炎症诱导缺血缺氧环境下骨髓间充质干细胞的活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0659

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5259-5267.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0659

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炎症诱导缺血缺氧环境下骨髓间充质干细胞的活性

张妮¹，陈兰英¹，李雪亮¹，官紫祎¹，方聪¹，周朦静¹，罗颖颖¹，刘荣华²

¹江西中医药大学国家工程研究中心，江西省南昌市 330006；²江西中医药大学药学院，江西省南昌市 330004

修回日期:2018-06-29 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 陈兰英，博士，博士生导师，教授，江西中医药大学国家工程研究中心，江西省南昌市 330006
作者简介:张妮，女，1986年生，江西省武宁县人，汉族，2013年江西中医药大学毕业，在读博士，讲师，主要从事干细胞与心血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660676，81360629)；江西省自然科学基金(20171BAB205096)

Viability of bone marrow mesenchymal stem cells in inflammation-induced ischemia-reperfusion environment

Zhang Ni¹, Chen Lan-ying¹, Li Xue-liang¹, Guan Zi-yi¹, Fang Cong¹, Zhou Meng-jing¹, Luo Ying-ying¹, Liu Rong-hua²

¹National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation of Chinese Herbal Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; ²School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China

Revised:2018-06-29 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Chen Lan-ying, MD, Doctoral supervisor, Professor, National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation of Chinese Herbal Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Zhang Ni, Doctorate candidate, Lecturer, National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation of Chinese Herbal Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660676; 81360629; the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20171BAB205096

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
氧糖剥夺：是指在细胞水平上体外模拟缺血缺氧对细胞造成的刺激模型，通过对细胞正常培养条件的改变，包括将细胞放入无氧或低氧装置中，并更换无糖无血清培养基，经过一定时间的氧糖剥夺处理模拟细胞在缺血缺氧情况下造成的损伤。
骨髓间充质干细胞活性：在骨髓间充质干细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，这些死细胞占总细胞的比例可以用来评价骨髓间充质干细胞活性，通常用总细胞中活细胞所占的百分比来表示，骨髓间充质干细胞中活细胞所占的百分比越高，表示细胞活性越强。

摘要
背景：局部组织缺血缺氧和炎症微环境因素是造成骨髓间充质干细胞生存率低的主要原因。
目的：探讨炎症环境下缺血缺氧对骨髓间充质干细胞活性的影响以及细胞活性与炎症因子之间的关系。
方法：采用全骨髓培养法提取培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪对细胞进行鉴定，将第3代细胞进行不同时间氧糖剥夺(6，12，24 h)和炎症诱导(氧糖剥夺、氧糖剥夺+20 μg/L肿瘤坏死因子α、氧糖剥夺+100 μg/L脂多糖)，倒置显微镜观察细胞生长状况，MTT法和流式细胞仪测定细胞活力，ELISA检测上清液中白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平，RT-PCR检测细胞中白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、NF-κB基因表达水平。
结果与结论：①成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞且纯度为95%以上；②氧糖剥夺6 h和12 h细胞活力明显增强，氧糖剥夺24 h细胞活力明显下降；在肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导下氧糖剥夺6，12，24 h后细胞活力下降；③与正常条件比较，氧糖剥夺6，12 h后白细胞介素6、白细胞介素10水平和白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、NF-κB基因表达下降；④与氧糖剥夺条件比较，在肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导下氧糖剥夺6，12 h后白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平和白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、NF-κB基因表达显著升高；⑤由此可见，在肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导下，骨髓间充质干细胞活力受炎症因子表达和分泌影响，随着炎症因子表达和分泌增加，骨髓间充质干细胞的活力降低。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5860-6492(张妮)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 缺血缺氧, 炎症环境, 肿瘤坏死因子α, 脂多糖, 细胞活性, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Local tissue ischemia-hypoxia and inflammatory microenvironment mainly contribute to the low survival rate of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To study the effect of ischemia-hypoxia on viability of bone marrow mesenchymal stem cells in inflammatory environment and to explore the relationship between cell viability and inflammatory factors.
METHODS: The whole bone marrow culture method was used to separate and culture bone marrow mesenchymal stem cells and flow cytometry was used for cell identification. The third passage cells were treated by oxygen-glucose deprivation (OGD) preconditioning for different periods (6, 12 and 24 hours) as well as inflammatory induction (OGD, OGD+20 μg/L tumor necrosis factor alpha (TNF-α), OGD+100 μg/L lipopolysaccharide (LPS)). The treated cells were observed under inverted microscope. Cell viability was tested by MTT assay and flow cytometry. The levels of interleukin-6, interleukin-10, and TNF-α in the cell supernatant were measured by ELISA and the mRNA expression levels of interleukin-6, interleukin-10, TNF-α and nuclear factor-κB in the cells were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells with a purity of 95% or more were successfully isolated and cultured. MTT and flow cytometry results showed that the cell viability was significantly increased after 6 and 12 hours of OGD, but was significantly decreased after 24 hours of OGD. The viability of bone marrow mesenchymal stem cells decreased after 6, 12, and 24 hours of OGD under the induction of TNF-α and lipopolysaccharide. The results of ELISA and RT-PCR showed that the levels of interleukin-6 and interleukin-10 in the cell supernatant were lowered after 6 and 12 hours of OGD and the gene expression of interleukin-6, interleukin-10, TNF-α, and nuclear factor-κB was lower compared with normal conditions. The levels of interleukin-6 and TNF-α in the cell supernatant increased significantly and the expression of interleukin-6, interleukin-10, TNF-α and nuclear factor-κB genes increased significantly after 6, 12 hours of OGD under TNF-α and LPS induction compared with simple OGD. Therefore, under the induction of TNF-α and lipopolysaccharide, the viability of bone marrow mesenchymal stem cells is affected by the expression and secretion of inflammatory factors. With the increase of the expression and secretion of inflammatory factors, the viability of bone marrow mesenchymal stem cells shows a decreasing trend.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Ischemia, Anoxia, Tumor Necrosis Factor-alpha, Lipopolysaccharides, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张妮，陈兰英，李雪亮，官紫祎，方聪，周朦静，罗颖颖，刘荣华. 炎症诱导缺血缺氧环境下骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5259-5267.

Zhang Ni, Chen Lan-ying, Li Xue-liang, Guan Zi-yi, Fang Cong, Zhou Meng-jing, Luo Ying-ying, Liu Rong-hua. Viability of bone marrow mesenchymal stem cells in inflammation-induced ischemia-reperfusion environment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5259-5267.

图/表（结果） 4

2.1 原代BM-MSCs的培养、传代及鉴定结果 接种24 h观察有大量悬浮细胞，见瓶底有少量细胞附着，细胞形态多为圆形，48 h观察细胞明显贴壁，贴壁细胞呈梭形，72 h观察有明显的集落形成，多为长梭形，5 d集落明显扩大，集落中间细胞密度增加，细胞开始呈螺旋或者放射性生长，约8 d细胞融合达到70%-80%，即可传代。传代细胞生长形态与原代相似，细胞生长状态良好，形态上多呈现长梭形或纺锤形，形态单一均匀，紧密贴于瓶底，呈现放射状或螺旋状生长(图1A，1B)。

流式细胞仪对大鼠BM-MSCs表面抗原标志CD29、CD90、CD34、CD45表达分析(图1C)，结果显示CD29阳性表达率为99.8%，CD90阳性表达率为99.5%，而CD34、CD45阴性表达，其表达率分别为0.2%，4.7%。

2.2 显微镜下观察各组细胞损伤情况 在6 h时，氧糖剥夺组、氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组BM-MSCs与正常组相比形态上无明显差异，贴壁良好，见图2A-D；在12 h时，与正常组相比，氧糖剥夺组、氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组BM-MSCs形态有皱缩趋势，且氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组细胞比氧糖剥夺组稀疏，细胞贴壁良好，见图2E-H；在24 h时，与正常组相比，氧糖剥夺组、氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组BM-MSCs明显皱缩变小，长梭形形态消失，细胞贴壁减弱，细胞数量明显减少，细胞损伤明显，见图2I-L。

2.3 各组BM-MSCs的生存率 MTT结果显示，与正常组比较，氧糖剥夺6 h和12 h后BM-MSCs存活率升高，分别为115.13%和106.97%，其中6 h差异有显著性意义(P=0.012)，氧糖剥夺24 h后BM-MSCs存活率降低，为85.95%，见图3。由结果可得，氧糖剥夺6，12 h使细胞活力增强，氧糖剥夺24 h对细胞造成损伤。

与正常组比较，氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α处理6，12，24 h后BM-MSCs存活率下降，分别为98.85%，89.70%和51.40%，氧糖剥夺+脂多糖处理6，12，24 h后BM-MSCs存活率下降，分别为97.92%，81.30%和40.27%，其中处理24 h细胞生存率与正常组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。相较于单纯进行氧糖剥夺处理，加入肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导，导致BM-MSCs活力降低。

2.4 各组BM-MSCs的凋亡情况 与正常组比较，氧糖剥夺6 h后死亡细胞显著性减少(P < 0.01，n=3)，氧糖剥夺24 h后死亡细胞增加，见图5。由结果可得，氧糖剥夺6 h使细胞活力增强，氧糖剥夺24 h细胞活力降低。

与正常组比较，氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α处理6，12，24 h死亡细胞明显增多，氧糖剥夺+脂多糖处理6，12，24 h死亡细胞也明显增多，其中处理24 h细胞死亡比例与正常组相比差异有显著性意义(P < 0.01，n=3)，随着处理时间延长，死亡细胞增多，见图6。由结果可得，加入肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导，导致BM-MSCs活力降低。

2.5 各组BM-MSCs的炎症因子表达 在6 h时，氧糖剥夺组白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α基因表达量显著低于正常组(P < 0.01，n=3)；在12 h时，炎症因子表达量与6 h时一致，均显著低于正常组表达水平(P < 0.01，n=3)，见图7。结果显示，氧糖剥夺处理6 h和12 h使BM-MSCs炎症因子表达降低。

氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组处理6 h和12 h时白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α基因表达量显著高于氧糖剥夺组(P < 0.01)，见图8。RT-PCR结果显示，加入肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导，使BM-MSCs炎症因子基因表达增加。

2.6 各组BM-MSCs的炎症因子分泌 在6 h时，氧糖剥夺组上清液中白细胞介素6、白细胞介素10分泌量显著低于正常组(P < 0.01，n=3)，肿瘤坏死因子α分泌量高于正常组(P=0.067，n=3)，其中白细胞介素6含量低于检测限；在12 h时，上清液中的炎症因子含量与6 h趋势一致，白细胞介素6含量仍低于检测限，见图9。结果显示，氧糖剥夺处理6 h和12 h减少BM-MSCs分泌白细胞介素6和白细胞介素10。

氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组、氧糖剥夺+脂多糖组处理6 h和12 h上清液中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α分泌量显著高于氧糖剥夺组，白细胞介素10分泌量差异无显著性意义，见图10。结果显示，加入肿瘤坏死因子α、脂多糖使BM-MSCs炎症因子分泌增加。

2.7 各组BM-MSCs中NF-κB的表达 氧糖剥夺组NF-κB表达均显著低于正常组；氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组NF-κB表达均显著高于正常组和氧糖剥夺组；氧糖剥夺+脂多糖组NF-κB表达均显著高于正常组和氧糖剥夺组。由结果得到加入肿瘤坏死因子α、脂多糖激活BM-MSCs中NF-κB表达，各组NF-κB表达水平高低顺序为：氧糖剥夺+脂多糖组>氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α组>正常组>氧糖剥夺组，见图11。

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引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是存在于骨髓中的基质干细胞，具有取材容易、对机体损伤小、易于操作、多向分化潜能等优点，被认为是组织工程的理想种子细胞^[1]。BM-MSCs移植在临床治疗方面具有广阔的应用前景，大量动物实验已证明BM-MSCs在治疗心脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、呼吸系统疾病和肾脏疾病等方面具有显著效果，治疗的主要途径是局部植入和全身移植^[2-5]。然而，移植后BM-MSCs大量死亡是影响移植治疗效果的最大障碍，目前认为移植环境中局部组织缺血缺氧、局部免疫和炎症反应及缺乏营养因子等微环境因素是造成BM-MSCs生存率低的主要原因^[6-8]，然而不同条件和不同程度的微环境对生存率的影响是变化的，其对BM-MSCs生存的影响值得进一步研究。

近年来，BM-MSCs移植治疗机制研究有较大转变，研究认为移植细胞产生治疗效应主要是靠环境依赖性旁分泌的调节作用，而非完全分化为组织细胞起治疗作用^[9-10]。BM-MSCs在不同微环境中会引起分泌信号分子改变，这些信号分子反映损伤情况并进一步协助组织损伤修复，其中炎症因子为主要信号分子之一^[11]。目前多数研究聚焦于微环境对BM-MSCs生存率、迁移、归巢和分化的影响，而不同缺血缺氧时间在炎症环境下对BM-MSCs活性的影响研究甚少。因此，该实验采用MTT方法、流式细胞仪、RT-PCR和ELISA技术，观察不同缺血缺氧时间对BM-MSCs活性的影响，以及活性与炎症因子之间的关系，为进一步BM-MSCs移植治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2017年8月至2018年1月在江西中医药大学国家工程研究中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠10只，体质量120-150 g，4-6周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物使用许可证号：SCXK(湘)2016-0002。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 实验试剂及仪器 胎牛血清(Gibco)；DMEM/F12 (1∶1)(HyClone)；无糖无血清DMEM(Gibco)；胰蛋白酶(Solarbio)；大鼠白细胞介素6 ELISA 试剂盒(Abclonal RK00020)；大鼠白细胞介素10 ELISA 试剂盒(Abclonal RK00050)；大鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(Abclonal RK00029)；PE-CD29抗体(Biolegend)；FITC-CD45抗体(Biolegend)；FITC-CD34抗体(Abcam)；PE-CD90抗体(Biolegend)；生物安全柜(Thermo Fisher1300)；CO₂培养箱(SANYO)；Spectra Max i3酶标仪(Molecular Devices)；超纯水仪(Milli-Q)；PCR仪(Eppendorf mastercycler)；荧光定量PCR仪(ABI 7500)；荧光显微镜(Leica DMI3008)；倒置显微镜(OLYMPUS CKX41)；紫外分光光度计(Eppendorf BioSpectrometer)；冷冻离心机(Eppendorf 5810R)；缺氧培养小室(Billups-Rothenbery)；流式细胞仪(Beckman，Gallios)；肿瘤坏死因子α(Sino Biological 80045-RNAE)；脂多糖(Sigma L2630)。

1.4 实验方法

1.4.1 BM-MSCs提取和培养 SPF级健康4-6周龄雄性SD大鼠脱臼处死，于体积分数为75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，在预冷的DMEM/F12培养液中除去骨周围肌肉组织，置于含血清培养液中，剪去两侧骺端，暴露髓腔，用5 mL注射器适量吸取5 mL含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液缓慢反复冲洗骨髓腔，至髓腔变白，反复吹打细胞悬液，使细胞均匀悬浮，吸取3 mL悬液于T25培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，标记为原代。稳定培养48 h后，首次半量换液移去部分未贴壁细胞，之后每2 d或3 d全量换液，待细胞生长融合至70%-80%，加入2 mL预热的0.125%胰酶(含EDTA)消化1 min，终止消化，轻柔吹打壁上细胞，移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞，按1∶2比例传代培养，标记为第1代。传代后，每2 d或3 d换液1次，待细胞融合至80%-90%，重复上述消化步骤，根据传代次数分别标记为第2代、第3代，取第3代细胞进行鉴定和后续实验研究。

1.4.2 流式细胞仪鉴定BM-MSCs表面标志 取第3代BM-MSCs，待细胞融合至80%-90%，用0.125%胰酶消化，PBS重悬细胞，采用血球计数法对细胞进行计数，将1×10⁶个细胞移至检测管中，2 000 r/min离心5 min，加入100 μL PBS，重悬细胞，每管中加入相应的抗体(PE-CD29、PE-CD90、FITC-CD45、FITC-CD34单克隆抗体)，冰中避光孵育15-30 min，抗体孵育完成后，用PBS洗掉多余的抗体，最后用0.5 mL PBS重悬细胞，进行流式细胞仪检测表面标记物CD29、CD90、CD45、CD34的表达。

1.4.3 实验分组和细胞处理 取第3代BM-MSCS，消化，重悬，计数，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释成细胞浓度为0.5×10⁸ L^-1的混悬液，取2 mL接种于35 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养48 h，分为4组：①正常组更换为新鲜含血清培养基，于体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养；②单纯氧糖剥夺组更换成无血清无糖DMEM培养基，置于缺氧小室中缺氧培养(氧含量< 0.5%)；③肿瘤坏死因子α(20 μg/L)+氧糖剥夺组更换为含20 μg/L肿瘤坏死因子α的无糖无血清DMEM培养基，置于缺氧小室中缺氧培养；④脂多糖(100 μg/L)+氧糖剥夺组更换为含100 μg/L脂多糖的无糖无血清DMEM培养基，置于缺氧小室中缺氧培养。

1.4.4 MTT法测定细胞生存率 取第3代BM-MSCs，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基稀释成细胞浓度为4×10⁷ L^-1的混悬液，取100 μL接种于96孔板，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养48 h后分组、造模、给药，细胞处理见1.4.3。各组细胞分别培养6，12，24 h后，弃孔内液体，加入180 μL无血清培养基以及20 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h后，弃孔内液体，加入二甲基亚砜150 μL，振荡溶解10 min，酶标仪于490 nm处测定吸光度值。

生存率%=(处理组吸光度值-调零组吸光度值)/(正常组吸光度值-调零组吸光度值)×100%。

1.4.5 Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡 取第3代BM-MSCs，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1的混悬液，接种量为1×10⁶个细胞。细胞种板于10 cm培养皿中，培养48 h后分组、造模、给药，细胞处理见1.4.3，各组分别培养6，12，24 h后收集孔内液体，离心，收集死细胞(死细胞漂浮在上清液中)，1 000 r/min离心5 min，收集沉淀。而贴壁细胞用PBS洗2遍，0.125%胰酶(不含EDTA)消化1 min，终止消化并离心，弃上清，合并死细胞并重悬细胞使得细胞数量为1×10⁶，按Annexin V试剂盒操作步骤分别加入相应试剂，避光孵育15 min，PBS冲洗，30 min内上流式细胞仪测定。

1.4.6 ELISA测定炎症因子分泌 取第3代BM-MSCS，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释成0.5×10⁸ L^-1的混悬液，取2 mL接种于35 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养48 h后分组、造模、给药，细胞处理见1.4.3。各组分别培养6，12，24 h后，收集细胞上清液，1 000×g离心10 min，-80 ℃保存，用于ELISA试剂盒测定白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子α水平，试剂盒操作如下步骤：①取出样品板孔，稳定安置于固定板中，每孔加入300 μL wash buffer，保持30 s，弃去wash buffer，清洗5遍；②每孔加入100 μL一定浓度梯度的标准品或样品，用粘合带封闭板孔，20-25 ℃室温微振孵育2 h，振荡频率为100 r/min；③弃孔板中液体，重复①步骤清洗5遍；④每孔加入100 μL Biotin-Conjugate antibody工作溶液，用粘合带封闭板孔，20-25 ℃室温微振孵育1 h，振荡频率为100 r/min；⑤弃孔板中液体，重复①步骤清洗5遍；⑥每孔加入100 μL Streptavidin-HRP工作溶液，用粘合带封闭板孔，20-25 ℃室温微振孵育30 min，振荡频率为100 r/min；⑦弃孔板中液体，重复①步骤清洗5遍；⑧每孔加入100 μL substrate Solution，20-25 ℃室温避光孵育20 min；⑨每孔加入100 μL stop Solution，混匀，5 min内于酶标仪测定450 nm处吸光度值。

1.4.7 RT-PCR检测相关基因表达 取第3代BM-MSCS，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液稀释成细胞浓度为0.5×10⁸ L^-1的混悬液，取2 mL种于35 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养48 h后分组、造模、给药，细胞处理见1.4.3。各组分别培养6，12，24 h后，收集BM-MSCs，采用Rrizol一步法提取总RNA，紫外检测RNA纯度和浓度，取约1 μg RNA为模板，按照cDNA SynthesisKit操作方法和步骤进行反转录反应，合成DNA用PowerUp SYBR Green Master Mix进行实时荧光定量检测，GADPH为内参，mRNA的相对表达采用Livak法计算。基因所需引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 各组BM-MSCs的形态、活力、炎症因子的表达和分泌、NF-κB的表达。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 20.0进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，进一步两两组间比较用独立样本t 检验，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

BM-MSCs因具有多能分化性、易培养扩增、无免疫排斥及伦理争议的优点用于移植治疗心脑血管、神经系统、肝脏、呼吸系统和肾脏等方面疾病^[12]。大量研究发现，BM-MSCs移植能够促进新生血管形成，减少瘢痕组织形成^[13-15]。然而，BM-MSCs在移植后3 d内死亡率超过70%-80%，移植4 d后，BM-MSCs存活率不足1%，移植后BM-MSCs的存活是决定移植治疗效果的重要因素^[16]。移植环境中局部组织缺血缺氧、局部免疫和炎症反应及缺乏营养因子等因素是造成BM-MSCs死亡的主要原因。因此，该研究通过体外模拟移植区域缺氧缺血和炎症微环境，观察不同时间的缺氧缺血在炎症环境下对BM-MSCs活性的影响，同时研究BM-MSCs活性与炎症因子之间的关系。

该研究采用MTT方法检测BM-MSCs活性，采用ELISA和RT-PCR方法检测炎症因子分泌和表达，结果显示，氧糖剥夺6，12 h，BM-MSCs活力升高，而氧糖剥夺24 h，BM-MSCs活力降低；在肿瘤坏死因子α、脂多糖诱导下，氧糖剥夺6，12 h，BM-MSCs活力降低，而氧糖剥夺24 h，BM-MSCs活力出现明显降低。综上，可以认为不同缺血缺氧时间对BM-MSCs活性的影响表现不一样，缺血缺氧6，12 h BM-MSCs的活力不减反而更强，而缺血缺氧24 h BM-MSCs的活力明显降低，BM-MSCs活力随缺血缺氧时间延长呈下降趋势；在肿瘤坏死因子α、脂多糖诱导下，BM-MSCs活力受炎症因子表达和分泌影响，随着炎症因子表达和分泌增加，BM-MSCs的活力降低。

组织损伤后，大量失活组织的分解产物、细菌、毒素等可经不同途径激发机体产生炎症反应，此过程中炎症细胞活化并释放多种炎症递质，主要的炎症递质有肿瘤坏死因了α，白细胞介素1β，白细胞介素6^[17-18]，肿瘤坏死因子α主要由单核-巨噬细胞产生，多种因素包括内毒素、外毒素、真菌抗原、病毒、补体片段等均可刺激肿瘤坏死因了α生成和释放^[19]。机体缺血缺氧损伤后也经不同途径激发机体产生炎症反应，过度的炎症反应成为内环境紊乱机制的组成部分，因此该研究在缺氧缺血基础上，联合肿瘤坏死因子α、脂多糖诱导用来建立体外细胞的缺氧缺血和炎症微环境。当肿瘤坏死因子α、脂多糖与受体结合后，可通过降解IκBs的方式活化NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核内与DNA结合，促使炎症因子表达和分泌^[20]。该研究在确定炎症因子表达和分泌基础上进一步对NF-κB进行检测，结果发现，氧糖剥夺抑制NF-κB表达，氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α、氧糖剥夺+脂多糖促进NF-κB表达。缺氧缺血环境中肿瘤坏死因子α、脂多糖可能通过与受体结合，活化NF-κB，促进NF-κB进入细胞核转录炎症因子，促进炎症因子表达和分泌，进而导致细胞活力下降；而氧糖剥夺处理6 h和12 h条件下细胞活力升高，可能由于抑制了该过程。课题组将进一步深入研究以确证是否由该途径调控及其调控机制。

综上所述，移植环境中局部组织缺血缺氧、局部免疫、炎症反应及营养因子缺乏等微环境因素是造成BM-MSCs生存率低的主要原因，该研究结果显示缺血缺氧6，12 h对BM-MSCs的活力不减反而更强，而缺血缺氧24 h BM-MSCs的活力明显降低，BM-MSCs活力随缺血缺氧时间延长呈下降趋势；在肿瘤坏死因子α、脂多糖诱导下，随着炎症因子表达和分泌增加，BM-MSCs的活力降低，从而说明通过调节和改善缺血缺氧和炎症微环境有助于提高BM-MSCs存活率，为BM-MSCs移植治疗提供了更多实验依据，但炎症因子表达和分泌影响BM-MSCs活力的机制有待进一步深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

炎症诱导缺血缺氧环境下骨髓间充质干细胞的活性

Viability of bone marrow mesenchymal stem cells in inflammation-induced ischemia-reperfusion environment

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