电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2019

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (7): 1076-1082.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2019

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电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化

张培根¹，衡孝来¹，解迪¹，王进¹，马靖琳²，康学文²

¹四川绵阳四〇四医院/川北医学院附属第二医院，四川省绵阳市 621000；²甘肃省骨关节疾病研究重点实验室(兰州大学)，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2019-06-14 修回日期:2019-06-18 接受日期:2019-07-20 出版日期:2020-03-08 发布日期:2020-01-19
通讯作者: 康学文，主任医师，教授，硕士导师，甘肃省骨关节疾病研究重点实验室(兰州大学)，甘肃省兰州市 730030
作者简介:张培根，男，1977年生，汉族，2009年兰州大学第二临床医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事脊柱外科方向的研究。
基金资助:
甘肃省省青年科技基金计划(145RJYD300)

Electrical stimulation combined with neurotrophin 3 promotes proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury in rats

Zhang Peigen¹, Heng Xiaolai¹, Xie Di¹, Wang Jin¹, Ma Jinglin², Kang Xuewen²

¹Sichuan Mianyang 404 Hospital/the Second Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Mianyang 621000, Sichuan Province, China; ²Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province (Lanzhou University), Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Received:2019-06-14 Revised:2019-06-18 Accepted:2019-07-20 Online:2020-03-08 Published:2020-01-19
Contact: Kang Xuewen, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province (Lanzhou University), Lanzhou 730030, Gansu Province, China
About author:Zhang Peigen, Master, Associate chief physician, Sichuan Mianyang 404 Hospital/the Second Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Mianyang 621000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Science and Technology Foundation for the Youth of Gansu Province, No. 145RJYD300

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经营养素3：是神经生长因子基因家族的成员，可促进多种中枢和外周神经元的存活和分化，调节神经元突触活动，并对神经系统发育和成熟起重要作用。神经营养素3在损伤条件下对神经元具有保护作用，因而在治疗神经系统疾病和神经损伤中有临床应用前景。

内源性神经干细胞：正常机体中，神经干细胞一般处于静息状态，在特定的生理或病理刺激下被激活，其中侧脑室外侧壁的室下带和海马齿状回的颗粒下带是产生神经干细胞最为活跃的区域，神经系统损伤后，在多种细胞因子、调控基因的调节下发生增殖、迁移和分化等。

背景：由于外源性神经干细胞的获取有限，且容易产生免疫排斥以及伦理问题等严重制约其向临床转化，因此如何激活内源性神经干细胞并促进其生长增殖、分化，成为近期科研工作者究的热点。

目的：探讨电刺激联合神经营养素3对大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖及向神经元分化的作用。

方法：将96只SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、电刺激组、电刺激+神经营养素3组，每组24只。假手术组仅暴露脊髓，其他3组大鼠应用改良Allen法建立脊髓损伤模型，造模后给予相应措施进行干预。造模后7，14，21，28 d时，以BBB评分评价大鼠后肢运动功能，电生理学检查运动诱发电位潜伏期；造模后28 d取材，进行苏木精-伊红染色观察脊髓病理变化，免疫组化染色观察内源性神经干细胞的增殖和分化情况。实验方案经兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。

结果与结论：①与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠的BBB评分明显降低(P < 0.01)，脊髓组织可见大量炎症细胞浸润，并存在多个空洞；与脊髓损伤组相比，电刺激组、电刺激+神经营养素3组大鼠后肢功能开始逐渐恢复，电刺激+神经营养素3组BBB评分明显高于电刺激组(P < 0.05)，上述病理损伤变化明显改善；②脊髓损伤组7，14 d及电刺激组大鼠7 d时双后肢运动诱发电位潜伏期均未测出，电刺激组、电刺激+神经营养素3组21，28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P < 0.05)，电刺激+神经营养素3组潜伏期缩短更显著 (P < 0.05)；③BrdU和Nestin阳性细胞数、微管相关蛋白2的表达：电刺激+神经营养素3组>电刺激组>脊髓损伤组；胶质纤维酸性蛋白的表达：脊髓损伤组>电刺激组>电刺激+神经营养素3组。结果表明脊髓损伤大鼠经电刺激及神经营养素3干预后，促进内源性神经干细胞增殖和向神经元分化，病理损伤明显减轻，后肢运动功能显著改善。

ORCID: 0000-0002-6353-8874(张培根)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 内源性神经干细胞, 电刺激, 神经营养素3, 细胞增殖, 细胞分化, 运动功能

Abstract:

BACKGROUND: Due to limited access to exogenous neural stem cells, immune rejection and ethical problems, how to activate endogenous neural stem cells and promote their growth, proliferation and differentiation has become an issue of concern.

OBJECTIVE: To investigate the effects of electrical stimulation combined with neurotrophin 3 on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells into neurons after spinal cord injury in rats.

METHODS: Ninety-six rats were randomly divided into sham operation (spinal cord exposed only), spinal cord injury, electrical stimulation, and electrical stimulation+neurotrophin groups, 24 rats in each group. A rat model of spinal cord injury was established by modified Allen method in the latter three groups. After the model was established, the rats in the four groups were given corresponding treatments. At 7, 14, 21, and 28 days after modeling, the motor function of hind limbs was evaluated by Basso-Beattie-Bresnahan score. The latency of motor evoked potential was examined by electrophysiology. At 28 days after modeling, samples of the spinal cord were taken for hematoxylin-eosin staining to observe the pathological changes and for immunohistochemical staining to observe the the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells. The study was approved by the Ethics Committee of the Second Hospital of Lanzhou University.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham operation group, the Basso-Beattie-Bresnahan score in the spinal cord injury group was significantly decreased (P < 0.01), and a large number of inflammatory cells infiltrated into the spinal cord tissues with multiple cavities. Compared with the spinal cord injury group, the hind limb function in the electrical stimulation and electrical stimulation+neurotrophin groups began to recover gradually. Basso-Beattie-Bresnahan score in the electrical stimulation+neurotrophin group was significantly higher than that in the electrical stimulation group (P < 0.05). The above pathological changes were significantly improved. (2) No latency of motor evoked potentials in both hind limbs was detected in the spinal cord injury group at 7, 14 days and in the electrical stimulation group at 7 days, respectively. At 21 and 28 days, the latency of motor evoked potential was shorter in the electrical stimulation and electrical stimulation+neurotrophin groups than in the spinal cord injury group (P < 0.05); and the latency of motor evoked potential in the electrical stimulation+neurotrophin group was shorter than that in the electrical stimulation group (P < 0.05). (3) The number of BrdU and Nestin positive cells and the expression of microtubule-associated protein 2 were ranked as follows: electrical stimulation+neurotrophin group > electrical stimulation group > spinal cord injury group. The expression level of glial fibrillary acidic protein was highest in the spinal cord injury group, followed by electrical stimulation group, and lowest in the electrical stimulation+neurotrophin group. These results show that after electrical stimulation plus neurotrophin 3 intervention, endogenous neural stem cells can proliferate and differentiate into neurons. Pathological damage is significantly alleviated and motor function of hind limbs is significantly improved.

Key words: spinal cord injury, endogenous neural stem cells, electrical stimulation, neurotrophin 3, cell proliferation, cell differentiation, motor function

中图分类号:

张培根, 衡孝来, 解迪, 王进, 马靖琳, 康学文.

电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1076-1082.

Zhang Peigen, Heng Xiaolai, Xie Di, Wang Jin, Ma Jinglin, Kang Xuewen. Electrical stimulation combined with neurotrophin 3 promotes proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(7): 1076-1082.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验中动物无死亡脱落，96只SD大鼠均进入结果分析。

2.2 各组大鼠后肢运动能力与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠的BBB评分明显降低(P < 0.01)。与脊髓损伤组相比，电刺激组、电刺激+NT-3组大鼠后肢功能开始逐渐恢复，电刺激组BBB评分在造模后14，21，28 d高于脊髓损伤组(P < 0.05)，电刺激+NT-3组在造模后7，14，21，28 d高于脊髓损伤组(P < 0.05)。电刺激+NT-3组造模后7，14，21，28 d的BBB评分明显高于电刺激组(P < 0.05)。具体BBB评分见表1。

2.3 各组大鼠运动诱发电位潜伏期脊髓损伤组大鼠7，14 d及电刺激组大鼠7 d时双后肢运动诱发电位潜伏期均未测出；电刺激组14，21，28 d时运动诱发电位潜伏期较假手术组明显延长(P < 0.05)，21，28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P < 0.05)；电刺激+NT-3组7，14，21，28 d时运动诱发电位潜伏期较假手术组明显延长(P < 0.05)，21，28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P < 0.05)；电刺激+NT-3组21，28 d时运动诱发电位潜伏期较电刺激组缩短(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠损伤脊髓的病理变化假手术组大鼠脊髓未见明显损伤，细胞形态正常、排列整齐，无肿胀和出血；脊髓损伤组可见大量炎症细胞浸润，神经细胞肿胀、破坏，组织间隙增宽，水肿严重；电刺激组、电刺激+NT-3组大鼠上述病理改变均有所改善，电刺激+NT-3组改善明显，神经细胞破坏较轻，见图1。

2.5 各组大鼠内源性神经干细胞的增殖情况假手术组脊髓组织中BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞少见；而脊髓损伤后，脊髓组织中BrdU和Nestin阳性细胞数稍有增多；电刺激组、电刺激+NT-3组BrdU和Nestin阳性细胞数明显多于脊髓损伤组，电刺激+NT-3组最多，见图2，3。

2.6 各组大鼠内源性神经干细胞的分化情况与假手术组比较，脊髓损伤组微管相关蛋白2的表达增加，电刺激组、电刺激+NT-3组微管相关蛋白2的表达进一步增加，电刺激+ NT-3组最多；与假手术组比较，脊髓损伤组胶质纤维酸性蛋白的表达增加，电刺激组、电刺激+NT-3组胶质纤维酸性蛋白的表达较脊髓损伤组降低，电刺激+NT-3组最少，见图4。

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引言

脊髓损伤是创伤、肿瘤、疾病等导致的脊髓神经受损，原发性和继发性损伤导致脊髓缺血、结构破坏、细胞凋亡等改变，常引起损伤部位以下运动、感觉等功能发生永久性丧失，并可引发肌肉萎缩、压疮、感染，甚至呼吸问题^[1-2]。继发性脊髓损伤机制主要包括血管因素、电解质改变、自由基的作用、兴奋性氨基酸的毒性作用、炎性反应和细胞凋亡等，这些损伤具有可逆性^[3-4]。脊髓损伤的治疗方法主要有手术、药物、基因治疗以及细胞移植治疗等，其中干细胞移植被认为是治疗脊髓损伤最有前景的方法之一^[5-9]，它的原理是移植的干细胞可分化为神经元，替代缺失的神经元和突触连接，分化后产生的神经元和胶质细胞可分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境。但是事实上，移植的神经干细胞等干细胞大部分保持在未分化状态或存活率较低，同时神经干细胞的来源、免疫排斥及伦理问题等一直制约其临床应用^[10-11]。近年来，诱导内源性神经干细胞增殖及分化逐渐受到人们重视。

研究发现，中间神经元兴奋性紊乱是脊髓神经损伤后阻碍功能性恢复的一个重要机制，电刺激疗法可以改善由脊髓损伤引起的中间神经元兴奋性紊乱和失衡状况，并促进脊髓损伤小鼠部分运动功能恢复，目前多联合其他手段综合运用治疗脊髓损伤。

神经营养素3(neurotrophin-3，NT-3)是基于神经生长因子和脑源性神经营养因子同源性而发现的，属于神经营养素家族中的一员，在皮质脊髓束及一些大的感觉轴突上均存在NT-3受体，其生理作用广泛，尤其在促进神经元生长、分化与成熟及维持神经元存活等方面发挥重要的作用。研究表明NT-3通过介导p75NTR和Trk受体激活其下游信号通路，促进脊髓损伤后轴突再生。SCHNELL等^[12]研究证明NT-3对轴突再生的促进效果优于另外两种神经营养因子——神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)。因此，该研究观察电刺激联合NT-3对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖和分化的影响，为治疗脊髓损伤提供依据。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年6月在甘肃省骨关节疾病研究重点实验室完成。

1.3 材料雄性清洁级成年SD大鼠96只，体质量200- 250 g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号为SCXK(甘)2015-0001。所有大鼠均在同一标准条件下饲养，温度(22±2) ℃，湿度为50%-60%，自由进食饮水。实验方案经兰州大学第二医院医学伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 分组及造模将96只SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组、电刺激组、电刺激+NT-3组，每组24只。假手术组仅暴露脊髓，其他3组大鼠应用改良Allen法建立脊髓损伤模型。

造模方法：大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(上海化学试剂厂)麻醉，以俯卧位固定，充分暴露T_9-11节段椎板，咬开椎板至两侧关节突，将显露好的大鼠连同手术平板放置在脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor Model Ⅱ型)的平台上，接通电源，将消毒好的电线夹夹于椎旁肌，直视下将打击杆缓慢下调，至刚刚接触硬膜表面，此时听到打击器发出的轻微提示音，将高度计数表调零，然后垂直升起打击杆2.5 cm高度，按打击按钮，使打击杆(质量10 g)垂直落下打击于T₁₀节段脊髓水平^[13]，逐层缝合肌肉、皮肤。腹腔注射青霉素2×10⁴ U/kg，2次/d。轻柔按压膀胱区行人工排尿，直到大鼠恢复排尿反射。

脊髓损伤造模成功的标准：大鼠出现摆尾反射、双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪。

1.4.2 干预措施 ①电刺激组于术后第3天开始进行治疗^[14]，将电刺激治疗仪(英国Verity Medical公司)的4通道电极分别置于两侧后肢的大腿伸肌肌群和屈肌群的肌腹两侧，交替刺激后肢产生屈伸动作，每次15 min，1次/d，参数设置为频率100 Hz，脉宽300 ms，波升/波降为1/3，电流强度为5.0-6.0 mA，刺激至相应检测时间点；②电刺激+ NT-3组术后即刻尾静脉注射NT-3(美国Cytolab公司)溶液 20 μL(10 mg/L)，1次/d，共7 d，术后第3天开始进行电刺激，方法通电刺激组，刺激至相应检测时间点；③假手术组、脊髓损伤组不干预。

造模后2 h内各组大鼠腹腔注射50 mg/kg BrdU以标记内源性神经干细胞，连续注射7 d。

1.4.3 BBB评分评价大鼠后肢运动功能造模后7，14，21，28 d时以BBB评分评价各组大鼠后肢运动功能。满分21分为后肢运动功能正常，0分为后肢完全丧失运动能力；分数越低代表后肢运动功能越差，即脊髓损伤程度越严重。

1.4.4 电生理学检查运动诱发电位潜伏期造模后7，14，21，28 d时，各组分别取6只大鼠行水合氯醛腹腔注射麻醉，进行运动诱发电位检测。刺激电极为2对针状电极，分别放置于手术野上、下棘突间韧带。阴电极置于阳电极尾侧，两者间距1.0-1.5 cm。刺激类型为矩形脉冲，恒压输出4.0-10.0 V，波宽0.05 ms，刺激强度为2 mA。记录电极也为1对针状电极，在左右大腿股四头肌上分别记录复合肌肉动作电位的潜伏期，取平均值，采用损伤区上下方的潜伏期之差作为指标，差异越小，则传导功能恢复越好。

1.4.5 苏木精-伊红染色检测脊髓病理变化造模后28 d时，大鼠麻醉后处死，取出损伤脊髓及上下约3 mm组织，放入含30%蔗糖的PBS溶液中，当脊髓组织下沉至容器底部进行切片，切片厚4 μm。苏木精染色10 min，盐酸乙醇浸泡返蓝，伊红复染1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，倒置显微镜(日本Olypums公司)观察。

1.4.6 免疫组化染色检测内源性神经干细胞增殖情况造模后28 d时，行免疫组化染色检测BrdU和Nestin的表达。脊髓组织切片制备方法同上，片厚20 μm，用PBS清洗3遍，加入小鼠抗大鼠BrdU、Nestin单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)4 ℃孵育过夜，吸去一抗，PBS清洗3遍，加入二抗，37 ℃孵育30 min，吸去二抗，PBS清洗3遍，DAB显色，苏木精复染，将切片进行常规脱水、透明、封固，光学显微镜下观察。

1.4.7 荧光免疫组化染色检测内源性神经干细胞分化情况造模后28 d时，行荧光免疫组化染色检测BrdU/微管相关蛋白2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)、BrdU/胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达。将脊髓组织切片用PBS清洗3遍，加入40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗3遍，加入200 μL封闭液室温孵育30 min，吸去封闭液，加入小鼠抗大鼠BrdU抗体、兔抗鼠MAP-2抗体或兔抗鼠GFAP抗体(美国Santa Cruz公司)混合液4 ℃孵育过夜，吸去一抗，PBS清洗3遍，加入罗丹明-山羊抗兔IgG和FITC-羊抗小鼠IgG抗体混合液，37 ℃孵育1 h，37 ℃孵育45 min，吸去二抗，PBS清洗3遍，磷酸甘油封固，荧光显微镜观察。

1.5 主要观察指标各组大鼠的后肢运动功能、运动诱发电位潜伏期、内源性神经干细胞的增殖和分化情况。

1.6 统计学分析结果以SPSS 23.0进行分析，数据以 x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析以及q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤按发生机制可以分为原发性损伤与继发性损伤，继发性损伤是指脊髓损伤后一系列生化机制所引起的，主要是由原发性水肿的扩展、激发一系列细胞和分子机制，触发细胞坏死和凋亡等系列效应。神经元的坏死丢失是引起脊髓神经功能障碍的主要因素。因此，如何促进坏死丢失神经元的再生已成为近期研究的焦点。目前，在众多脊髓损伤治疗方案中，神经干细胞移植受到广大科研工作者的青睐。神经干细胞具有自我更新、增殖、迁移、多向分化等潜能，其分化的神经元可替代死亡丢失的神经元并与周围正常神经元形成新的突触联系，重建传导通路。由于外源性神经干细胞的获取有限，且容易产生免疫排斥以及伦理问题等严重制约其向临床转化，因此如何激活内源性神经干细胞并促进其生长增殖、分化，成为近期科研工作者究的热点^[15-16]。

正常情况下，内源性神经干细胞增殖非常有限，只有当脊髓损伤时，其才会被激活并大量反应性增生，且向不同的方向分化^[17-18]。由于内源性神经干细胞具有在不同的环境中可增殖、分化为不同类型的成熟组织细胞的特性^[19-20]，因此，当脊髓损伤后内环境的改变，小胶质细胞激活、星形胶质细胞增殖形成的瘢痕以及相关轴突生长抑制因子生成，导致增生的内源性神经干细胞的数量较少且大多分化为星形胶质细胞。这是目前内源性神经干细胞治疗脊髓损伤所面临的最突出的问题。因此，如何诱导内源性神经干细胞大量增生及分化为神经元是研究的重点。

近来有不少研究通过给予不同的神经营养因子、药物、物理治疗的方法促进内源性神经干细胞增殖，但仍存在很多问题期待解决，如缺少既促增殖又促分化的药物或神经营养因子。此次研究探讨电刺激联合NT-3干预脊髓损伤大鼠，探讨二者对内源性神经干细胞增殖和分化的影响。电刺激是模拟神经轴突再生环境中的一个因素，施加合适参数的微电流刺激后可以促进局部神经细胞的分化与增生，参与神经干细胞活化调控的微环境研究，逐渐成为研究的热点。NT-3是一种小分子量的碱性蛋白质，属于神经生长因子基因家族成员，能够调控神经元的发育、生长、分化和再生。曾有学者研究发现NT-3可促进神经干细胞分化为神经元和少突胶质细胞，而向星形胶质细胞分化相对较少^[21]。RAMU等^[22]对脊髓损伤的大鼠进行功能性磁共振成像，结果显示NT-3治疗4周后，大鼠损伤的对侧大脑皮质、丘脑、尾状核、海马等周围灰质都显示出强烈信号；HANNA-MITCHELL等^[23]通过电子显微镜观察发现在中枢神经系统中NT-3能减少神经元的凋亡并促进轴突的生长。

通过改良Allen法是目前主要的脊髓损伤模型建立方法，可以建立具有良好的重复性及高度可靠性的脊髓损伤大鼠模型，有效模拟临床上脊髓损伤患者的情况^[24]。BBB评分通过分析后肢关节活动度、协调性、步态稳定性等能够很好的评价大鼠后肢运动功能，是目前使用最广泛的脊髓损伤恢复评价方法。此次实验结果显示，与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠的BBB评分明显降低(P < 0.01)；与脊髓损伤组相比，电刺激组、电刺激+NT-3组大鼠后肢功能开始逐渐恢复，电刺激+NT-3组造模后7，14，21，28 d的BBB评分明显高于电刺激组(P < 0.05)。近年来电生理技术发展迅速，尤其是运动诱发电位在神经疾病领域的应用取得了很大进展，其在客观评估脊髓功能及治疗效果等方面具有极大的价值。电刺激组、电刺激+NT-3组21，28 d时运动诱发电位潜伏期较模型组缩短(P < 0.05)，电刺激+ NT-3组21，28 d时运动诱发电位潜伏期较电刺激组缩短 (P < 0.05)，与HASNAN等^[25]的研究结果一致，提示电刺激联合NT-3通过改善脊髓神经运动传导功能，减少神经元的凋亡并促进轴突的生长，进而促进运动功能恢复。通过苏木精-伊红染色观察电刺激+NT-3组大鼠脊髓的病理损伤明显减轻，二者促进脊髓损伤后功能的恢复及神经干细胞的增殖分化作用关系，还需进一步研究。

BrdU为胸腺嘧啶类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)掺入到新合成的DNA中，在细胞中永久存在，BrdU阳性细胞是反映细胞分裂增殖的理想的标志物^[26-27]。Nestin属于第Ⅳ类中间丝蛋白，是中枢神经系统发育过程中神经干细胞或神经前体细胞的标志之一^[28-29]。该研究通过免疫组化染色发现，假手术组脊髓组织中BrdU阳性细胞和Nestin阳性细胞少见，而脊髓损伤后脊髓组织中BrdU和Nestin阳性细胞数稍有增多，电刺激组、电刺激+NT-3组BrdU和Nestin阳性细胞数明显多于脊髓损伤组，电刺激+ NT-3组最多。在脊髓受损后短期内源性神经干细胞发生增生，随着时间延长细胞数目逐渐降低聚集在脊髓白质血管周围。经过电刺激、NT-3处理后，Nestin、BrdU阳性细胞数目明显升高，分析其原因可能为神经干细胞存活时间增强，促进神经干细胞增殖。

内源性神经干细胞具有分化为多种神经细胞的潜能，在以往实验中，通过制造脊髓微损伤模型，并利用DIL标记室管膜细胞，其室管膜细胞Nestin的表达在脊髓受损后1 d即可以检测到，而后逐渐增多，与此同时神经干细胞开始自中央管向外周迁徙^[30]。因此，在脊髓损伤后及时有效地改善受损部位的微环境，诱导内源性神经干细胞向神经元及少突胶质细胞分化，抑制星形胶质细胞合成变得至关重要。研究表明，NT-3不仅对与感觉有关的神经元有营养作用，而且对运动有关的神经元也有作用，其不但阻止轴突切断诱导的皮质脊髓神经元死亡，提高其存活，而且诱导轴突再生，使其部分功能恢复^[31]。CHEN等^[32]报道脊髓损伤后4周，用NT-3治疗可以逆转大部分腰髓感觉投射神经元萎缩，同时诱导细胞存活数量增多。王维等^[14]表明功能电刺激在脊髓损伤的治疗中不仅能够抑制GFAP的表达，抑制星形胶质细胞过度增生产生的纤维瘢痕来促进脊髓修复，而且还能抑制瘫痪肢体的肌肉萎缩。目前电刺激和NT-3联合应用在促进内源性神经干细胞向神经元方向分化面的研究较少。

微管相关蛋白2是一种成熟的神经元标记物^[33-34]，参与神经元发育、结构稳定、突起形成和突触可塑性调节，胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞活化的标志物^[35-38]。脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白阳性细胞显著上升，到28 d时脊髓损伤组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数仍维持在较高状态，电刺激组、电刺激+NT-3组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞显著降低，电刺激+NT-3组最低。脊髓损伤后微管相关蛋白2阳性细胞量有所升高，至28 d时，电刺激组、电刺激+ NT-3组微管相关蛋白2阳性细胞数继续升高，电刺激+NT-3组最高。结果说明电刺激联合NT-3可影响内源性神经干细胞的分化与转归，抑制内源性神经干细胞分化为星形胶质细胞，促进内源性神经干细胞分化为神经元，有利于脊髓损伤的修复。

综上，实验发现电刺激及NT-3在促进内源性神经干细胞增殖和向神经元分化方面起着重要的作用，二者联合使大鼠运动功能明显改善。但是电刺激及NT-3是如何使内源性神经干细胞和运动神经元间相互作用的，以及脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖、分化的机制仍不十分清晰，还有待进一步研究探索。

电刺激联合神经营养素3可促进脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化

Electrical stimulation combined with neurotrophin 3 promotes proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after spinal cord injury in rats

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