脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植干预大鼠慢性难愈合性创面血管内皮生长因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0660

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5274-5280.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0660

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脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植干预大鼠慢性难愈合性创面血管内皮生长因子的表达

庄兢，杨宇，丁力，郑清健

福建省立医院，福建省福州市 350001

修回日期:2018-07-02 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 杨宇，博士，副主任医师，福建省立医院，福建省福州市 350001
作者简介:庄兢，女，1984年生，江苏省沭阳市人，汉族，2011年福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事整形外科，创面修复重建方面的研究。
基金资助:
福建省自然科学基金(2017J0105)

Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen bioengineering scaffold upregulates vascular endothelial growth factor expression in rats with chronic refractory wound

Zhuang Jing, Yang Yu, Ding Li, Zheng Qing-jian

Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

Revised:2018-07-02 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Yang Yu, MD, Associate chief physician, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
About author:Zhuang Jing, Master, Attending physician, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2017J0105

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
慢性难愈性创面：一般是指由于各种因素导致的临床治疗4-6周以上仍难于愈合和不愈合的创面，创面转化为慢性的迁延性存在。慢性难愈合性创面多由糖尿病、静脉曲张、动脉炎、动脉硬化、神经系统疾病及肿瘤引起，临床发病率较高。
自体脂肪干细胞移植：为了解决自体脂肪移植存活率低的问题，整形界发现了一种新的方法，就是将抽取出来的脂肪一部分做分离干细胞用，是用胶原酶进行消化，再净化后得到，然后与其它脂肪进行混合，在填充脂肪时加入经处理的脂肪干细胞，提高了脂肪组织里的干细胞的浓度，移植到自己需要进行填充的部位。这样加入了干细胞的自体脂肪细胞存活率可以达到70%左右，一处部位只需经过2次左右的移植就可以达到一劳永逸的理想效果。

摘要
背景：生物工程支架是临床治疗慢性难愈合性创面的常用方法，具有一定的疗效，但也存在一些问题。脂肪来源干细胞作为新兴的治疗慢性难愈合性创面的方法具有其独特的疗效和优势。但是，脂肪来源干细胞和生物工程支架联合应用治疗慢性难愈合性创面的疗效和机制尚不清楚。
目的：研究脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植对慢性难愈性创面血管内皮生长因子表达的影响。
方法：实验共选取31只SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。取1只大鼠腹股沟处脂肪，分离培养原代脂肪来源干细胞。将另外30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、支架组、脂肪来源干细胞组和联合组。对照组制备全层皮肤缺损创面(在大鼠腰椎正中偏上部两侧分别制备1处全层皮肤缺损伤口)，术后每日常规换药；其余各组制备2处慢性难愈合性创面(同对照组制备全层皮肤缺损伤口，创面局部注射醋酸氢化可的松)；模型组术后每日给予常规换药；支架组术后给予生物蛋白工程支架覆盖创面；脂肪来源干细胞组给予自体自体脂肪干细胞移植；联合组在脂肪来源干细胞移植后给予生物工程支架覆盖创面。干预7 d后取材，观察创面情况，测量创面面积大小；采用免疫组化法检测血管内皮生长因子表达，采用Western blot检测血管内皮生长因子蛋白表达量，采用qPCR检测血管内皮生长因子mRNA表达情况。
结果与结论：①对照组创面面积显著小于其他组创面面积(P < 0.05)；联合组创面面积显著小于模型组、支架组和脂肪来源干细胞组(P < 0.05)；②对照组血管内皮生长因子表达水平最高，血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平均显著高于其他组(P < 0.05)；联合组血管内皮生长因子表达较高，血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平显著多于模型组、支架组和脂肪来源干细胞组(P < 0.05)；③结果提示，脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植上调难愈合性创面血管内皮生长因子表达，促进创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9481-3093(庄兢)

关键词: 脂肪干细胞, 生物工程支架, 细胞移植, 难愈合性创面, 血管内皮生长因子, 创面愈合, 免疫组化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bioengineering scaffolds are commonly used in the treatment of chronic refractory wounds and have achieved some effects, but there are also some problems. Adipose-derived stem cells (ADSCs) as a new method for the treatment of chronic refractory wounds have its unique efficacy and advantages. However, the efficacy and mechanism of ADSCs combined with bioengineering scaffolds in the treatment of chronic refractory wounds are not yet clear.
OBJECTIVE: To study the effect of ADSCs combined with autologous collagen biomaterial scaffold transplantation on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) during the healing of chronic refractory wounds.
METHODS: Thirty-one Sprague-Dawley rats were purchased from Shanghai Slack Laboratory Animals Co., Ltd. Adipose tissues from the groin of a rat were harvested, and the primary ADSCs were isolated and cultured in vitro. The remaining 30 rats were randomly divided into normal control group, model group, collagen biomaterial scaffold group (Plenac group), autologous ADSCs transplantation group (ADSCs group) and autologous ADSCs + collagen biomaterial scaffold group (ADSCs+Plenac group), 6 rats in each group. In the normal control group, full-thickness skin wounds in the central and upper part of the bilateral lumbar vertebrae were made, followed by daily routine dressing. In the other groups two chronic refractory wounds were made in the central and upper part of the bilateral lumbar vertebrae followed by local injection of hydrocortisone acetate. Model group were given daily routine treatment; Plenac group treated with fibrin scaffold to cover the wound, followed by daily routine dressing; ADSCs group treated with autologous ADSCs transplantation followed by daily routine dressing; ADSCs+Plenac group received autologous ADSCs transplantation and bioengineering scaffold implantation to cover the wound, followed by daily routine dressing. After 7 days of intervention, all the rats were executed. The following procedures were subsequently carried out: observing wound situation, measuring wound size, detecting the expression of VEGF by immunohistochemical method, detecting the expression of VEGF protein using western blot assay, and detecting the expression of VEGF mRNA by qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The wound area in the control group was smaller than that in the other groups (P < 0.05), while the wound area in the ADSCs+Plenac group was also smaller than that in the model, Plenac and ADSCs groups (P < 0.05). (2) The expression of VEGF at protein and mRNA levels was higher in the control group compared with the other groups (P < 0.05), while the protein and mRNA expression of VEGF in the ADSCs+Plenac group was significantly higher than that in the model, Plenac and ADSCs group (P < 0.05). To conclude, ADSCs combined with the collagen bioengineering scaffold can upregulate VEGF expression in wound healing, and promote healing of wound healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cell Transplantation, Vascular Endothelial Growth Factors, Wound Healing, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

庄兢，杨宇，丁力，郑清健. 脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植干预大鼠慢性难愈合性创面血管内皮生长因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5274-5280.

Zhuang Jing, Yang Yu, Ding Li, Zheng Qing-jian. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen bioengineering scaffold upregulates vascular endothelial growth factor expression in rats with chronic refractory wound[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5274-5280.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验共使用30只SD大鼠进行研究，至取材时，所有大鼠均生存良好，无死亡。

2.2 ADSCs原代培养 培养24 h，可见80%原代培养的ADSCs贴壁生长，呈椭圆形或短小梭形；培养48 h，细胞基本贴壁，随培养时间延长，细胞数量增多，可见细胞呈长梭形或多角形，增殖旺盛，集落增大，呈旋涡状或鱼群状排列，呈簇分布；传代后，细胞呈长梭形或多角形，呈旋涡状排列，形态大小一致，生长良好，见图2。

2.3 ADSCs鉴定 研究采用免疫组化法检测ADSCs细胞表面抗原CD29、CD44和CD45鉴定ADSCs^[10-11]。结果如图3所示，ADSCs抗CD29和抗CD44染色呈阳性，细胞浆着色显棕褐色；ADSCs抗CD45染色呈阴性，细胞浆无明显棕褐色着色。

2.4 ADSCs联合胶原蛋白生物工程支架移植对创面愈合的影响 如图4，5所示，干预7 d后，对照组创面面积显著小于其他组(P < 0.05)；模型组创面面积显著大于胶原蛋白生物工程支架组、ADSCs组和联合组(P < 0.05)；联合组创面面积显著小于胶原蛋白生物工程支架组和ADSCs组(P < 0.05)。各组创面愈合率如表2所示，对照组创面愈合率显著优于其他各组(P < 0.05)；模型组创面愈合率显著低于支架组、ADSCs组和联合组(P < 0.05)；联合组创面愈合率显著优于支架组和ADSCs组(P < 0.05)。提示ADSCs移植、胶原蛋白工程支架覆盖以及ADSCs联合胶原蛋白工程支架移植均可有效促进难愈合性创面愈合，ADSCs联合胶原蛋白工程支架移植的治疗效果优于单纯ADSCs移植和胶原蛋白工程支架覆盖。

2.5 ADSCs联合胶原蛋白生物工程支架移植对血管内皮生长因子表达的影响 干预7 d后，对照组血管内皮生长因子表达最多，血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平均高于其他组(P < 0.05)；模型组表达较少，血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平显著少于支架组、ADSCs组和联合组(P < 0.05)；联合组血管内皮生长因子表达较多，血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平显著多于支架组和ADSCs组。提示创面愈合过程中血管内皮生长因子高表达，但慢性难愈合性创面中血管内皮生长因子表达水平增高较低，ADSCs移植、胶原蛋白工程支架覆盖以及ADSCs联合胶原蛋白工程支架移植均可有效促进慢性难愈合性创面中血管内皮生长因子表达水平，ADSCs联合胶原蛋白工程支架移植促进血管内皮生长因子表达的能力优于单纯ADSCs移植和胶原蛋白工程支架覆盖。见图6-10。

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引言

慢性难愈性创面一般是指由于各种因素导致的创面未能按期愈合，创面转化为慢性的迁延性存在^[1]。慢性难愈合性创面多由糖尿病、静脉曲张、动脉炎、动脉硬化、神经系统疾病及肿瘤引起，特别是由糖尿病引起的慢性难愈合性创面，临床发病率较高。慢性难愈性创面的形成机制较为复杂，常发生在细胞毒性药物使用、糖尿病、大面积的深度烧伤、激素的全身使用之后，对其处理一直是整形外科创伤修复临床研究的热点和难点。在慢性难愈性创面的闭合过程中，需要多种细胞及组织的参与，特别是细胞增殖与分化和创面重塑。脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是体内参与创面愈合修复的重要细胞之一。ADSCs具有多向的分化能力，在不同的诱导条件下可表现成骨、成软骨和成脂细胞的能力；另外，ADSCs具有内分泌的功能，能够分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子等，这些都有利于创面愈合^[2-4]。血管内皮生长因子是生长因子家族中最强的促血管内皮细胞有丝分裂原，其生物学效应主要特异性地促进血管内皮细胞的分裂、增殖以及增加微血管的通透性，进而诱导新生血管的形成。血管内皮生长因子作为血管生成的一个重要调节因素，在创面愈合研究中起着重要的作用。血管内皮生长因子在正常组织的表达较微弱，但在创面愈合中表达增强；在慢性创面愈合过程中，血管内皮生长因子表达上调的幅度明显小于正常创面。

随着现代移植技术的成熟，ADSCs移植治疗慢性难愈合性创面成为组织修复领域中的研究热点^[5]。近些年来，应用脂肪来源干细胞进行临床疾病治疗的方法正逐渐受到重视，脂肪组织的移植不仅能提供组织缺损修复所需要的容积，提供必要的组织厚度，增强局部的耐磨性，降低破损的复发率，它还能提供各种内分泌因子加速修复，如皮下注射ADSCs可促进成纤维细胞的生长，从而达到面部年轻化的效果，而利用ADSCs自分泌及旁分泌的多种生长因子，能够达到修复组织的目的，如心肌和肾损伤的修复。近年来，对各种难愈性创面进行ADSCs的移植，促进其局部多种生长因子水平的提升，提高难愈性创面的愈合能力，不论采用后期进行的植皮、皮瓣等等操作，均能大幅改善局部的愈合能力和修复效果。但是，移植后ADSCs存活率较低是限制其推广应用的主要因素。胶原蛋白生物工程支架，是近年来整形外科临床工作中常用的一种新型高科技生物材料，有利于诱导受区的成纤维细胞和血管等组织的长入，为细胞黏附、增殖、分化及组织再生的良好环境^[6]。因此，当前研究将ADSCs与胶原蛋白生物工程支架联合应用，研究其对血管内皮生长因子表达的影响，明确该方法治疗慢性难愈合性创面的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年3月至9月在福建中医药大学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组 31只2月龄SD大鼠，雌雄各半，体质量(220±20) g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号：SCXK(沪)2014-0003。1只用于提取ADSCs，另外30只采用随机数表法分为对照组、模型组、支架组、ADSCs组及联合组，每组6只。

1.3.2 实验试剂及仪器

1.4 方法

1.4.1 ADSCs分离、获取与体外培养 1只大鼠腹腔注射体积分数7%水合氯醛，注射剂量为5 mL/kg；麻醉成功后，将大鼠腹股沟区域脱毛、备皮并消毒；切开皮肤，取出双侧腹股沟处皮下脂肪组织，放入0.9%氯化钠溶液中洗涤，去除血管、筋膜及其他组织；将脂肪组织剪碎成大小约1 mm³的组织块，加入0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶37 ℃消化60 min，待组织块成糊状时加入PBS终止消化，吹打后用直径100 μm的筛网过滤，去除未消化的组织，2 500 r/min离心10 min，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基重悬细胞，以细胞浓度3×10⁸ L^-1接种于培养皿中，放入37 ℃含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，每3 d半换液1次。观察并记录细胞生长情况，当细胞贴壁融合达80%时进行传代。

1.4.2 ADSCs鉴定 制作细胞爬片后，去除培养基，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗，加入体积分数0.5%Triton X-100室温孵育20 min，PBS漂洗，加入过氧化氢溶液室温反应15 min，PBS漂洗，加入血清封闭液37 ℃孵育20 min，甩掉封闭液不洗，分别加入兔anti-CD29一抗(1∶200)、兔anti-CD44一抗(1∶200)、兔anti-CD45一抗(1∶200)4 ℃过夜；次日，PBS漂洗，加入试剂盒中生物素标记的山羊来源二抗37 ℃孵育20 min，PBS漂洗后加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育20 min，DAB显色，苏木精复染细胞核，中性树胶封固，显微镜下观察并拍片。

1.4.3 难愈合性创面模型制备^[7-9]大鼠正常饲养7 d后进行造模，先制备大鼠全层皮肤缺损伤口，再制备难愈合性创面模型，具体方法为：给予大鼠腹腔注射体积分数7%水合氯醛，注射剂量为5 mL/kg；麻醉成功后定位腰椎正中偏上部，局部备皮、消毒；使用直径10 mm的圆形皮肤打孔器全层皮肤去除，在大鼠腰椎正中偏上部两侧分别制备1处全层皮肤缺损伤口，暴露皮下组织；创面局部注射醋酸氢化可的松，注射剂量为80 mg/kg，连续注射3 d，制成慢性难愈合创面模型(图1)。

1.4.4 各组大鼠处理方法 对照组大鼠只行全层皮肤去除，制备全层皮肤缺损伤口，不注射醋酸氢化可的松，术后伤口无菌敷料包扎，常规换药，1次/d；模型组制备慢性难愈合性创面模型后，伤口无菌敷料包扎，常规换药，1次/d；支架组制备慢性难愈合性创面模型后伤口给予胶原蛋白生物工程支架覆盖，伤口无菌敷料包扎，常规换药，1次/d；ADSCs组制备慢性难愈合性创面模型后，伤口给予ADSCs移植，注射量3×10⁵个，伤口无菌敷料包扎，常规换药，1次/d；联合组制备慢性难愈合性创面模型后，伤口给予ADSCs移植，注射量3×10⁵个，胶原蛋白生物工程支架覆盖，伤口无菌敷料包扎，常规换药，1次/d。细胞移植方法均为伤口直接注射，干预7 d后取材。

1.4.5 取材 麻醉成功后，测量每只大鼠2处创面面积。对各组的创面愈合率进行计算，创面愈合率=(造模时创面面积－取材时创面面积/造模时创面面积)×100%。脱颈处死大鼠后取创面处的皮肤组织，一侧创面的皮肤组织放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，制作石蜡组织切片，用于免疫组化检测；另一侧创面皮肤组织放置于EP管中，-20 ℃保存，用于Western blot检测和荧光定量PCR检测。

1.4.6 免疫组化法检测血管内皮生长因子表达情况 将5 μm厚的石蜡组织切片常规脱蜡、入水，加入枸橼酸缓冲液在微波炉内加热进行抗原修复，PBS漂洗后加入内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min，PBS漂洗后加入山羊血清封闭20 min，将血清封闭液甩掉后加入兔抗血管内皮生长因子一抗(1∶200)4 ℃过夜；PBS漂洗后加入山羊来源二抗孵育10 min，PBS漂洗后加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育10 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，显微镜下观察并拍片。

1.4.7 Western blot检测血管内皮生长因子蛋白的表达 将-20 ℃保存备用的皮肤组织加入裂解液，冰浴60 min。14 000xg离心10 min，BCA法定量蛋白。在酶标仪中测得标准曲线和吸光度，通过其算出蛋白浓度。蛋白变性后，将样品于相应浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离，待Marker蛋白跑至玻璃板底部且样本蛋白基本呈一条直线沉于底部，则停止跑胶。转至PVDF膜封闭，TPBS洗3次。封闭液封闭1.5 h，先后加入兔抗血管内皮生长因子一抗(1∶1 000)和山羊来源二抗(1∶1 000)，每次步骤间隔均用TBST漂洗。用TBST清洗去除二抗后开始显影。将膜置于化学发光试剂中反应1 min，在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统进行分析。

1.4.8 qPCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达 采用RNA提取试剂盒提取-20 ℃保存备用组织中的总RNA，应用反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA，反应体系为20 μL。反应条件为：51 ℃反应2 min，96 ℃预变性10 min，96 ℃变性10 s，退火60 ℃反应30 s，40个循环。先算出^?Ct值(^?Ct为目的基因相对于内参基因的表达强度)，即^?Ct=目的基因的Ct值-内参基因的Ct值；再将目的基因的表达差异计算出来，即处理样本相对于未处理样本的倍数(2^-??Ct)，^-^??Ct=-(^?Ct处理样本-^?Ct未处理样本)。引物序列详见表1。

1.5 主要观察指标 ①各组创面愈合率；②免疫组化染色观察血管内皮生长因子表达情况；③血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料以x(_)±s表示，符合正态分布且方差齐用t 检验，符合正态分布但方差不齐用校正t 检验，不满足正态分布和方差齐性检验采用非参数检验，等级资料采用秩和检验，计数资料采用χ²检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

一般将经过正规治疗不能通过有序及时的组织修复，使创面恢复解剖完整和功能完整的创面称为难愈合性创面^[12]。难愈合性创面形成的机制非常复杂，包括组织缺血缺氧、生长因子缺乏、细胞凋亡、氧化应激等一系列级联反应。因此，难愈合性创面愈合的难点在于众多病因包括创面组织缺血缺氧、生长因子缺乏、感染及坏死物质残留、糖尿病和细胞衰老、营养不良等，影响创面愈合过程中的炎症期、增殖期和重塑期，使正常的创面愈合过程被阻断，导致难愈合性创面形成^[13-15]。血管内皮生长因子作为生长因子家族中的重要成员之一，在创面愈合过程中扮演重要角色。研究证实，血管内皮生长因子在正常组织中表达量较低，当组织损伤后，创面组织中的血管内皮生长因子表达量随即升高，并伴随创面愈合的整个过程；同时，创面愈合过程中，高表达的血管内皮生长因子还可促进创面中肉芽组织形成，加速创面愈合^[16]。进一步研究发现，血管内皮生长因子作为一种血管内皮细胞的特异性作用因子，与血管内皮细胞表面的特异性受体结合后，可激活血管内皮细胞的增殖能力，促进其分裂增殖，诱导新生血管生成，增加损伤处微血管数量，改善血管通透性，从而有利于创面修复及愈合^[17]。血管内皮生长因子促进血管内皮细胞生长，有利于创面愈合的深入机制与血管内皮生长因子激活下游多条信号通路有关。创面愈合过程中，血管内皮生长因子作为细胞生长因子可激活下游PI3K/AKT/HIF-1信号通路、Ras/MAPK/ERK信号通路等，促进内皮细胞增殖，加速血管生成，从而有利于组织修复和创面愈合^[18]。当前研究发现，血管内皮生长因子在正常创面愈合过程中表达量增高，以发挥促进创面愈合的作用；而在难愈合性创面中，血管内皮生长因子表达量较低，这可能是创面不愈合的重要原因之一，也进一步验证了血管内皮生长因子在创面愈合中的表达和作用以及血管内皮生长因子缺乏是难愈合性创面发生的可能病因之一。

随着细胞移植技术的发生和成熟，临床应用细胞移植治疗被认为是治疗难愈合性创面的有效方法之一。移植细胞的选择是细胞移植技术的关键，必须具备一定条件，包括来源可靠、获得容易、体外培养容易并可体外迅速扩增繁殖^[19]。ADSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞，在一定条件的刺激下可能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞，并能分泌包括血管内皮生长因子在内的多种细胞生长因子^[20-21]。体外培养的原代ADSCs鉴定主要通过细胞形态、细胞表面抗原特性等方面。在当前研究中，体外培养的原代ADSCs细胞主要以长梭形为主，细胞排列呈旋涡状，这与ADSCs的细胞形态特点一致。目前，对ADSCs表面抗原特性尚无统一认识和规定^[22]。但是，大部分学者认为，ADSCs的阳性细胞表面抗原为CD29、CD44、CD90，而不表达CD31、CD34、CD45等细胞表面抗原^[23]。当前研究体外培养的原代ADSCs经免疫组化检测，显示抗CD29和CD44细胞表面抗原阳性，抗CD45细胞表面抗原阴性，说明研究采用大鼠腹股沟处脂肪体外培养的原代细胞即为原代ADSCs，该方法确实可行且细胞纯度高。大量研究证实，ADSCs在创面愈合过程中具减轻创面炎症、促进肉芽组织新生和沉淀、促进创面再上皮化、促进创面血管新生和重建、促进创面收缩有促进肉芽组织生成、上皮化以及血管新生后重建等重要作用，通过调控多种机制对创面愈合发挥促进作用^[24-27]。目前应用较多的是ADSCs。ADSCs具有许多优点：来源广泛，取材容易，创伤较小；免疫排斥反应发生率低；具有较强的增殖能力，体外培养可迅速扩增繁殖；不存在伦理问题。因此，ADSCs是理想的种子细胞，ADSCs移植在创面愈合研究领域具有良好的发展前景和广泛的临床应用前景，是目前医学研究的热点之一^[28-29]。但是，单纯ADSCs移植治疗难愈合性创面的疗效并不理想。当前研究亦发现，单纯ADSCs虽然可以在一定程度上增加创面血管内皮生长因子表达，缩小创面面积，但其疗效并未明显优于胶原蛋白生物工程支架覆盖，未显示出细胞移植治疗的优势。究其原因与难愈合性创面微环境不适合移植的ADSCs生存、增殖和分化，限制其促进创面愈合的作用有关，导致ADSCs移植治疗难愈合性创面的疗效受到影响。因此，联合治疗的方法进入研究者的视野。研究人员将ADSCs与多种生物支架包括Ⅰ型胶原蛋白支架、纤维蛋白胶原支架、透明质酸支架、丝素壳聚糖支架、人脱细胞羊膜支架、人脱细胞真皮支架等联合移植治疗难愈合性创面。研究发现，与单纯ADSCs移植或单纯生物支架治疗相比，ADSCs联合生物支架移植可更有效地促进成纤维细胞增殖、生长，促进血管新生，促进胶原纤维生成、排列，加速创面愈合^[30-33]。因此，研究将ADCSs联合胶原蛋白生物工程支架进行移植。胶原蛋白生物工程支架是从猪肌腱中提取到胶原蛋白，借助生物工程技术，去除双侧末端的肽链后得到的无末端胶原蛋白，根据需要再将其有选择地有机附着在硅胶膜之上。其先进性在于借助内部网状支架结构，有利于细胞长入和代谢，诱导创面血管长入和重建，改善创面微环境^[34]。当前研究结果发现，ADSCs联合胶原蛋白生物工程支架移植，产生协同作用，显著促进创面血管内皮生长因子表达，缩小创面面积，有利于创面愈合。

综上，ADSCs联合胶原蛋白生物工程支架移植上调慢性难愈合性创面血管内皮生长因子表达，促进难愈合性创面的愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植干预大鼠慢性难愈合性创面血管内皮生长因子的表达

Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen bioengineering scaffold upregulates vascular endothelial growth factor expression in rats with chronic refractory wound

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