻止细胞贴壁，每天多次摇动6孔板。观察细胞增殖形成明显团块后，将细胞悬液收集于离心管中，低速离心去上清，加入等量新鲜含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、20%B27的DMEM/F12培养基，缓慢机械吹打成单细胞悬液，再次重悬于含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、20%B27的DMEM/F12培养基，继续在37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养。每隔3 d半量换液，倒置显微镜下观察悬浮细胞球数目及形态。

1.4.2 前列腺肿瘤干细胞的表型鉴定 收集PC-3人前列腺癌悬浮细胞球，消化后1 000 r/min离心5 min，重悬于1 mL PBS中，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，备用。将小鼠抗人CD44、CD24抗体分别加入流式管，各0.5 μL，再将100 μL细胞悬液分别加入含抗体的流式管中，随后加入FITC或者PE标记的荧光二抗，采用流式细胞仪检测表面标记CD44、CD24的表达。

1.4.3 RNA干扰前列腺肿瘤干细胞Id2基因表达

shRNA-Id2表达栽体的构建：根据GenBank中Id2基因的mRNA序列(NM_002166)，由上海吉玛基因公司构建针对Id2基因的shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo- shRNA-Id2(基因靶序列为CCC TTC TGA GTT AAT GTC AAA)，经酶切鉴定、测序确认。构建的表达载体均带有GFP绿色荧光。同时构建NC-shRNA空载体质粒，仅用于干扰效果检测，以明确转染效果是否与空载体本身有关。

shRNA-Id2的转染：转染前1 d，取对数生长期的PC-3人前列腺肿瘤干细胞，消化后以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板，以含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、20%B27的DMEM/F12培养基培养。严格按照转染试剂盒说明书操作，将脂质体Lipofectmine 2000与shRNA-Id2质粒(或NC-shRNA空载体质粒)50 nmol/L混合均匀，转染至PC-3人前列腺肿瘤干细胞，将细胞置于37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，于转染后48 h收集细胞采用RT-PCR与Western blot实验检测RNA干扰效应。

1.4.4 MTT法检测前列腺肿瘤干细胞增殖能力 转染后48 h，取转染与未转染PC-3人前列腺肿瘤干细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，接种于24孔板中，每孔100 μL，每组设4个复孔，在37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养。每24 h取出1块培养板，每孔加入50 μL MTT液，在37 ℃培养箱内孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亚枫，在平板摇床上摇匀。采用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度值，取平均值，绘制细胞生长曲线。

1.4.5 Transwell小室检测前列腺肿瘤干细胞侵袭能力 采用Transwell小室检测转染与未转染PC-3人前列腺肿瘤干细胞的迁移运动能力。在接种细胞前，将Matrigel基质胶用无血清培养基按1∶5稀释，加到小室的上室面，于37 ℃培养箱中孵育60 min，按照Transwell小室说明，将转染与未转染PC-3人前列腺肿瘤干细胞加入到无血清培养液中，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。将100 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，将500 μL含体积分数10%胎牛血清的完全培养基加入Transwell小室下室，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中孵育24 h。取出小室，PBS洗2遍，体积分数为10%甲醇固定30 min，0.1%结晶紫复染15 min，PBS洗2遍，用棉签擦去上表面细胞，显微镜下计数穿膜细胞数。每个样本随机选择5个视野。

1.4.6 Western blot检测相关蛋白表达 转染后48 h，取转染与未转染的PC-3人前列腺肿瘤干细胞，PBS清洗2次，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。配制10%SDS-PAGE电泳凝胶，加入提取的蛋白样品，每孔30 μL。电泳分离、转膜，将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入稀释的鼠抗人Id2、E-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist单克隆抗体4 ℃孵育过夜。将孵育后的膜放入TBS-T中清洗3次，以HRP标记羊抗鼠抗体和羊抗兔抗体作为二抗，室温孵育1 h，TBS-T洗涤3次，ECL化学发光显色，GAPDH作为内参，凝胶成像系统拍照成像。

1.4.7 RT-PCR检测相关基因表达 转染后48 h，取转染与未转染的PC-3人前列腺肿瘤干细胞，提取细胞总RNA，应用MMLV反转录酶反转录成cDNA，设计基因序列，见表1。按照TIANGEN Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒说明书操作。PCR扩增条件为：95 ℃预变性2 min，然后为95 ℃ 10 s、57 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，45个循环。以上实验均重复3次，采用相对定量法来比较mRNA表达的差异。

1.5 主要观察指标 ①前列腺肿瘤干细胞分离培养与表型鉴定结果；②Id2基因转染效果；③干扰Id2基因表达后前列腺肿瘤干细胞的增殖能力和侵袭能力；④RT-PCR和Western blot检测E-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist蛋白的表达。

1.6 统计学分析 计量资料数据以x(_)±s表示，采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，统计方法为配对设计的t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

前列腺癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，近年前列腺癌发病率明显上升，尤其部分发达地区前列腺癌发病率明显增高，呈连续上升趋势。因此，无论是国内还是国外，前列腺癌己经对老年男性的生活质量和预期寿命产生严重的影响。尤其是中国己经开始进入老龄化社会，前列腺癌更是将成为严重的公共健康问题，目前对其尚缺乏有效的治疗方式，大多数患者最终死于肿瘤复发与转移，因此研究其发生与发展的分子机制具有重要的临床意义。近年来，分子肿瘤学在深入研究肿瘤相关基因结构与功能的基础上，揭示了意义更为深远的细胞周期调控、信号网络传导、细胞凋亡、细胞自噬等机制。这些理论和机制的揭示深刻改变了人们对肿瘤发生的认识，显著增进了对肿瘤发生和发展机制的了解，部分成果已开始应用于人类肿瘤诊断和防治的临床实践中。但是，无论基础研究还是应用研究目前都还有许多未知的领域有待发现，还存在许多的盲区，因此，探索新的肿瘤相关基因和信号通路是目前的研究热点。

近年来国内外研究表明肿瘤组织中含有一小部分具有自我更新、多向分化潜能的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞被认为是肿瘤生长、复发和转移的根源。因此，以肿瘤干细胞为靶标，运用生物工程手段寻找靶点成为肿瘤干细胞靶向治疗的新趋势。Id2基因与胃癌、食管癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生及发展相关^[12-14]，在这些肿瘤中均表现为Id2蛋白表达上调，但关于其与前列腺癌发生及发展的关系还不明确。

实验采用无血清悬浮培养法从PC-3人前列腺癌细胞中分离培养肿瘤干细胞，以其作为实验对象，观察RNA干扰Id2基因对PC-3人前列腺肿瘤干细胞增殖、侵袭能力的影响。在无血清培养基内，大多数已分化的肿瘤细胞由于不能贴壁而凋亡，沉积在培养基底部，因此选择性地去除了成体肿瘤细胞，而存留下来的是一些增殖能力强，类似于干细胞样的肿瘤细胞，呈悬浮状球形生长，流式细胞仪检测结果显示，培养的肿瘤干细胞球表达干细胞表型CD44⁺CD24^-。无血清悬浮培养法的优点是能够避免血清对细胞培养的影响，无需大量费用和复杂的细胞分离纯化过程，相对含血清培养基而言，无血清培养基具有更高的成分限定性和产品质量一致性。

RNA干扰是存在于真核生物体内的一种自我保护现象，可将序列特异性双链RNA导入细胞，产生特异性基因沉默，该技术在肿瘤研究中应用较广泛^[15-17]。该研究采用RNA干扰技术特异性抑制Id2基因表达，将shRNA-Id2转染至PC-3人前列腺肿瘤干细胞中，转染后48 h，Western blot与RT-PCR检测结果显示转染后细胞中Id2的表达受到明显抑制，提示shRNA-Id2可有效抑制PC-3人前列腺肿瘤干细胞中Id2的基因表达与蛋白聚集。

实验采用MTT法检测shRNA-Id2转染对PC-3人前列腺肿瘤干细胞增殖的影响，从细胞生长曲线可看出：随着培养时间的延长，shRNA-Id2转染组与未转染组细胞的增殖能力均有提升，但是shRNA-Id2转染组细胞的增殖速度较未转染组明显变慢，提示Id2基因的基础表达对于维持PC-3人前列腺肿瘤干细胞的增殖具有重要意义。研究已证实Id2基因参与调控细胞凋亡^[18]，但是该研究未进一步观察shRNA-Id2转染后PC-3人前列腺肿瘤干细胞的凋亡情况，此为研究的不足之处。

实验采用Transwell小室实验检测转染与未转染PC-3人前列腺肿瘤干细胞的侵袭能力^[19-20]，结果显示shRNA-Id2转染后，PC-3人前列腺肿瘤干细胞的侵袭能力明显下降，提示Id2基因可能发挥了促进PC-3人前列腺肿瘤干细胞侵袭的作用。肿瘤的侵袭是一个序贯连续的过程，是许多基因相互协同作用的结果。目前认为上皮-间质转化是所有实体肿瘤细胞发生局部浸润与远处转移的重要机制之一^[21-22]。当细胞发生上皮-间质转化时，会表现为上皮细胞标志物表达水平下调、间质细胞标志物表达水平上调，并伴随着肿瘤干细胞的运动、侵袭和体内转移能力显著提高^[23-24]。E-钙黏蛋白是上皮细胞表型标志物，可维持细胞间极性、抑制细胞的迁移^[25]。该研究结果显示，shRNA-Id2转染组细胞E-钙黏蛋白表达明显高于未转染组，说明干扰Id2基因表达，可显著增加PC-3人前列腺肿瘤干细胞上皮表型标志物的表达。波形蛋白是间质细胞表型标志物，可促进细胞的迁移与运动^[26-27]。该研究结果显示，shRNA-Id2转染组细胞波形蛋白表达明显低于未转染组，说明干扰Id2基因表达，可显著降低PC-3人前列腺肿瘤干细胞间质表型标志物的表达。Twist是公认的调控肿瘤细胞上皮-间质转化状态的主要转录因子之一^[28-29]。研究证实，在前列腺癌细胞中过表达Twist基因后，可以诱导上皮-间质转化，促进癌细胞的侵袭和转移；而敲除Twist基因则可产生相反的效应^[30]。该研究结果显示shRNA-Id2转染后，PC-3人前列腺肿瘤干细胞的Twist基因及蛋白表达均明显下降，提示Id2基因可能通过抑制转录因子Twist的表达来抑制上皮-间质转化，进一步抑制PC-3人前列腺肿瘤干细胞的运动、侵袭。实验结果提示Id2基因可能在控制PC-3人前列腺肿瘤干细胞上皮-间质转化表型与恶性发展中具有重要作用。

通过以上实验可得出，RNA干扰Id2基因可通过调控E-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力。但是实验仍然存在许多不足之处：其一是实验仅采用了1条靶向Id2基因的shRNA干扰片段，实验结果可能为脱靶引起的非特异性效应，后续实验需增加靶向Id2基因的shRNA干扰片段；其二是实验仅选择了PC-3人前列腺癌细胞珠，对于实验的现象是否适用于其他细胞株还有待进一步研究；其三是有关RNA干扰Id2基因抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞增殖及侵袭能力的具体机制还有待研究。

RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

RNA interferes with Id2 gene expression to inhibit proliferation and invasion of PC-3 prostate cancer stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[2]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[3]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[4]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[5]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[6]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[7]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[8]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[9]	戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.
[10]	陈杰, 廖成成, 陈智威, 王彦. 膀胱癌干细胞标志物及相关信号通路：抗体靶向治疗思路[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3090-3096.
[11]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.
[12]	王任先, 曹晶晶, 王宏刚, 万奔, 刘巍峰. 几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2500-2505.
[13]	王惠丽, 陈志江, 吴炳义. 神经胶质成熟因子γ抑制人结直肠癌LoVo细胞增殖并影响人脐静脉内皮细胞的骨架运动[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2055-2059.
[14]	姜涛, 吴硕, 李志强, 寿玺, 马依热·努尔买卖提, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1976-1981.
[15]	颜南, 司晓凤, 曾亮, 田伟, 单广东, 熊礼硕, 杨炜杰, 王正东. 神经生长因子干预大鼠骨骼肌卫星细胞增殖及α-肌动蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2030-2035.