补阳还五汤对脊髓损伤后Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1459

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (31): 4986-4991.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1459

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补阳还五汤对脊髓损伤后Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

林晓敏1，潘伟滨1，吴玉琼1，范筱2

(1漳州卫生职业学院，福建省漳州市 363000；2青岛市市立医院，山东省青岛市 266000)

收稿日期:2019-04-27 出版日期:2019-11-08 发布日期:2019-11-08
通讯作者: 范筱，博士，主治医师，青岛市市立医院，山东省青岛市 266000
作者简介:林晓敏，女，1990年生，福建省平和县人，汉族，2017年福建中医药大学毕业，硕士，助教，主要从事康复方面研究。
基金资助:
福建省中青年教师教育科研社科项目(社科)(JAS161084)，项目负责人：潘伟滨

Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of collagen type I and IV after spinal cord injury

Lin Xiaomin1, Pan Weibin1, Wu Yuqiong1, Fan Xiao2

(1Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China; 2Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China)

Received:2019-04-27 Online:2019-11-08 Published:2019-11-08
Contact: Fan Xiao, MD, Attending physician, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Lin Xiaomin, Master, Assistant lecturer, Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China
Supported by:
the Social Science Project of Education Research for Middle-Aged Young Teachers of Fujian Province, No. JAS161084 (to PWB)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Ⅰ型胶原蛋白：是由成骨细胞分泌的一种重要的、基本的蛋白质，长度约300 nm，直径约1.5 nm，呈棒状，由3条肽链组成，其中有2条α(Ⅰ)链，1条α(Ⅱ)链，其参与构成骨架结构并发挥力学稳定作用，促进损伤后血管和微血管重建，在脊髓损伤的修复中起到重要作用。
补阳还五汤：为著名的中医方剂，由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花药物组成，具有补气，活血，通络的功效。此方对于气虚血瘀所致的半身不遂有一定疗效，临床常用于治疗脑血管意外后遗症、小儿麻痹后遗症，以及脊髓损伤等原因引起的肢体功能障碍。

摘要
背景：研究表明，Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白有利于脊髓损伤后肢体运动功能的恢复。
目的：通过观察脊髓损伤大鼠肢体运动功能变化及Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达，探讨补阳还五汤对脊髓损伤后大鼠肢体运动功能改善的可能机制。
方法：实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准[批准号为SYXK(闽)2013-005]。将54只大鼠随机分为3组：假手组(n=18)、模型组(n=18)和补阳还五汤组(n=18)。假手术组切除椎板后立即缝合伤口，其余2组切除椎板后应用NYU脊髓打击器建立脊髓损伤模型。造模后第1天开始补阳还五汤组给予补阳还五汤1 mL灌胃，模型组和假手术组术后蒸馏水1 mL灌胃。干预后1，3，5，7 d对各组大鼠进行BBB肢体运动功能评分；干预7 d后取材，尼式染色观察脊髓神经元形态和免疫组织化学检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达；电镜观察脊髓髓鞘超微结构，Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的蛋白表达量。
结果与结论：①干预第5天后，补阳还五汤组的BBB肢体运动功能评分显著高于同期的模型组(P < 0.05)；②尼式染色显示补阳还五汤组的细胞形态较为完整，细胞水肿较轻，瘀血面积较小，神经元恢复情况好于模型组；③电镜实验发现补阳还五汤组的髓鞘形态较模型组完整，水肿情况较轻，与尼式染色结果一致；④免疫组织化学显示补阳还五汤组的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达量均较模型组显著增多(P < 0.05)；⑤Western blot显示补阳还五汤组的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达量均较模型组显著增多(P < 0.05)；⑥结果说明，补阳还五汤能够改善脊髓损伤后大鼠的肢体运动功能障碍，其机制可能与增加Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2740-9821(林晓敏)

关键词: 脊髓损伤, 补阳还五汤, Ⅰ型胶原蛋白, Ⅳ型胶原蛋白, 髓鞘, 超微结构

Abstract:

BACKGROUND: Collagen type I and IV are shown to be beneficial for limb locomotion recovery after spinal cord injury.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Buyang Huanwu decoction on the rehabilitation of limb locomotion of rats after spinal cord injury by observing the changes of limb locomotion and expression levels of collagen type I and IV.
METHODS: The study was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, approval number: SYXK2013-005. Fifty-four Sprague-Dawley rats were divided into three groups, sham, model and Buyang Huanwu decoction groups (n=18/group). Rats in the sham group underwent the laminectomy and rats in the other groups were used for establishing the spinal cord injury model by NYU impactor. The rats in the Buyang Huanwu decoction group, and sham and model groups were administrated 1 mL of Buyang Huanwu decoction and normal saline via gavage, respectively, at 1 day post-injury. Basso, Beattie, and Bresnahan limb locomotion scores were evaluated at 1, 3, 5 and 7 days after injury. At 7 days after injury, samples were removed for Nissl staining to observe the morphology of spinal cord neurons and the expression levels of collagen type I and IV were detected by immunohistochemistry. The ultrastructures of medullary sheath were observed under transmission electron microscope. The expression levels of collagen type I and IV proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Basso, Beattie, and Bresnahan limb locomotion scores from the fifth day after modeling in the Buyang Huanwu decoction group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). (2) Nissl staining showed that in the Buyang Huanwu decoction group, the structure of neurons was complete, cell edema was slight, hemostasis area was small, and the recovery of neurons was better than that in the model group. (3) Transmission electron microscope showed that the structure of myelin sheath in the Buyang Huanwu decoction group was better than that in the model group, and with slight edema, which were similar with the Nissl staining results. (4) Immunohistochemistry results showed that the expression levels of collagen type I and IV in the Buyang Huanwu decoction group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). (5) Western blot assay results showed that expressions of collagen type I and IV proteins in the Buyang Huanwu decoction group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). (6) In summary, Buyang Huanwu decoction can promote the rehabilitation of limb locomotion of rats after spinal cord injury, possibly by up-regulating the expressions of collagen type I and IV.

Key words: spinal cord injury, Buyang Huanwu decoction, collagen type I, collagen type IV, medullary sheath, ultrastructure

中图分类号:

林晓敏，潘伟滨，吴玉琼，范筱. 补阳还五汤对脊髓损伤后Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 4986-4991.

Lin Xiaomin1, Pan Weibin1, Wu Yuqiong1, Fan Xiao2. Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of collagen type I and IV after spinal cord injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 4986-4991.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用54只大鼠，第1批实验假手术组大鼠无死亡，造模组36只大鼠术后7 d内由于尿潴留和感染死亡5只；第2批再补充10只大鼠，即完成实验需求的大鼠。

2.2 各组大鼠BBB肢体功能评分从图1，表1可以看出随着时间的推移，模型组和补阳还五汤组大鼠的BBB肢体运动功能评分逐渐提高，说明脊髓损伤大鼠的肢体功能逐渐恢复。从干预第3天起，补阳还五汤组大鼠的BBB肢体运动功能评分高于同期模型组大鼠 (P < 0.05)。

2.3 尼氏染色观察大鼠脊髓神经元形态见图2。假手术组脊髓分为灰质和白质，界限清晰，灰质呈完整的蝴蝶状。其中神经细胞胞质内可见虎斑样尼氏体，有较大且明显的核仁；模型组神经元细胞空洞较多且大，细胞核肿胀，甚至出现核仁消失的情况；补阳还五汤组较模型组相比，脊髓结构破环较轻，结构稍完整，瘀血程度较轻。

2.4 大鼠髓鞘的超微结构电镜观察显示假手术组髓鞘结构清晰完整，线粒体、粗面内质网等细胞器形态正常，无水肿现象。模型组与补阳还五汤组相比，髓鞘结构较为松散，髓鞘出现破碎，微管空泡样变严重，线粒体较为肿胀，轴突和髓鞘分离。见图3。

2.5 免疫组织化学检测大鼠脊髓组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达 Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白在假手术组均未见到明显表达。Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白弥散性见于脊髓实质的基质成分中，阳性表达呈棕褐色。模型组和补阳还五汤组的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达均显著高于假手术组(P < 0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组大鼠的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达均较高(P < 0.05)。见表2，图4。

2.6 Western blot检测大鼠脊髓组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达量假手术大鼠Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达均少于模型组和补阳还五汤组(P < 0.05)。与模型组比较，补阳还五汤组大鼠脊髓损伤区Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达较高(P < 0.05)。见表3，图5。

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引言

近年来，随着交通意外发生的增多及生活压力增大，脊髓损伤的发病率越来越高^[1-2]，并伴随着各种后遗症，严重降低人们的生活质量。脊髓损伤会引发一系列功能障碍，包括神经功能损伤、肢体运动障碍等，严重者可导致患者截瘫或四肢瘫^[3]。因此，如何有效的控制和治疗脊髓损伤后的运动功能障碍在脊髓损伤的临床治疗中有重要的意义。

脊髓损伤的病理反应十分复杂，包括血管和微血管循环障碍及病变、炎症反应、脱髓鞘反应及氧自由基释放等^[4]。其中，因为血管和微血管循环障碍严重影响脊髓损伤处的血液供应，导致促进脊髓损伤修复的有利物质不能及时到达脊髓损伤处和损伤局部的有害物质不能及时排除，因此血管和微血管重建在脊髓损伤后的神经修复和轴突再生发挥重要作用。Ⅰ型胶原蛋白是促进损伤后血管和微血管重建的重要物质，在血管构建过程中起到重要的促进作用。此外，Ⅰ型胶原蛋白参与构成骨架结构并发挥力学稳定作用，是由成骨细胞分泌的一种重要的、基本的蛋白质^[5-6]。除了Ⅰ型胶原蛋白以外，胶原蛋白家族中的Ⅳ型胶原蛋白也在促进损伤修复过程中发挥重要作用。Ⅳ型胶原蛋白广泛存在于基膜之中，是基膜中最丰富的物质，可有效促进基膜的重塑和修复^[7]。Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白在脊髓损伤后表达发生变化，是损伤处血管的构建和基膜重塑的关键因素。研究表明，Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白有利于脊髓损伤后肢体运动功能的恢复^[8]。

补阳还五汤是中国清代著名医家王清任所创立的经典方剂，该方由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花药物组成。近些年来，已有报道证实该方剂在促进损伤神经再生修复等方面有其独特的效果^[9]。研究旨在研究补阳还五汤对脊髓损伤模型大鼠脊髓损伤处Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的作用，以明确补阳还五汤治疗脊髓损伤的相关作用机制，为补阳还五汤的临床应用提供有力的理论基础和依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年12月至2018年6月在福建中医药大学中西医结合研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选取54只SPF级健康成年雄性SD大鼠，年龄为10-12周育龄，体质量为(250±30)g。此动物实验均购于上海斯莱克实验动物公司，饲养于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(闽)2013-005。先将大鼠按随机数表法随机分为假手术组(n=18)和造模组(n=36)。假手术组不损伤脊髓，仅去除椎板；造模组去除椎板后行NYU脊髓打击器建立脊髓损伤模型。造模成功后将36只经造模的大鼠随机再分为模型组(n=18)和补阳还五汤组(n=18)。

1.3.2 药品、试剂与仪器补阳还五汤：黄芪120 g，当归 6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g。上述药物购于福建中医药大学附属第三人民医院，并由该院制剂室加工成1 mL汤药含生药4 g，即4 g/mL质量浓度，无菌封瓶，-20 ℃冰箱保存备用。水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；苏木精-伊红(索莱宝，北京)；抗体：兔抗大鼠Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体(CST，美国)，兔抗大鼠Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体(CST，美国)，二抗(CST，美国)；试剂盒：免疫组织化学试剂盒(博士德，武汉)，尼氏染色试剂盒(索莱宝，北京)；仪器：透射电子显微镜(日立，日本)，光学显微镜(莱卡，德国)，NYU脊髓打击器(新泽西大学，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立待大鼠适应实验室环境后即进行实验。术前将大鼠禁食12 h，腹腔注射体积分数7%水合氯醛，注射量为5 mL/kg。在室温22 ℃及适度湿度条件下行NYU脊髓打击器建立脊髓损伤模型。造模方法参照参考文献[10]，具体操作为：备皮消毒；沿T₉-T₁₁区域长轴作一长约3 cm纵切口，逐层暴露，钝性分离附着的肌肉和纤维；咬除椎板，确保硬脊膜暴露清晰；固定大鼠，设置打击器打击高度为12.5 mm^[11-12]，并瞄准脊髓打击，打击后大鼠尾部出现剧烈摆动伴随后肢瞬时收缩扑动提示造模成功；缝合伤口。术后保暖，人工按摩大鼠膀胱2次/d，前肢注射4×10⁴U青霉素。

1.4.2 干预造模后第1天开始进行干预。补阳还五汤组给予制备好的补阳还五汤1 mL灌胃^[13]，模型组和假手术组术后蒸馏水1 mL灌胃，连续7 d。

1.4.3 行为学评分采用脊髓损伤肢体运动功能评分(BBB肢体运动功能评分)评价大鼠的肢体运动功能，于干预的第1，3，5，7天进行。大鼠在空旷场地内活动，观察其臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。0分无可见后肢运动，为完全瘫痪；21分为持续性协调和稳定步态，为正常满分。由2名研究者单独进行评分，每只大鼠观察时间为4 min，最后取2名研究者评分的平均分。

1.4.4 取材干预7 d后取材。麻醉完成后，暴露腹腔进行腹腔静脉放血。尼式染色和免疫组织化学实验可共用大鼠，采用多聚甲醛灌注取材脊髓组织。用于电镜检测的组织浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中并切成大约1 mm×1 mm×1 mm的小块，3%戊二醇固定液4 ℃环境下浸泡。用于Western blot检测的组织采用直接取材，直接取1 cm长组织并生理盐水冲洗后，放于EP管-80 ℃冰箱内保存。

1.5 主要观察指标

1.5.1 尼式染色观察脊髓神经元形态石蜡包埋后切片，作5 μm的石蜡切片。切片脱蜡至水，按照尼氏染色试剂盒说明书，先将切片浸入染色液中，放入60 ℃温箱中染色50 min；冲洗后再浸入分色液中，分色2 min并观察染色情况，染色良好则冲洗后晾干、封固。

1.5.2 免疫组织化学检测脊髓组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达一抗为兔抗大鼠Ⅰ型胶原蛋白抗体和兔抗大鼠Ⅳ型胶原蛋白抗体。试剂盒由ABCD四部分组成。切片厚度同尼氏染色，先于60 ℃温箱中过夜烤片，次日进行常规逐级脱苯、脱蜡和入水。加入修复液使用微波炉进行抗原修复10 min，冷却；加入过氧化物酶阻断剂室温反应 5 min；滴入即用型非免疫血清室温孵育5 min；勿洗，分别加入Ⅰ型胶原蛋白一抗(1∶200)和Ⅳ型胶原蛋白一抗(1∶150)4 ℃冰箱孵育过夜。次日晨取出后放置于室温复温40 min，恢复常温后用PBS冲洗，5 min×3次；室温下加入即用型生物素标记二抗反应5 min；加入即用型链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶标记三抗。除了加入B液后勿洗直接加入一抗，其余每步之间均用PBS冲洗，5 min×3次。最后用现配现用的DAB 显色剂显色(Ⅰ型胶原蛋白40 s，Ⅳ型胶原蛋白30 s)，自来水冲洗干净残留显色剂；苏木精复染，纯水返蓝，晾干后封固。请2名熟悉光学显微镜操作方法但未知此次实验目的的专业人员，先在光学显微镜下用10×进行所需部位的总体定位观察和拍照，再用200×局部观察并拍照记录。

1.5.3 电镜观察脊髓髓鞘超微结构将事先备好的组织进一步切块，梯度脱水，4 ℃条件下3%戊二醛-15g/L多聚甲醛混合液固定4 h，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾固定，逐级温度聚合以及包埋后，切片、染色制成样本。在透射电镜下观察样本，并用电镜CCD相机进行图像采集与分析。

1.5.4 Western Blot脊髓组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达将-20℃保存备用的组织加入裂解液，冰浴 60 min。14 000×g离心10 min，定量蛋白。在酶标仪中测得标准曲线和吸光度，算出蛋白浓度。蛋白变性后，将样品于相应浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离，待Marker蛋白跑至玻璃板底部且样本蛋白基本呈一条直线沉于底部，则停止跑胶。转至PVDF膜封闭，TPBS洗3次。封闭液封闭1.5 h，先后加入Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白一抗(1∶1 000)、二抗(1∶1 000)，每次步骤间隔均用TBST漂洗。用TBST清洗去除二抗后开始显影。将膜置于化学发光试剂中反应1 min，在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统分析。

1.6 统计学分析应用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准误表示。两组间比较采用两独立样本t 检验或Mann-Whitney U 检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐采用LSD法，不齐则采用Game’s-Howell法；数据不符合正态分布则进行秩和检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

脊髓损伤是引起中青年患者瘫痪的常见原因之一，该疾病会导致损伤平面以下神经麻痹、肌肉无力和关节活动异常等功能障碍^[14]。因此探讨脊髓损伤的病理机制及针对这些机制制定治疗方案，对提高脊髓损伤的临床疗效具有重大意义。

如何建立与临床相近且成功率高的脊髓损伤模型是此次研究的重点和基础。已有研究证实，基于经典Allen’s原理进行改良的急性脊髓损伤模型的制备较科学，其打击高度为12.5 mm，既能制备与临床相近的脊髓损伤模型，又能降低死亡率^[15]，故此次实验采用此种模型制备的方法。

目前已发现20多种关于脊髓损伤的病理损伤机制。脊髓损伤急性期的病理变化涉及到炎症反应、血管损伤、离子紊乱及神经性毒性等等^[16]。脊髓损伤后会导致小动脉、小静脉和毛细血管的闭阻，导致血流不畅，加重损伤区的细胞死亡^[17]；钙离子大量内流引发的神经性毒性导致细胞凋亡^[18]；内皮细胞在一定条件下产生活性氧，活性氧又可以通过改变脂质对细胞造成损害等等^[19]。其中，脊髓损伤后微血管和基膜的变化对其病情的进一步加重有着重要的影响。脊髓损伤后，基膜破碎，血管内成分渗出，进入脊髓，破坏了血管内皮的形态结构，并且引发炎性反应。在此过程中伴随着胶质瘢痕的形成，限制了轴突的再生，从而影响了神经功能的恢复^[20-21]。另一方面，血管和微血管的损伤，会阻碍血流的畅通，损伤毒性物质无法排出，也会影响脊髓损伤后功能的恢复^[5-6]。Ⅰ型胶原蛋白在维持骨与结缔组织的完整及血管损伤的修复中起到主要作用^[22-23]。同时，Ⅰ型胶原蛋白是一种细胞内外传递信息的刺激，可以起到信号分子的作用^[24-25]。有研究证实，由于Ⅰ型胶原蛋白具有与神经导管相似的功能特点，可作为支架而为轴突修复和重建提供有力条件和环境，促进神经残端的修复^[26]。在此次实验中，补阳还五汤组Ⅰ型胶原蛋白阳性表达和蛋白表达均高于模型组，说明补阳还五汤有效增加了Ⅰ型胶原蛋白的含量，促进了神经修复。除Ⅰ型胶原蛋白在脊髓损伤修复中具有重要作用外，Ⅳ型胶原蛋白亦是脊髓损伤后组织修复的关键因子。研究表明，Ⅳ型胶原蛋白起到连接全身组织的作用，对维持人体内环境的平稳具有重要意义^[27-28]。而且，Ⅳ型胶原蛋白是构成微血管管壁和基膜的主要成分之一，在脊髓实质中的其他部分并无明显表达^[8]。在此次实验中，与模型组相比较，补阳还五汤组的Ⅳ型胶原蛋白表达较高，说明给予大鼠补阳还五汤灌胃后，脊髓损伤的大鼠Ⅳ型胶原蛋白升高，从而促进了微血管管壁的修复。

中医学认为脊髓损伤后经脉闭阻，气血亏虚导致肢体运动功能障碍加重。治疗当以补气活血、祛瘀通脉为首要原则。补阳还五汤由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花组成，方中以黄芪为主药，补益元气、祛瘀通络；当归尾活血通络而不伤血，为臣药；赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾以活血祛瘀；地龙通经活络为佐药。因此，从中医基础理论方面来讲，补阳还五汤适用于脊髓损伤的治疗。现代研究也证实，补阳还五汤对于治疗脊髓损伤后肢体障碍和神经功能有一定的疗效^[29]，且机制较复杂。张继平等^[30]应用补阳还五汤对脊髓损伤大鼠进行灌胃干预后发现，灌胃后的大鼠后肢肢体运动功能障碍明显改善。另外有实验研究发现，补阳还五汤能够减少脊髓损伤大鼠损伤部位的细胞凋亡现象，有助于脊髓损伤后功能的恢复^[13]。此次实验研究发现，经补阳还五汤灌胃干预过的脊髓损伤大鼠，其BBB肢体运动功能评分明显高于模型组，说明补阳还五汤改善了其损伤后运动功能障碍。此次实验结果与上述结果相一致。补阳还五汤在的作用机制较复杂，目前已知的机制包括：抑制脊髓进一步损伤过程，扩张组织微血管，从而改善血液流动性和微循环，减轻血栓形成，从而缓解组织缺血、缺氧等病理状态^[31]；补阳还五汤可以抑制炎症细胞的增殖，如抑制星形胶质细胞的活化，从而减少瘢痕的形成^[32]；补阳还五汤可以提高神经元的存活率，促进轴突的新建，减轻细胞萎缩^[33]，并消除部分水肿^[34]。实验中，通过NYU脊髓打击器建立脊髓损伤后，导致微血管和血管损伤、基膜破损，补阳还五汤可能通过调控Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达，促进了微血管、血管和基膜的修复。使用补阳还五汤灌胃后，由于其补中益气、活血通络的作用，促进微血管和基膜的重建与修复，减轻损伤部位的细胞凋亡和神经破坏，因此提高了脊髓损伤大鼠的BBB肢体功能评分。尼式染色和电镜实验分别从宏观和超微两方面观察脊髓结构和髓鞘形态，均发现补阳还五汤组优于模型组，说明补阳还五汤可以促进脊髓结构和髓鞘形态的修复。免疫组织化学和Western blot实验中，补阳还五汤组大鼠的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达均增加，提示脊髓损伤大鼠经过补阳还五汤干预后，其组织和血管修复能力提高，促进了肢体功能的恢复。

因此，实验初步证实了补阳还五汤能够促进脊髓损伤后大鼠肢体功能的恢复，并且证明了其作用机制之一可能通过调控Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的表达而有利于脊髓损伤后微血管重建和基膜重塑，促进损伤组织的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补阳还五汤对脊髓损伤后Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of collagen type I and IV after spinal cord injury

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