骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的形态学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0661

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5281-5285.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0661

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骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的形态学变化

王志聪¹，刘跃洪¹，周庆¹，陈曦¹，周宇¹，孙慧君²，刘谟震³

¹德阳市人民医院骨科，四川省德阳市 618000；²大连医科大学药学院，辽宁省大连市 116044；³大连医科大学附属第一医院骨科，辽宁省大连市 116011

修回日期:2018-07-12 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 刘跃洪，主任医师，德阳市人民医院骨科，四川省德阳市 618000；并列通讯作者：刘谟震，博士，主任医师，教授，硕士生导师，大连医科大学附属第一医院骨科，辽宁省大连市 116044
作者简介:王志聪，男，1988年生，硕士，医师，主要从事关节软骨损伤组织工程修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81273508，81350017)；2017年四川省卫生和计划生育委员会重点科研项目(17ZD023)

Morphological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into chondrocytes in vitro

Wang Zhi-cong¹, Liu Yue-hong¹, Zhou Qing¹, Chen Xi¹, Zhou Yu¹, Sun Hui-jun², Liu Mo-zhen³

¹Department of Orthopedics, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China; ²School of Clinical Pharmacology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ³Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China

Revised:2018-07-12 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Liu Yue-hong, Chief physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China； Liu Mo-zhen, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China
About author:Wang Zhi-cong, Master, Physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81273508, 81350017; the Major Scientific Research Project of Sichuan Provincial Health and Family Planning Committee in 2017, No. 17ZD023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
转化生长因子β3：在哺乳动物胚胎发育过程中，能够促进形态发生，并对脊椎形成、肢端发芽、面骨形成及心脏瓣膜的形成起重要作用。转化生长因子β3可调控骨形成，影响成年骨再生。
SOX9基因：是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是前软骨细胞浓聚所必需的因子，促进成骨的同时也抑制骨骺细胞的终末分化，以延长软骨发育成熟过程，抑制软骨细胞凋亡，并指导Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞在向软骨细胞分化过程中可形成聚合体，但是该形态学特点是否可代表骨髓间充质干细胞已经成软骨分化尚无研究报道。
目的：观察骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中聚合体的形成和成软骨分化情况。
方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代至第6代时备用。对照组用无血清LG-DMEM培养基培养14 d，诱导组用含转化生长因子β3的成软骨完全诱导培养基培养14 d，倒置显微镜观察诱导过程中细胞形态变化；免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、qRT-PCR检测成软骨特异指标Ⅱ型胶原、蛋白多糖和成软骨转录因子SOX9的基因表达及蛋白合成情况。
结果与结论：①与对照组相比，诱导组骨髓间充质干细胞在第3天失去典型的成纤维形态，第7天开始形成成簇的单层聚合体，第14天形成直径更大的多层聚合体；②聚合体的免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色均阳性，而聚合体外的单个细胞无特异染色；③qRT-PCR亦证实诱导组有成软骨特异基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9表达；④上述研究结果提示骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中聚合体的形成可作为成软骨分化的一种形态学检测指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6252-5062(王志聪)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 成软骨分化, 软骨细胞, 聚合体, 形态学, Ⅱ型胶原, 蛋白多糖, SOX9转录因子, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can compact to form aggregates during chondrogenic differentiation, but whether the formation of aggregation is a prerequisite for chondrogenic induction is not yet documented.
OBJECTIVE: To observe the morphological characteristics of BMSCs differentiating into chondrocytes.
METHODS: BMSCs were cultured in vitro and passage 6 cells were used for the following experiments. Cells were induced in serum-free LG-DMEM medium as control group or in complete chondrogenic induction medium containing transforming growth factor β3 as induction group for 14 days. Cellular morphology during differentiation process was observed by inverted microscope. Chondrocyte-specific markers, including type II collagen, aggrecan and chondrogenic transcription factor SOX9, were evaluated by immunofluorescence, toluidine blue staining and quantitative RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the cells began to lose the typical morphology at day 3 of chondrogenic induction, and then compacted to form mono-layered aggregates and multi-layered aggregates at days 7 and 14, respectively. The aggregates were positive for immunofluorescence and toluidine blue staining, while no staining was detected in the single cells. qRT-PCR results also confirmed the mRNA expression of type II collagen, aggrecan and SOX9 in the cells after chondrogenic induction. Therefore, these abovementioned results suggest that the formation of aggregation in BMSCs can be one of morphological markers of chondrogenic differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Chondrocytes, Collagen Type II, SOX9 Transcription Factor, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王志聪，刘跃洪，周庆，陈曦，周宇，孙慧君，刘谟震. 骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的形态学变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5281-5285.

Wang Zhi-cong, Liu Yue-hong, Zhou Qing, Chen Xi, Zhou Yu, Sun Hui-jun, Liu Mo-zhen. Morphological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into chondrocytes in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5281-5285.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年5至12月在大连医科大学药学院完成。

1.3 材料 低糖DMEM细胞培养液、优级胎牛血清(Hyclone公司)；成软骨诱导分化完全培养基(广州赛业公司)；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体(GeneTex公司)；兔抗大鼠蛋白多糖抗体(Millipore公司)；兔抗大鼠SOX9抗体(Abcam公司)；甲苯胺蓝(Sigma公司)；细胞培养箱(Thermo公司)；倒置生物相差显微镜(Olympus公司)；荧光显微镜(Leica公司)；PCR仪(Appied Biosystems公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs培养与成软骨诱导分化 SD大鼠BMSCs购于广州赛业公司(货号：RASMX-01001)，细胞表面的特异指标CD29、CD44和CD90均大于95%，而CD34、CD45和CD11b均小于2%，同时具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化的潜能，符合国际细胞治疗学会所制定的标准^[13]。用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的LG-DMEM培养基培养，每2 d更换1次培养基，当细胞融合率达到90%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶2传代培养。传代培养至第6代时备用。

参照Glennon-Alty等^[8]研究进行成软骨诱导分化。取生长状态良好的第6代BMSCs以1×10⁴/孔的数量接种于24孔板，孵箱内过夜，待细胞贴壁后，随机分为2组：对照组(用无血清LG-DMEM培养基培养)；诱导组(用含转化生长因子β3的成软骨完全诱导培养基培养)。每孔各加入0.5 mL相应培养基，隔日换液，倒置生物相差显微镜观察细胞形态变化，共诱导14 d。诱导培养基的成分包括成软骨分化诱导基础培养基、0.1 µmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、100 mg/L丙酮酸钠、40 mg/L脯氨酸及10 μg/L转化生长因子β3，每次换液时加入新鲜转化生长因子β3。

1.4.2 成软骨分化的组织学鉴定 诱导至14 d时弃去上清，PBS洗涤3次×5 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min后，分别进行：①免疫荧光染色：PBS洗涤3次×5 min，以终止固定；将固定后的细胞用0.3%Triton×100透化10 min，PBS洗涤3次×5 min；体积分数为5%胎牛血清室温封闭30 min，加入待检测一抗后置于湿盒，4 ℃过夜；室温复温30 min，PBS洗涤3次×5 min；滴加羊抗大鼠-FITC或羊抗大鼠-Cy3抗体(1∶200)室温孵育1 h；DAPI染核3 min后于倒置荧光显微镜下观察。待测抗原包括：Ⅱ型胶原(1∶100)、蛋白多糖(1∶200)、SOX9(1∶300)；②甲苯胺蓝染色：1%甲苯胺蓝液染色5 min，蒸馏水洗涤3次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。
1.4.3 qRT-PCR检测成软骨分化特异基因的表达 按照Trizol一步法分别提取总RNA，使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。反转录引物序列由Takara Biotechology公司设计合成，具体如下：Ⅱ型胶原上游5'-CGC CAC GGT CCT ACA ATG TC-3'，下游5'-GTC ACC TCT GGG TCC TTG TTC AC-3'；蛋白多糖上游5'-TGG CAT TGA GGA CAG CGA AG-3'，下游5'-TCC AGT GTG TAG CGT GTG GAA ATA G-3'；SOX9上游5'-GCA GAG ACT GAA GAC CCT ACA CAG A-3'，下游5'-GAG GCA ACT TCA CGC TGC AA-3'；GAPDH上游5'-TAT GAC TCT ACC CAC GGC AA-3'，下游5'-ATA CTC AGC ACC AGC ATC ACC-3'。用Trans-Start@Top Green qPCR SuperMix扩增反应试剂盒进行qRT-PCR扩增，每个反应3个复孔，以GAPDH作为内参检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9的基因表达。

1.5 主要观察指标 ①BMSCs诱导过程中倒置显微镜下观察形态学改变；②免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色及qRT-PCR检测BMSCs成软骨分化情况。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0软件(SPSS，美国)进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

由于软骨组织缺乏血管、神经及淋巴管，此外损伤深度常常不能达到软骨下骨，不能由BMSCs迁移进行修复，因此关节软骨损伤不易自行愈合^[13]。目前对其没有良好的治疗方法，而人口老龄化到来会加剧临床对软骨损伤的治疗压力。随着组织工程的迅速发展，再生修复软骨缺损被认为是最有潜力的治疗方法^[3]，其治疗原理是基于间充质干细胞具有向软骨细胞分化的潜力而修复损伤。BMSCs具有来源充足、取材容易、易于培养、能够自我更新增殖和多向分化的潜能，而被视为软骨组织工程最理想的种子细胞^[2-3]。该研究便以此为依据选用BMSCs作为研究对象。

大量研究显示，BMSCs既可在单层二维培养条件下，又可在三维支架培养下经生长因子诱导向软骨细胞分化，并修复动物模型的软骨缺损^[14-18]。在单层培养BMSCs向软骨细胞分化过程中，Glennon-Alty等^[8]发现BMSCs首先会成簇聚集形成单层聚合体，之后形成直径300-600 μm的多层聚合体，并且Ⅱ型胶原染色在聚合体内部最强。该研究中作者也见到BMSCs从第7天开始在局部形成成簇的单层聚合体，而到第14天时便形成直径更大的多层聚合体。免疫荧光染色和甲苯胺蓝亦可见聚合体区域的细胞外基质成分Ⅱ型胶原和蛋白多糖染色较强，而聚合体外的单个细胞染色较弱或无特异染色。SOX9是软骨发育形成中的重要转录因子，对软骨的发育成熟等过程发挥重要的调节作用，并且成软骨分化过程与Ⅱ型胶原的表达呈正相关性^[19-21]。研究结果显示，聚合体内的细胞有与DAPI蓝色细胞核相重叠的特异染色，而聚合体外的单个细胞无此染色，提示BMSCs的成软骨分化需要细胞与细胞以及细胞与聚合体内的基质接触^[22-25]。此外，qRT-PCR结果也进一步证实了诱导形成聚合体时期的细胞有Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9的基因表达。然而，刘霞等^[26]将软骨细胞与BMSCs直接接触共培养诱导其向软骨细胞分化，发现细胞间直接接触不能够单独诱导BMSCs向软骨分化，认为其不是软骨细胞与BMSCs混合共培养中发挥诱导作用的主要因素。更有研究显示在形成聚合体之前，BMSCs成软骨分化的特异基因已经开始表达，由此他们认为BMSCs的成软骨分化早于聚合体的形成^[8]。部分研究采用非接触共培养诱导分化，也发现软骨细胞可以诱导BMSCs或骨膜细胞向软骨细胞分化^[27-28]。Xu等^[29]观察到MSCs与软骨细胞非接触虽然可使干细胞的形态向软骨细胞改变，但是会抑制干细胞在三维培养中形成聚合体，同时也会减少软骨细胞外基质的沉积。

基于上述结果，作者认为BMSCs向软骨细胞分化过程中聚合体的形成可反映细胞成软骨分化，从而有助于对BMSCs成软骨诱导成熟的时间判断^[30]。但是实验未对聚合体形成之前的细胞进行成软骨分化鉴定，因此还无法确定成软骨分化开始的确切时间，对该问题还有待进一步研究。

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