XCT-790导致成骨细胞活性下降和骨形成不足的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0600

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 329-334.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0600

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XCT-790导致成骨细胞活性下降和骨形成不足的机制

刘少津1，万雷2，乔荣勤2，黄宏兴2，王吉利1，李钊政1

(1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240)

收稿日期:2018-08-17 出版日期:2019-01-28 发布日期:2019-01-28
通讯作者: 万雷，博士，副主任中医师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240
作者简介:刘少津，男，1990年生，江西省乐安县人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医骨伤科学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81302991，81673786) 项目负责人：万雷；广东省自然科学基金项目(2014A030310127)；广东省科技计划项目(2016A020216024)；2014广东省“优青计划”项目(yq2014041)，项目负责人：万雷

Mechanism of XCT-790 reducing activity and osteogenesis of osteoblasts

Liu Shaojin1, Wan Lei2, Qiao Rongqin2, Huang Hongxing2, Wang Jili1, Li Zhaozheng1

(1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China)

Received:2018-08-17 Online:2019-01-28 Published:2019-01-28
Contact: Wan Lei, MD, Associate chief physician, the Affiliated Third Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
About author:Liu Shaojin, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81302991 and 81673786 (to WL); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030310127; the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2016A020216024; the “Excellent Youth Plan” Project of Guangdong Province in 2014, No. yq2014041 (to WL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
DKK1(Dickkopf-1)：是一种Wnt信号通路的可溶性胞外抑制剂，可以通过竞争性地结合Wnt蛋白的共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6来阻断经典Wnt/β-catenin途径，进而调控Wnt/β-catenin途径下游靶基因的转录。DKK1可阻断Wnt/β-catenin信号通路、抑制骨形成，同时又通过与骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/前体细胞表面受体轴的串话作用促进破骨细胞的分化与成熟。
Sost：是骨形成中的抑制蛋白，也是一种调控骨分化的拮抗因子，在成熟的骨骼细胞中有特异性表达、可调控成骨细胞的分化和增殖。
XCT-790：是雌激素相关受体α(ERRα)的特异性抑制剂，可调节雌激素信号通路对成骨细胞的功能活动。
ERRα：具有调节转录基因的功能，是一个参与多种细胞生理过程的孤儿核受体。基于对雌激素受体在成骨细胞和软骨细胞分化的作用，ERRα已成为骨质疏松症和其他骨疾病的一个新的治疗目标。

摘要
背景：Wnt信号通路在骨细胞的形成、分化和成熟过程中起着重要作用，DKK1、Sost在调节骨量和成骨细胞分化中起负调节作用，是Wnt信号通路的负调节因子。XCT-790是雌激素相关受体α的特异性抑制剂，可调节雌激素信号通路对成骨细胞的功能活动。
目的：观察XCT-790对Wnt信号通路抑制因子DKK1、Sost过表达腺病毒载体转染的人成骨肉瘤细胞MG63细胞及其骨形成相关蛋白LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的作用。
方法：将MG63细胞分成8组：空白对照组、过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组、XCT-790干预空载腺病毒组、XCT-790干预过表达DKK1组、XCT-790干预过表达Sost组、XCT-790干预过表达DKK1+Sost组，根据组别不同分别用上述重组腺病毒转染MG63细胞。应用MTT法检测MG63细胞的活性，碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性，流式分析钙离子浓度；Western blot检测低密度脂蛋白相关蛋白5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达。
结果与结论：①与空白对照组对比，过表达DKK1、Sost、DKK1+Sost组及XCT-790 干预空载腺病毒组均可降低细胞活性、碱性磷酸酶活性，提高钙离子浓度；降低低密度脂蛋白相关蛋白5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达量，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；②而当XCT-790干预过表达 DKK1、Sost、DKK1 +Sost组的MG63细胞时，可进一步降低细胞活性、碱性磷酸酶活性，提高钙离子浓度；降低低密度脂蛋白相关蛋白5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达量，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；③结果说明，XCT-790直接调节Wnt信号通路的传导，同时也可协同DKK1、Sost共同抑制Wnt信号通路的开放，从而降低成骨细胞活性和骨形成相关蛋白LRP5、骨形态发生蛋白2、骨保护蛋白等的表达量，导致成骨细胞分化、增殖能力减弱和骨形成不足。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0921-9573(刘少津)

关键词: XCT-790, DKK1, Sost, MG63细胞, 雌激素相关受体α, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Wnt signaling pathway plays an important role in formation, differentiation and mature of osteocytes. As negative regulators of Wnt signaling pathway, DKK1 and Sost play negative roles in regulating bone mass and osteoblast differentiation. XCT-790, an inhibitor of estrogen receptor-related receptor α, can regulate the effect of estrogen signaling pathway on osteoclast function.
OBJECTIVE: To observe the effects of XCT-790 on the proliferation of MG63 cells transfected with DKK 1 and Sost overexpression adenovirus vector and the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP) 5, bone morphologic protein 2, osteopontin, osteoprotegerin, and connective tissue growth factor (CTGF) protein.
METHODS: MG63 cells were divided into eight groups: blank control, overexpressed DKK1 (ad-DKK1), overexpressed Sost (ad-Sost), overexpressed DKK1+Sost (ad-DKK1+Sost), XCT-790-intervened blank adenovirus, XCT-790-intervened ad-Sost, XCT-790-intervened ad-DKK1-Sost groups. The cell viability was detected by MTT assay. The alkaline phosphatase activity was detected by alkaline phosphatase kit. Ca2+ concentration was detected by flow cytometer. Expression of LRP5, bone morphologic protein 2, osteopontin, osteoprotegerin and CTGF was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, ad-DKK1, ad-Sost, ad-DKK1+Sost and XCT-790-intervened blank adenovirus groups could significantly decrease the cell activity, alkaline phosphatase activity, increase calcium concentration and down-regulate the expression of LRP5, bone morphologic protein 2, osteopontin, osteoprotegerin and CTGF (P < 0.05). In the XCT-790-intervented ad-DKK1, ad-Sost, ad-DKK1+Sost groups, the cell activity, alkaline phosphatase activity, and the expression of LRP5, bone morphologic protein 2, osteopontin, osteoprotegerin and CTGF were significantly reduced, and the Ca2+ concentration was significantly increased (P < 0.05). In summary, XCT-790 can directly regulate Wnt signaling pathway, and can cooperate with DKK1 and Sost to inhibit Wnt signaling pathway, thereby decreasing the activity of osteoblasts, LRP5, bone morphologic protein 2, osteopontin, osteoprotegerin, and CTGF protein expression, and further decreasing differentiation, proliferation and osteogenesis of osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Estrogen Receptor alpha, Adenoviridae, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

刘少津，万雷，乔荣勤，黄宏兴，王吉利，李钊政. XCT-790导致成骨细胞活性下降和骨形成不足的机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 329-334.

Liu Shaojin1, Wan Lei2, Qiao Rongqin2, Huang Hongxing2, Wang Jili1, Li Zhaozheng1 . Mechanism of XCT-790 reducing activity and osteogenesis of osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 329-334.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年3月在广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞及试剂人成骨肉瘤细胞(MG63)购于中国科学院上海细胞所细胞库；XCT-790由美国Sigma提供；DMEM培养基、胎牛血清、Pen/Strep、Opti-MEM 培养基(Gibco)；Lipofectamine、TRIzol Reagent、反转录试剂盒、One Shot^® Stbl3^TM E.coli 感受态细胞、BP ClonaseII enzyme mix、LR ClonaseII enzyme mix (Invitorgen)；胶回收/纯化试剂盒、质粒提取试剂盒(中国天根公司)；DH5α 感受态细胞(北京鼎国公司)；AgeⅠ、EcoRⅠ、PacⅠ、T₄ DNA连接酶(NEB)，RIPA 细胞裂解液(Sigma)；抗DKK1抗体(美国CST公司)；抗Sost抗体、抗骨形态发生蛋白2抗体、抗骨桥蛋白抗体、抗骨保护蛋白抗体(Abcam公司)；抗Lrp5抗体、抗结缔组织生长因子抗体(Santa)；Calcium Otange^TM Indicators(Molcular Probes)。

1.3.2 实验仪器 DHP-9052细胞培养箱(上海一恒)；SW-CJ-1FD超净工作台(江苏苏净)；H1650-W/H1650W高速低温离心机(中国湘仪)；TC-S普通PCR仪(中国博日公司)；ABI7500荧光定量 PCR仪(Thermo)；Mini-PROTEAN Tetra电泳仪(Bio-rad)；Mini Trans-Blot蛋白转印仪(Bio-rad)；ChemiDoc MP凝胶成像系统(美国Bio-rad)；IX73倒置荧光显微镜(美国OLYMPUS公司)；Aria Ⅱ流式细胞仪(BD)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养人成骨细胞MG63以1×10⁹L^-1细胞浓度接种于T75，加入适量DMEM高糖培养基(含体积分数10% FBS，1%Pen/Strep)于体积分数5%CO₂，饱和湿度下培养。待长至80%左右融合，消化、收集细胞，以1∶3比例进行传代。

1.4.2 病毒转染细胞前期研究发现腺病毒过表达 DKK1、Sost可降低MG63细胞增殖和碱性磷酸酶活性，升高钙离子浓度，对骨调节蛋白有一定影响^[8]。收集对数期MG-63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷L^-1，96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，使96孔板中每孔的细胞为2 000个。将96孔板置于37 ℃，体积分数5% CO₂及饱和湿度条件下培养。培养24 h后，用过表达重组腺病毒颗粒感染MG63细胞(MOI=50)。

将MG63细胞分成空白对照组、过表达DKK1 (ad-DKK1)组、过表达Sost(ad-Sost)组、过表达DKK1+ Sost(ad-DKK1+Sost)组、XCT-790干预空载腺病毒组、XCT-790干预过表达DKK1组、XCT-790干预过表达Sost组、XCT-790干预过表达DKK1+Sos组，根据组别不同分别用上述重组腺病毒转染MG63细胞。

1.4.3 XCT790干预MG63细胞含体积分数10% FBS DMEM高糖培养基=1∶1 000的比例稀释XCT-790，配成 100 μmol/L XCT-790的DMEM高糖培养基(二甲基亚砜终浓度为0.1%)，分别干预各组MG63细胞。

1.4.4 MTT检测细胞的活性分别向每孔中加入5 g/L MTT溶液10μL，继续于细胞培养箱内培养4 h。终止培养，吸去孔内培养基，每孔加入200 μL 二甲基亚砜，置于摇床上室温低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，于酶标仪上测定A₄₉₀。MTT法检测细胞的活性。

1.4.5 碱性磷酸酶细胞活性检测消化收集细胞，分别提取各组细胞总蛋白，12 000 r/min离心30 min，取上清50 μL加入有50 μL检测缓冲液和50 μL显色底物中，在405 nm 或400-415 nm测定吸光度，并与不同用量标准品的吸光度比较，测出蛋白浓度后测定碱性磷酸酶活性，碱性磷酸酶活性计算：由标准曲线计算的酶活性*稀释倍数(2.5)/蛋白质量浓度(g/L)。

1.4.6 流式分析钙离子浓度消化收集细胞，PBS洗涤细胞沉淀3次。钙荧光探针负载：取细胞悬液，加入Calcium Orange Indicator(溶于二甲基亚砜，浓度为2 mmol/L)至终浓度为10 μmol/L，置细胞培养箱中孵育1 h，其间轻微振荡3次，离心，去掉多余染料，再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释。上机，测定每管细胞悬液样品的荧光强度(Ex/Em549 nm/576 nm)，记为F值。按公式计算胞内游离钙离子浓度。

[Ca²⁺]free=Kd·[(F-F_min)/(F_max-F)]

1.4.7 蛋白印记(Western blot)检测LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达消化收集细胞，提取细胞总蛋白，主要方法为：消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min，预冷PBS洗涤细胞沉淀2次，向细胞沉淀中加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液，置于冰上裂解细胞30 min，期间用枪头吹打使细胞充分裂解。4 ℃，12 000 r/min离心30 min，小心转移上清到新的预冷的EP管中，-20 ℃保存备用。

上样、电泳、转膜、免疫反应，化学发光显色后进行图像分析，Western blot检测MG63细胞中LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达量。

1.5 主要观察指标 ①各组MG63细胞活性、碱性磷酸酶活性、对钙离子浓度的影响；②各组MG63细胞中LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料数据以x(_)±s表示，数据呈正态分布且方差齐性，组间比较采用单因素方差分析及多重比较采用LSD-t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨质疏松症的发生与成骨细胞活性密切相关，治疗骨质疏松症可以从提升成骨细胞活性入手，例如特立帕肽能显著增加成骨细胞的数目和活性，是临床骨质疏松症的一线治疗药物^[9]。绝经后骨质疏松症的主要病因是雌激素水平下降，雌激素可以影响成骨细胞的增殖、分化、凋亡等过程^[10]，同时ERR可参与调控雌激素信号而调节成骨细胞的活性和功能^[2]。ERR 分为α、β、γ 3 种亚型，大多数对ERRα的研究主要集中在肿瘤、糖尿病等方面^[11]。该实验主要研究ERRα特异性抑制剂XCT-790对成骨细胞的作用，以探讨ERRα与骨质疏松症之间的关系。

Wnt信号激活后可刺激成骨细胞基因转录水平上升，可调节成骨细胞增殖、分化及加快骨质形成进程。DKK1是成骨中的一个拮抗因子，在很多肌肉骨骼疾病、一些肿瘤的发病过程中起重要作用，能抑制Wnt信号通路的开放^[12]。Sost是骨形成中的抑制蛋白，也是一种调控骨分化的拮抗因子，在成熟的骨骼细胞中有特异性表达，可调控成骨细胞的分化和增殖^[13]。ERRα有调节转录基因的功能，是一个参与多种细胞生理过程的孤儿核受体^[14]。基于对雌激素受体在成骨细胞和软骨细胞分化的作用，ERRα已成为骨质疏松症和其他骨疾病的一个新的治疗目标。Auld 等^[15]发现成骨细胞中内源性ERRα可抑制经典Wnt信号通路靶基因表达。ERRα蛋白在所有发育和成熟的软骨和膜内骨中也高表达，表明ERRα可能具有影响骨形成、吸收和分化增殖的功能。骨形成是一个由多种因素调节的复杂过程，在这个程中，激素与生长因子调节既相对独立又相互联系^[14]。

LRP5是一种存在于成骨细胞表面的膜蛋白，它在成骨细胞中的表达比在破骨细胞中高；其表达改变和功能丢失，可降低体外培养鼠头盖骨骨质密度，使骨质厚度变薄^[16]。而骨形态发生蛋白2作为骨形态发生最早期的信号分子，也是目前研究最为广泛、诱导成骨作用最强的骨形态发生蛋白^[17]，骨形态发生蛋白2可以调节成骨细胞的分化，沉默骨形态发生蛋白2的成骨细胞前体分化能力会降低^[18]。骨保护蛋白是肿瘤坏死因子受体家族成员，有抑制破骨细胞形成和活化的功能，还可抑制肿瘤坏死因子α诱导的成骨细胞凋亡，并减少肿瘤坏死因子α转基因鼠骨量的丢失^[19]。同时骨桥蛋白是一种分泌型糖蛋白，在骨基质矿化、吸收及骨重塑等过程中发挥着重要作用，是介导骨组织细胞与骨基质间的桥梁^[20]。在骨吸收过程中，骨桥蛋白可刺激成骨细胞的增殖分化，促进骨组织内矿物质的沉积，抑制骨丢失，增强骨形成能力^[21]。在促进软骨内成骨和关节软骨再生的过程中，结缔组织生长因子是成骨细胞分化增殖的有效因子，能促进成骨细胞的活化^[22]，进而导致成骨细胞增殖和分化能力的提高^[23]。

作者前期研究发现过表达DKK1、Sost能抑制MG63细胞活性、碱性磷酸酶活性和降低骨保护蛋白、LRP5、骨形态发生蛋白2、结缔组织生长因子、成纤维细胞生长因子2、骨桥蛋白的表达，提高肿瘤坏死因子α的表达^[24]，进而导致成骨细胞的骨形成减少。沉默DKK1、Sost 重组腺病毒感染MG63细胞后，MG63细胞增殖能力、碱性磷酸酶活性均升高，而细胞内钙离子浓度则降低，尤以二者共沉默组变化最明显^[24]。

此次实验结果表明，过表达DKK1、Sost和XCT-790均可降低MG63细胞活性和碱性磷酸酶的活性，同时也可降低骨相关蛋白LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达量，提高细胞中的钙离子浓度。而当XCT-790干预Ad-Sost、Ad-DKK1感染的MG63细胞时，可增强DKK1、Sost对MG63细胞活性和碱性磷酸酶活性的抑制作用，也可增强因过表达DKK1、Sost而提高钙离子浓度的作用，而LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子的表达量较未经干预的过表达组有所降低。这与作者前期实验结果一致，说明XCT-790可能对Wnt信号通路的开放也有抑制作用，或是对DKK1、Sost起到了协同调节的作用。但前期实验表明ERRα特异性抑制剂XCT-790可降低沉默DKK1腺病毒载体转染MG63活性和骨相关蛋白骨桥蛋白、LRP5、骨形态发生蛋白2的表达^[7]。结合此次研究结果可知，不论过表达或是沉默DKK1、Sost，XCT-790均可降低MG63细胞活性和碱性磷酸酶的活性，同时也可降低骨相关蛋白LRP5、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨保护蛋白、结缔组织生长因子等的表达量，提高细胞中的钙离子浓度。证明XCT-790可能是直接调节Wnt信号通路的传导，同时也可协同DKK1、Sost共同抑制Wnt信号通路的开放，从而降低成骨细胞活性和骨形成相关蛋白LRP5、骨形态发生蛋白2、骨保护蛋白等的表达量，导致成骨细胞分化、增殖能力减弱和骨形成不足，诱发骨质疏松；但XCT-790与Wnt信号通路之间的具体联系，或雌激素与骨质疏松症的内在关系，仍需要进一步研究探讨。

此次研究的局限性在于，只研究了ERRα的特异性抑制剂XCT-790对过表达DKK1、Sost腺病毒载体转染的MG63细胞的影响，未对XCT-790进行沉默或过表达来干预转染的MG63细胞；或是与沉默DKK1、Sost腺病毒载体转染的MG63细胞进行比较；且XCT-790是通过作用ERRα来调节Wnt信号通路，进而调控成骨细胞的活性和骨相关蛋白，这种间接调节骨形成活动研究有待进一步深入探讨。

此次研究的主要意义是从腺病毒载体转染成骨细胞，并检测细胞活性、碱性磷酸酶和钙离子浓度，直接说明ERRα的特异性抑制剂XCT-790对骨形成的影响作用，从而表明雌激素对Wnt信号通路的调节，影响成骨细胞分化、增殖能力和骨形成，为绝经后骨质疏松症的发病机制提供实验依据，促进骨质疏松症的临床防治。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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