1.5.2  实时荧光定量反转录-聚合酶链(qRT-PCR)检测Ⅰ，Ⅲ型胶原的mRNA表达量  取两组第1，3，7天各3个标本，称取等质量组织于研钵中边加液氮边研磨，至粉末状加入1 mL的Trizol，按照说明书提取总mRNA，经测量纯度与浓度后，按反转录试剂盒反转录为cDNA，用实时荧光定量PCR试剂盒加样后放入实时荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，实验数据采用2^-??Ct法(Ct值为荧光达到阈值时所需PCR的循环数)检测Ⅰ，Ⅲ型胶原表达量。引物序列及产物长度见表1。

2.2  创面的愈合情况  创面愈合过程中，空白对照组从术后第1天开始就干燥结痂，并且创面面积较前稍扩大，可能与皮肤组织张力有关；负压封闭引流治疗组在愈合过程中创面保持着湿润状态，并且在术后第1天创面有一个明显的收缩趋势，见图1A。与空白对照组相比，术后第1，3，7天负压封闭引流治疗组可明显提高创面愈合率(P < 0.05)，见图1B。

2.3  各组Ⅰ，Ⅲ型胶原的mRNA表达变化  qRT-PCR检测显示，术后第1，3，7天，空白组对照与负压封闭引流治疗组的Ⅰ，Ⅲ型胶原的mRNA表达均呈持续上升状态，且负压封闭引流治疗组的Ⅰ，Ⅲ型胶原的mRNA表达量均高于空白对照组(P < 0.05)，见图2A，B。

2.4  各组Ⅰ，Ⅲ型胶原的免疫组织化学检测结果  与同时间节点空白对照组相比，术后第1，3，7天负压封闭引流治疗组Ⅰ型胶原免疫组织化学的棕黄色面积明显增多，见图3A；负压封闭引流治疗组Ⅲ型胶原免疫组织化学的棕黄色面积术后第一天明显高于空白对照组，术后第3，7天棕黄色面积未见明显差异，见图3B；利用Image J软件对阳性区域进行半定量分析，负压封闭引流治疗组Ⅰ型胶原的平均光密度值在术后第1，3，7天均高于空白对照组(P < 0.05)，见图3C；负压封闭引流治疗组Ⅲ型胶原的平均光密度值在术后第一天明显高于空白对照组(P < 0.05)，术后第3，7天未见明显差异，见图3D；Ⅰ，Ⅲ胶原的比例在术后第1天负压封闭引流治疗组稍低于空白对照组，但无显著差异(P > 0.05)，术后第3，7天负压封闭引流治疗组的Ⅰ，Ⅲ胶原比例逐渐上升且均高于空白对照组(P < 0.05)，见图3E。

2.5  各组组织学变化  苏木精-伊红染色结果显示负压封闭引流治疗组的肉芽组织生成较多，能够早期填补创面缺损，见图4A；Massson三色染色结果可以看出负压封闭引流治疗组的创面再上皮化速度明显快于空白对照组，见图4B；术后第1天负压封闭引流治疗组的肉芽组织含量高于空白对照组(P < 0.05)，术后第3天负压封闭引流治疗组的肉芽组织含量稍高于空白对照组，但无显著差异(P > 0.05)，术后第7天负压封闭引流治疗组的肉芽组织含量下降且低于空白对照组(P < 0.05)，见图4C；术后第7天两组进行再上皮化长度分析，负压封闭引流治疗组的再上皮化长度明高于空白对照组(P < 0.05)，见图4D。

随着社会的不断发展和人口的不断增多，外伤、蛇咬伤、热压伤、冷冻伤、电化学以及其他原因所致的各种急慢性损伤创面呈逐年上升的趋势^[1-2]。创面延迟愈合甚至不愈合严重影响着患者的生活质量，严重的会伴发着感染^[3]、截肢^[4]，甚至影响着患者的生命^[5]，由此带来极大的社会影响。因此，如何高效促进创面早期愈合在临床治疗中具有重要的意义。

创面愈合是一个动态和复杂的生物学过程，主要包括以下4个相互重叠的过程：止血、炎症反应、肉芽组织再生及基质重塑^[6]，其中肉芽组织再生在创面愈合中发挥着重要的作用，创面延迟愈合甚至不愈合往往伴发着肉芽组织再生障碍。Ⅰ，Ⅲ型胶原作为肉芽组织中主要的构成部分发挥着重要的作用。Ⅲ型胶原纤维较细小，其含量决定着皮肤组织的弹性，主要出现在创面愈合早期，为后期Ⅰ型胶原再生提供着类似桥梁的作用；Ⅰ型胶原纤维较粗大，其含量决定着皮肤组织的抗拉能力，主要出现在创面愈合后期，为创面组织的抗拉强度提供着重要贡献^[7]。在创面愈合过程中，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例对维持创面组织的交联密度以及柔韧性发挥着重要作用。

负压封闭引流技术自20世纪90年代德国Fleischman博士首次提出以来^[8]，因其良好的促进创面愈合的效果，此技术逐渐应用到各种急慢性创面的治疗^[9-10]。实验旨在探讨负压封闭引流技术对大鼠皮肤急性创面损伤模型愈合过程中Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白表达的作用，以及此过程中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的变化，明确负压闭引流技术促进创面早期愈合的相关机制，为负压封闭引流技术在临床的推广和应用提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验

1.2  时间及地点  于2018年10月至2019年10月在郴州市第一人民医院转化医学研究中心完成。

1.3  材料  健康雄性SD大鼠36只，8周龄，体质量(250±20)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠在(25±2)℃环境中自由摄食进水，所有动物实验操作过程均遵循了国家相关实验动物使用准则并获得了郴州市第一人民医院动物伦理委员会批准，批准号：2019057。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组  36只雄性SD大鼠将其随机分成2组(每组18只)，即空白对照组、负压封闭引流治疗组；各组再分1，3，7 d共3个亚组，每组6只。

1.4.2  创面模型的建立和干预  根据MILAN等^[11]建立的大鼠背部创面模型方案，建立SD大鼠背部急性创面模型。创面的干预：空白对照组将18只大鼠按照处死时间(1，3，7 d)平均随机分成3个亚组(n=6)，创面用普通纱布(无菌)覆盖，隔天换药处理。负压封闭引流治疗组：同样分成3个亚组(n=6)，将负压封闭引流护创材料修剪成创面大小，取直径约2 mm的输液器管置入护创材料作为引流管，同时用透明贴膜将创面及敷料完全密封，引流管连接负压引流装置，每日予以125 mm Hg负压持续吸引^[12-13]，每日持续负压吸引治疗8 h。

1.4.3  取材  于实验结束后，腹腔注射体积分数2%戊巴比妥钠(4 mL/kg)麻醉，剪取创面标本，平均分为2份，一份经过40 g/L多聚甲醛固定，另一份经液氮冷冻后转入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.5  主要观察指标

1.5.1  创面连续拍照计算创面愈合率  于第1，3，7天通过相机固定高度拍照，用Image J 1.52软件计算创面面积和创面愈合率。计算公式^[11]：伤口愈合率(%)=(Ao-At)/ Ao×100，其中Ao为初始伤口面积，At为指定时间的伤口面积。

1.5.2  实时荧光定量反转录-聚合酶链(qRT-PCR)检测Ⅰ，Ⅲ型胶原的mRNA表达量  取两组第1，3，7天各3个标本，称取等质量组织于研钵中边加液氮边研磨，至粉末状加入1 mL的Trizol，按照说明书提取总mRNA，经测量纯度与浓度后，按反转录试剂盒反转录为cDNA，用实时荧光定量PCR试剂盒加样后放入实时荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，实验数据采用2^-∆∆Ct法(Ct值为荧光达到阈值时所需PCR的循环数)检测Ⅰ，Ⅲ型胶原表达量。引物序列及产物长度见表1。
                        

1.5.3  免疫组织化学检测Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白表达量及Ⅰ/Ⅲ型胶原比例  实验中一抗来源为兔抗大鼠Ⅰ，Ⅲ型胶原抗体(Proteintech公司，中国)；二抗来源为酶标羊抗兔抗体(SAB公司，美国)。两组标本各时间节点各取3个标本经多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，浸蜡包埋后切成5 μm厚度石蜡切片，组织脱蜡至水，柠檬酸钠抗原修复15 min，体积分数3%过氧化氢封闭20 min，分别加入Ⅰ型胶原蛋白一抗(1∶200)和Ⅲ型胶原蛋白一抗(1∶200)4 ℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色(Ⅰ型胶原50 s，Ⅲ型胶原40 s)，苏木精复染3 min，脱水，中性树脂封固。Ⅰ，Ⅲ型胶原定量方法：每个标本在400倍显微镜下拍照后随机选择3个视野，用Image J软件计算出每个视野的Ⅰ，Ⅲ型胶原阳性面积和积分光密度，平均光密度值=积分光密度/阳性面积。

1.5.4  组织学观察  石蜡切片脱蜡至水后按照苏木精-伊红染色试剂盒及Masson三色试剂盒进行组织学染色，显微镜拍照后用Image J软件进行组织肉芽组织面积及再上皮化长度分析。肉芽组织面积定量方法：每个组织标本进行全样本显微镜拍照(40倍，标尺500 μm)，拍照后用Image J软件计算出创面肉芽组织面积。再上皮化长度定量方法：每个组织标本进行全样本显微镜拍照(标尺500 μm)，拍照后用Image J软件计算出创面再上皮化长度。

1.6  统计学分析  采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据统计学处理和分析，计量资料以x(_)±s表示，不同组别间量化数据以非配对的Student’s t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

创面愈合主要包括以下几个时期：止血期、炎症反应期、肉芽组织再生期和基质重塑期，各个时期依照一定的次序，相互影响，相互交叉，某一个时期或几个时期出现异常都将导致创面愈合障碍。细胞外基质是肉芽组织的重要构成成分，在创面愈合过程中发挥着重要的作用，细胞外基质表达生成减少和分解代谢增多阻碍着创面的正常愈合。胶原纤维作为细胞外基质最主要的成分，占皮肤组织干重的70%-80%^[14]，主要由成纤维细胞和肌成纤维细胞的分泌表达并且受到多种细胞因子和信号通路的调控。

Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白是正常皮肤组织中最主要的胶原成分，分别占总胶原的80%-85%，10%-15%^[14]，在创面愈合过程中发挥着重要的作用，在创伤即刻，Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白就通过加强血小板聚集作用达到早期止血的疗效，在创面愈合过程中，Ⅲ型胶原蛋白的生成可以协助成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞等创面修复细胞的迁移和定植，并且Ⅲ型胶原蛋白还是Ⅰ型胶原发生过程中的重要调节元件，调控着Ⅰ型胶原的生成以及纤维直径^[15]。Ⅰ/Ⅲ型胶原比例决定着组织的抗拉伸强度及柔韧性，此比例升高，组织抗拉伸强度升高，然而柔韧性和弹性降低；此比例降低，组织弹性和柔韧性升高，抗拉伸强度降低，所以Ⅰ，Ⅲ型胶原比例在正常皮肤组织构成及创面愈合过程中都发挥着重要的作用，并且在正常皮肤组织与瘢痕组织中其比例也存在着明显的差异。皮肤组织中的Ⅰ，Ⅲ型胶原的含量并不是恒定的，其含量的多少由胶原的合成代谢及分解代谢平衡来完成^[16-17]。研究显示，在创面愈合早期，创面肉芽组织中Ⅲ型胶原蛋白表达量较高^[18]，Ⅰ型胶原蛋白表达量较少，随着创面愈合进程的进展，Ⅲ型胶原蛋白逐渐再吸收，Ⅰ型胶原蛋白沿着张力线逐渐生成和增多，呈现出较粗大的条束状，Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例随着创面愈合逐渐升高，预示着创面的胶原状态不断成熟^[19]，创面肉芽组织的抗拉伸能力不断增强^[20]。基于以上研究基础，实验拟观察负压封闭引流技术对大鼠急性创面愈合过程中的Ⅰ，Ⅲ型胶原和其比例的变化，探讨负压封闭引流技术促进创面早期愈合的可能机制，为负压封闭引流技术的临床应用提供一定的基础和实验依据。

负压封闭引流技术由德国Fleischmann博士于1993年发明并用于开放性骨折软组织损伤的临床治疗以来，负压封闭引流技术得到了极大的发展，有研究发现进一步确定了负压封闭引流技术在皮肤软组织损伤方面的良好的修复效果^[21]。研究显示，负压封闭引流技术可以促进皮肤创面的Ⅰ型胶原蛋白的表达，然而负压封闭引流技术对急性皮肤创面愈合过程中的Ⅲ型胶原蛋白表达量和I/Ⅲ型胶原比例的变化却鲜有报道。

实验中可以观察到，负压封闭引流技术在术后第一天提高了Ⅲ型胶原蛋白的表达水平，推测可能是由于负压封闭引流技术提供了局部组织的低氧状态^[22]，促发细胞生成和释放腺苷^[23-24]，进一步促进下游信号通路促发了Ⅲ型胶原蛋白的表达^[25]。然而令人诧异的是，在术后第3，5天，负压封闭引流治疗组Ⅲ型胶原蛋白表达量逐渐降低，可能是创面愈合后期Ⅲ型胶原蛋白分解代谢增强。有研究表明，Ⅲ型胶原蛋白是Ⅰ型胶原蛋白生成的重要调节因子，实验中也可以发现负压封闭引流治疗组的Ⅰ型胶原蛋白表达在创面愈合过程中均呈逐渐增多的趋势，表达量均高于空白对照组，这一结果可能得益于负压封闭引流技术通过机械作用，促使创面组织细胞表达转化生长因子β1蛋白^[26-28]，通过转化生长因子β1/Smad信号通路促进Ⅰ型胶原蛋白的表达^[29-30]，Ⅰ型胶原蛋白又可以通过正向作用促使更多的成纤维细胞生成和胶原表达^[31-32]。有研究发现，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例在维持组织结构完整性及交联强度发挥着重要的作用，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例调节新生纤维的直径^[20]，决定肉芽组织的结构，此比例下降是造成组织结构稳定性及力学性能下降的直接原因^[33]，稍高的 Ⅰ/Ⅲ型胶原比例更有利于组织结构完整性的维持^[34]。实验也发现，在创面愈合中后期负压封闭引流技术明显提高了创面肉芽组织的Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，这可能为创面的早期愈合以及肉芽组织的稳定发挥了重要作用。

此外，实验也通过组织学检测对创面肉芽组织面积进行了定量分析。众所周知，肉芽组织在创面愈合过程中发挥着重要的作用，它发挥着填补缺损和保护创面的双重作用。实验中观察到负压封闭引流技术在创面愈合早期促进了肉芽组织的生成，推测可能是由于负压引流装置可以使得局部创面保持湿润状态，进而促进了肉芽组织的再生^[35]。创面愈合后期负压封闭引流治疗组肉芽组织面积低于空白对照组，可能是由于负压封闭引流技术通过调控基质金属蛋白酶及其组织抑制因子的胶原代谢平衡，促进了后期的基质重塑^[36]，减少了肉芽组织面积，优化了胶原结构，促进了创面的闭合。同时在实验中也观察到了在术后第7天负压封闭引流治疗组的再上皮化长度明显高于空白对照组，此结果可能得益于负压封闭引流技术在创面愈合早期促进了肉芽组织增生，为角质形成细胞的爬行提供了平台，也有人提出是由于负压封闭引流技术的机械牵拉作用提高了角质形成细胞的增殖和迁移^[37]，相关机制有待进一步探讨。

综上所述，实验进一步证实了负压封闭引流技术可以促进创面的早期愈合，并且证明了其作用机制之一可能是促进Ⅰ/Ⅲ型胶原表达，提升Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，提高创面肉芽组织稳定性及促进创面收缩，进而促进创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

负压封闭引流技术：是一种用来处理各种急慢性复杂伤口的技术。这种技术主要通过亲水材料聚乙烯醇和疏水材料聚氨酯以及引流管来完成，安全无毒的聚乙烯醇覆盖在皮肤缺损或者软组织损伤部位，在它上面覆盖一层疏水材料聚氨酯，两者之间置入引流管后连接负压吸引装置，设置负压值，医用贴膜封闭由此形成密闭空间，促进创面愈合。

Ⅰ/Ⅲ型胶原比例：皮肤组织中最丰富的物质是胶原蛋白，而Ⅰ/Ⅲ型胶原的量占总胶原的90%以上，Ⅰ型胶原纤维较粗壮，呈条束状，决定着皮层的抗拉伸强度；Ⅲ型胶原纤维较细微，呈疏松网状结构，决定着皮肤的韧性及弹性，所以Ⅰ/Ⅲ型胶原比例决定着皮肤的愈合质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

实验旨在探讨负压封闭引流技术对大鼠皮肤急性创面损伤模型愈合过程中Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白表达的作用，以及此过程中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的变化，明确负压闭引流技术促进创面早期愈合的相关机制，为负压封闭引流技术在临床的推广和应用提供着实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程