1.4.2  动物模型建立  3%戊巴比妥钠经耳缘静脉注射麻醉，术区备皮消毒。选取任意一侧下颌骨髁突为手术侧，距手术侧眶下缘约1 cm处做一长约2.5 cm横行切口，切开皮肤、皮下组织，暴露颧骨颧弓，去除部分颧骨颧弓，暴露下颌骨升支及髁突外侧面，使髁突的关节面完整显露。作髁突和升支前缘类似“L”型截骨线，使截骨线通过髁突关节面，制作成髁突高位骨折。剥离附着在髁突和下颌升支前内侧的骨膜肌肉附着，使内侧髁突成为游离骨块。复位髁突骨块，微型钛网固定(图1)。分层缝合切口，术后3 d，每日注射青霉素80万单位预防感染。

2.2  组织形态学分析  术后第1周，各组骨折线均清晰可见，游离骨块动度明显，骨折线内见骨痂充填，实验组较对照骨折组明显，髁突软骨表面不光滑，骨折线周围组织发生溶解。术后2，3周时，软骨骨折线边界较模糊，骨折线内见少量软骨样基质充填，实验组较对照组明显。术后4周时，软骨骨折区见软骨组织充填，软骨表面光滑，髁突形态基本上恢复，骨折边界已消失；对照组中见髁突表面不光滑，部分髁突软骨吸收。见图2。

术后1周时，番红O-固绿染色软骨缺损区内见淡绿色组织充填，增殖层和成熟层细胞厚度变薄；苏木精-伊红染色可见软骨损伤区及下方的骨折区有炎性细胞浸润，周围软骨基质发生降解，软骨细胞形态不规则；术后2周时，番红O-固绿染色软骨骨折区见绿色纤维组织充填，其间少量红色软骨基质，实验组较对照组多；苏木精-伊红染色软骨损伤区见大量红色纤维组织，其间见有软骨细胞和少量炎性细胞；术后3，4周时，番红O-固绿染色及苏木精-伊红染色见各层软骨细胞及软骨基质继续沉积在软骨骨折区，炎性细胞逐渐减少，实验组软骨层组织结构较清晰；成熟层及肥大细胞层增厚；对照组软骨基质和软骨细胞较少，在靠近软骨下骨处，见有小血管形成(图3，4)。

术后1周时，番红O-固绿染色软骨缺损区内见淡绿色组织充填，增殖层和成熟层细胞厚度变薄；苏木精-伊红染色可见软骨损伤区及下方的骨折区有炎性细胞浸润，周围软骨基质发生降解，软骨细胞形态不规则；术后2周时，番红O-固绿染色软骨骨折区见绿色纤维组织充填，其间少量红色软骨基质，实验组较对照组多；苏木精-伊红染色软骨损伤区见大量红色纤维组织，其间见有软骨细胞和少量炎性细胞；术后3，4周时，番红O-固绿染色及苏木精-伊红染色见各层软骨细胞及软骨基质继续沉积在软骨骨折区，炎性细胞逐渐减少，实验组软骨层组织结构较清晰；成熟层及肥大细胞层增厚；对照组软骨基质和软骨细胞较少，在靠近软骨下骨处，见有小血管形成(图3，4)。

2.4.1  Sox9在软骨骨折区的表达  术后1周，少量Sox9表达于软骨骨折区的增殖层和成熟层软骨细胞中，且在增殖层细胞中表达较强；术后3周，实验组中Sox9表达持续增高并达到峰值；术后4周，实验组中Sox9表达略有下降，对照组中Sox9表达呈上升趋势。染色强度IOD测定结果显示：术后1，2，3周时，实验组的阳性染色强度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4周，实验组阳性染色强度与对照组比较差异无显著性意义(见表2，图5)。

2.4.1  Sox9在软骨骨折区的表达  术后1周，少量Sox9表达于软骨骨折区的增殖层和成熟层软骨细胞中，且在增殖层细胞中表达较强；术后3周，实验组中Sox9表达持续增高并达到峰值；术后4周，实验组中Sox9表达略有下降，对照组中Sox9表达呈上升趋势。染色强度IOD测定结果显示：术后1，2，3周时，实验组的阳性染色强度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4周，实验组阳性染色强度与对照组比较差异无显著性意义(见表2，图5)。

2.4.2  基质金属蛋白酶13在软骨损伤区的表达  基质金属蛋白酶13表达在成熟层软骨细胞和肥大层细胞胞核和胞质。术后1周，实验组及对照组均表达基质金属蛋白酶13，且对照组表达强度大于实验组；术后2周，实验组及对照组中基质金属蛋白酶13表达略有下降；术后3，4周，基质金属蛋白酶13表达呈上升趋势，并在术后3，4周到达一个峰值。染色强度IA测定结果显示：术后1，2，3周时，实验组的阳性染色强度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4周，实验组阳性染色强度与对照组比较差异无显著性意义(见表3，图6)。

2.4.2  基质金属蛋白酶13在软骨损伤区的表达  基质金属蛋白酶13表达在成熟层软骨细胞和肥大层细胞胞核和胞质。术后1周，实验组及对照组均表达基质金属蛋白酶13，且对照组表达强度大于实验组；术后2周，实验组及对照组中基质金属蛋白酶13表达略有下降；术后3，4周，基质金属蛋白酶13表达呈上升趋势，并在术后3，4周到达一个峰值。染色强度IA测定结果显示：术后1，2，3周时，实验组的阳性染色强度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；术后4周，实验组阳性染色强度与对照组比较差异无显著性意义(见表3，图6)。

2.5  不同时期各组软骨细胞中Sox9和基质金属蛋白酶13 mRNA表达  各组Sox9 mRNA的相对表达量在术后初期均呈上升趋势，实验组术后第3周时达峰值，第4周时略下降。术后第1，2，3周实验组的Sox9 mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，见表4，图7。

2.5  不同时期各组软骨细胞中Sox9和基质金属蛋白酶13 mRNA表达  各组Sox9 mRNA的相对表达量在术后初期均呈上升趋势，实验组术后第3周时达峰值，第4周时略下降。术后第1，2，3周实验组的Sox9 mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，见表4，图7。

2组基质金属蛋白酶13 mRNA的相对表达量在术后1周时较高，然后下降。对照组在术后第3，4周基质金属蛋白酶13表达量又开始上升，并维持相同水平表达；实验组在术后1，2，3周低表达，在术后第4周时，表达呈上升趋势。术后第1，2，3周实验组的基质金属蛋白酶13 mRNA相对表达量显著低于对照组(P < 0.05)，见表5，图7。

下颌髁突是颌面部骨折好发的部位，占下颌骨骨折的20%-50%^[1-2]。髁突高位的骨折常常会累及髁突软骨，特别是髁突囊内骨折和矢状骨折。髁突软骨为颞下颌关节构成的重要组成部分，同时也是下颌骨的生长发育中心。髁突软骨的损伤不仅会引起局部疼痛症状，而且还可能引起下颌骨生长发育相对停滞、髁突发生吸收，甚至会出现颞下颌关节强直^[3-5]。由于髁突解剖结构的特殊性，在髁突骨折中，特别是髁突高位骨折，常因周围肌肉的撕脱使之成为游离骨块，游离髁突复位固定后可能发生髁突愈合不良甚至吸收。在缺血性损伤骨折愈合过程中，细胞增殖、骨和软骨基质的生成明显减少。髁突软骨本身具有少细胞、少血管的组织学特点，在血供缺乏的环境中，使软骨修复能力显著下降^[6-7]。因此加快损伤的软骨组织修复，缓解软骨基质降解，恢复软骨组织功能已经成为临床上亟需解决的问题。

甲状旁腺激素是甲状旁腺主细胞分泌的、由84个氨基酸组成的肽类激素。甲状旁腺激素为一种钙磷调节和骨改建调节激素。有研究发现，间隙性、小剂量应用甲状旁腺激素可以促进骨组织的合成代谢、改善骨的微结构、增加骨量、提高骨强度，并有利于骨折愈合、降低骨折概率^[8-10]。但是，目前关于甲状旁腺激素对游离髁突复位固定后骨折及软骨愈合影响还未见研究报道。所以此次实验通过建立兔髁突高位骨折游离复位固定实验动物模型，术后间隙性给予甲状旁腺激素，检测Sox9和基质金属蛋白酶13在髁突高位骨折后不同时段的表达，以探讨甲状旁腺激素对游离髁突复位固定后髁突软骨愈合的影响，为临床应用甲状旁腺激素促进下颌骨髁突高位骨折提供理论和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  2019年4月于贵州医科大学中英联合头颈癌症分子研究实验室。

1.3  材料

1.3.1  实验主要试剂  甲状旁腺激素(Tocris英国)；苏木精、伊红(南京建成科技有限公司)；SYBR绿色荧光染料(TaKaRa,日本)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Thermo Fermentas，美国)；trizol(Thermo Fermentas，美国)；微型钛钉和钛板(宁波慈北医疗器械有限公司)。Sox9和基质金属蛋白酶13抗体(博奥森，中国)，实时荧光定量PCR引物Sox9、基质金属蛋白酶13均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计及合成。

1.3.2  实验动物  五六个月龄成年新西兰大白兔48只，体质量(2.5±0.2) kg，雌雄各半，由贵州医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK(渝)2007-0005。实验方案获贵州医科大学动物实验伦理委员会审查和批准(1700456)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组  将实验动物随机分为2组，每组24只，在1，2，3，4周时间点内每组包含6只大耳兔。实验组隔日皮下注射甲状旁腺激素20 μg/kg，对照组隔日皮下生理盐水1 mL。

1.4.2  动物模型建立  3%戊巴比妥钠经耳缘静脉注射麻醉，术区备皮消毒。选取任意一侧下颌骨髁突为手术侧，距手术侧眶下缘约1 cm处做一长约2.5 cm横行切口，切开皮肤、皮下组织，暴露颧骨颧弓，去除部分颧骨颧弓，暴露下颌骨升支及髁突外侧面，使髁突的关节面完整显露。作髁突和升支前缘类似“L”型截骨线，使截骨线通过髁突关节面，制作成髁突高位骨折。剥离附着在髁突和下颌升支前内侧的骨膜肌肉附着，使内侧髁突成为游离骨块。复位髁突骨块，微型钛网固定(图1)。分层缝合切口，术后3 d，每日注射青霉素80万单位预防感染。

1.4.3  取材  2组大耳兔分别在术后1，2，3，4周时各取对应时间点内的6只麻醉后行空气栓塞处死。取手术侧下颌髁突软骨标本行骨折区新生组织大体形态学观察，随后将其中3只放入RNA protecter中冻存置-80 ℃冰箱保存，以备用。将另3只放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙液中脱钙六七周，每两三天更换脱钙液。待脱钙完成后行石蜡包埋、切片。

1.4.4  番红O-固绿染色及苏木精-伊红染色  ①番红O-固绿染色：将包埋好的组织沿冠状面切成3 μm厚的连续切片，烤片，二甲苯脱蜡，乙醇逐级水化。Weigert染液浸染5 min，水洗，酸性分化液15 s，蒸馏水水洗10 min，固绿染色液浸染5 min，弱酸溶液洗涤10 s，Safranin O stain浸染5 min，体积分数95%以上乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后观察。②苏木精-伊红染色：切片水化后，苏木精液染色10 min，流水稍洗去苏木精液3 s，1%盐酸乙醇3 s，水洗30 s，促蓝液返蓝30 s，流水冲洗10 min，蒸馏水过洗3 s，0.5%曙红液染色3 min，蒸馏水洗2 s，体积分数95%以上乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4.5  免疫组织化学检测  将切片烤片，二甲苯脱蜡，乙醇逐级水化。pH 6.0枸橼酸钠缓冲液抗原修复，体积分数3%过氧化氢阻断剂封闭，山羊血清封闭，滴加一抗，4 ℃冰箱中过夜。常温孵育二抗，DAB显色，苏木素复染。梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后观察。在光学显微镜下观察Sox9和基质金属蛋白酶13的表达；使用image proplus 6.0在200倍视野下每张切片选取3处阳性细胞最密集处测定平均吸光度值(IA)，取其平均值，判断各时期各组的表达强度。

1.4.6  实时定量荧光聚合酶链反应(PCR)  用trizol试剂提取样本总RNA，核酸定量仪测总RNA浓度，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录生成 cDNA 后。取样本cDNA 进行使用 PrimeScript RT Master Mix(Perpect Real Time)试剂盒(TakaRa，日本)反应体系行Real-time PCR。反应条件：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40 次。引物序列见表1。

1.5  主要观察指标  ①在大体标本上，观察软骨骨折区恢复情况；②光镜下观察切片中关节软骨组织结构的改变情况；③髁突软骨组织中Sox9及基质金属蛋白酶13的阳性细胞表达；④髁突软骨组织中Sox9及基质金属蛋白酶13的mRNA相对表达量。

1.6  统计学分析  各组实验数据计量资料采用x(_)±s表示，采用Excel整理汇总资料，Photoshop软件处理图片，Graph Pad软件做图分析，SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。对各组结果数据进行t 检验分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

下颌髁突的高位骨折固定术后愈合一直是临床上面临着的一大难题。由于髁突的特殊解剖结构使其成为下颌骨骨折好发的部位^{[1-2，11-13]}。临床上将下颌骨髁突骨折分为髁突头部、髁突颈、髁突颈下和髁突基部骨折。髁突高位骨折时，易发生附着于髁突的翼外肌剥脱使其成为游离骨块。游离髁突复位固定后可能发生髁突愈合不良甚至吸收、髁突骨折不愈合、髁突形态异常、颞颌关节功能紊乱和关节强直等并发症。髁突软骨作为下颌骨的发育中心，它的损伤不仅仅会引起骨关节炎，甚至会引起下颌骨生长发育相对停滞、髁突发生吸收^[5，14-16]。如何在促进髁突高位骨折固定术后愈合的同时促进软骨的修复一直是临床医生们的研究热点。

甲状旁腺激素是调节骨和软骨生长的关键激素之一。甲状旁腺激素对骨骼的调节具有双重作用^[9-10]。有实验研究发现甲状旁腺激素对软骨也是双重调节。低剂量的甲状旁腺激素也会促进间充质干细胞向软骨分化、促进软骨增殖、减少软骨向成骨转化；高剂量、持续性使用甲状旁腺激素会抑制软骨的增殖，引起软骨的骨化^[17-20]。在课题组前期实验中发现，间歇性注射不同低剂量甲状旁腺激素后可以促进下颌支截骨区新生骨形成，加快骨愈合；间隙性皮下注射甲状旁腺激素也可以上调骨保护素表达，加速骨代谢，促进下颌骨牵张区新骨生成^[8]。

此次实验建立髁突高位骨折游离复位固定实验模型，并在课题组前期实验基础上，以皮下注射20 μg/kg为剂量参考，探讨在血供缺乏的环境中，甲状旁腺激素是否同样可以促进间充质干细胞向软骨分化。结果发现在髁突软骨愈合初期，软骨骨折明显可见，骨折线周围见软骨组织发生溶解，软骨表面变粗糙，发现有类似纤维组织充填骨折区。对照组较实验组明显，其结果提示间歇性皮下注射甲状旁腺激素可以缓解软骨基质的降解，缓解软骨的损伤进一步扩大。术后2，3周时，骨折线边界逐渐模糊，软骨表面见不规则软骨基质形成。在实验组第4周时，软骨骨折区见软骨组织充填，软骨表面光滑，髁突形态基本上恢复，骨折边界已消失；对照组中见髁突表面不光滑，部分髁突软骨吸收。皮下注射甲状旁腺激素可以有效防止髁突发生吸收，维持髁突生理功能。在番红O-固绿及苏木精-伊红染色后发现，在术后1周时，软骨表面不连续，骨折周围基质发生降解，细胞排列紊乱，软骨厚度变薄，骨折区见纤维组织充填，软骨骨折区及软骨下骨区见炎症细胞浸润。其结果提示间隙性皮下注射甲状旁腺激素，可以有效减少炎症细胞浸润，防止软骨基质发生降解。术后2周时，骨折区周围出现少量新生软骨基质。术后3，4周，软骨番红O-固绿及苏木精-伊红染色结果中发现：在实验组中，软骨骨折区见软骨细胞和软骨基质较对照组明显增多；实验组中软骨组织结构较清晰，成熟层及肥大细胞层增厚；对照组中见纤维组织充填，组织结构层次不清晰，4周时，见有纤维层细胞和增殖层细胞充填于骨折区。因此在髁突高位骨折固定术后间歇性注射低剂量甲状旁腺激素可增加软骨骨折区的软骨细胞数量、促进软骨基质形成，加快软骨修复。

髁突软骨骨折术后的软骨修复受各种因子相互协同、拮抗影响。比如：Sox9转录因子属于SOX(sr -type hmg box)蛋白家族，是软骨形成的关键因子，被称为软骨细胞表型的主调控因子，也被认为是间质祖细胞成软骨分化早期阶段的标志^[21-24]。Sox9通过不同的信号转导通路发挥着复杂的调节作用。Sox9不仅能促进间充质细胞分化为软骨细胞并增殖，还能通过下调Runx2表达水平延缓软骨细胞前肥大^[25-27]。Ⅱ型胶原蛋白是软骨基质的主要成分，Sox9可以结合于软骨细胞特异增强子Col2a1，促进Ⅱ型胶原蛋白的分泌^[28]。此次实验中，术后1周中，实验组及对照组中Sox9表达量较少。术后2，3周时，实验组中Sox9 明显增加，推断甲状旁腺激素上调了Sox9的表达，上调的Sox9启动Col2a1的表达，产生更多的软骨基质沉积在软骨骨折区。此外，Sox9的高表达会促进间充质干细胞向软骨细胞转化，增加软骨细胞数量。实验组中的Sox9在3周时达到最高浓度，随后稍有下降，可能与软骨内成骨有关；HASEGAWA等^[29]经研究发现在软骨内成骨中，Sox9在分化后期的表达会下降，使软骨向成骨转化，这也有利于软骨下方骨折的愈合。基质金属蛋白酶13属于基质金属蛋白酶家族，基质金属蛋白酶参与许多生理及病理过程，如创伤的修复、血管的生成、软骨性疾病的进展^[30]。基质金属蛋白酶13是降解Ⅱ型胶原蛋白的主要酶，是导致软骨炎症重要因素之一^[31-32]。在实验中，术后1周时，对照组中基质金属蛋白酶13表达较高，这是因为在软骨急性损伤时，由于创伤的刺激和周围炎症因子的趋化，基质金属蛋白酶13表达会增加，加重软骨基质的降解；术后2周时，对照组中的基质金属蛋白酶13表达降低；术后3，4周时，对照组中基质金属蛋白酶13表达呈上升趋势，可能是由于术后3周时，实验兔子的进食已恢复至术前，髁突继续持续受力可能会加重受伤软骨损伤，软骨再继续受力的情况下发生软骨的退化。DENG等^[33]在实验中发现，软骨的退行性变时基质金属蛋白酶13的表达会增加。实验组中基质金属蛋白酶13在术后1，2，3周时，表达量较对照组低，但呈一个上升趋势，并在术后4周时，达到峰值。实验组中基质金属蛋白酶13表达增加，可能与髁状软骨参与下方骨折愈合中的软骨内成骨有关^[34]。下颌骨的发育是软骨内成骨^[35]，而基质金属蛋白酶13是参与软骨内成骨的一个重要因子，所以在实验中基质金属蛋白酶13可能参与早期软骨基质的降解以及后期软骨下骨折的愈合。

甲状旁腺激素促进高位骨折固定术后软骨愈合的机制可能是上调Sox9的表达及早期抑制基质金属蛋白酶13表达来促进软骨细胞增殖、抑制软骨周围基质的降解，促进软骨损伤修复。ZHANG等^[17]实验发现：低浓度的甲状旁腺激素可以促进间质干细胞的软骨分化，Sox9、Col2a1和PTH1R的表达增加。DUTRA等^[36]通过实验证实了间歇性注射甲状旁腺激素可以提高Sox9的表达来促进软骨的形成。Sox9可以启动Col2a1的表达，促进软骨基质沉积，修复软骨损伤。LUGO等^[37]通过建立骨关节炎的实验模型，间歇性给予甲状旁腺激素后，基质金属蛋白酶13表达降低，骨关节炎得到改善^[38]。在此次实验中Sox9、基质金属蛋白酶13的表达量是不断变化的，间歇性注射低剂量甲状旁腺激素一方面抑制了早期的基质金属蛋白酶13表达，缓解了软骨基质的降解，减小了软骨损伤。另一方面，增强了Sox9的表达，促进间充质干细胞向成软骨分化，增加软骨细胞数量和软骨基质，促进软骨骨折修复。

该研究结果反映了甲状旁腺激素在高位骨折游离复位固定术后影响软骨中Sox9及基质金属蛋白酶13的表达情况，其相应的上下游信号分子尚需进一步研究。因观察时间较短，且没有剂量分组，尚不能得出甲状旁腺激素促进软骨修复的最适宜剂量，其疗程、后期疗效维持、安全性等问题仍需进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

甲状旁腺激素：是一种钙磷调节激素和骨改建调节激素。它可以改善骨小梁的显微结构，提高骨量及骨强度，临床上主要用于治疗绝经后妇女骨质疏松症，促进骨折的愈合。甲状旁腺激素对骨和软骨的再生有着双向调节作用，在持续性高剂量作用下，它可导致骨吸收；间断性低剂量作用下，它可促进骨和软骨增殖再生。

髁突游离骨折：髁突是颌面部骨折好发的部位，临床上将下颌骨髁突骨折分为髁突头部、髁突颈、髁突颈下或髁突基部骨折。髁突高位骨折时，易发生附着于髁突的翼外肌剥脱使其成为游离骨块，复位固定术后可能出现骨愈合不良甚至髁突吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

髁突高位骨折时，易发生附着于髁突的翼外肌剥脱使其成为游离骨块。游离髁突复位固定后可能发生髁突愈合不良甚至吸收、髁突骨折不愈合、髁突形态异常、颞颌关节功能紊乱和关节强直等并发症。髁突软骨作为下颌骨的发育中心，它的损伤不仅仅会引起骨关节炎，甚至会引起下颌骨生长发育相对停滞、髁突发生吸收。如何在促进髁突高位骨折固定术后愈合的同时促进软骨的修复一直是临床医生们的研究热点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程