超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0487

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2114-2119.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0487

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响

谢青松，单钰栋，傅小君，许信龙，华杰，闻路通

慈溪市人民医院神经外科，温州医科大学附属慈溪医院，浙江省宁波市 315300

修回日期:2017-11-24 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 谢青松，硕士，副主任医师，慈溪市人民医院神经外科，温州医科大学附属慈溪医院，浙江省宁波市 315300
作者简介:谢青松，男，1978 年生，四川省南充市人，汉族，2007年南京医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事干细胞移植与细胞示踪的实验研究，脑脊髓神经损伤的基础研究和临床治疗，脊柱退行性疾病的临床治疗等工作。
基金资助:
浙江省自然科学基金资助项目(LY15H090018)；宁波市自然科学基金项目(2014A610253)

Superparamagnetic iron oxide labeling influences in vitro differentiation of induced pluripotent stem cells

Xie Qing-song, Shan Yu-dong, Fu Xiao-jun, Xu Xin-long, Hua Jie, Wen Lu-tong

Department of Neurosurgery, Cixi People’s Hospital, Cixi Hospital of Wenzhou Medical University, Ningbo 315300, Zhejiang Province, China

Revised:2017-11-24 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Xie Qing-song, Department of Neurosurgery, Cixi People’s Hospital, Cixi Hospital of Wenzhou Medical University, Ningbo 315300, Zhejiang Province, China
About author:Xie Qing-song, Master, Associate chief physician, Department of Neurosurgery, Cixi People’s Hospital, Cixi Hospital of Wenzhou Medical University, Ningbo 315300, Zhejiang Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Zhejiang Province, No. LY15H090018; the Natural Science Foundation of Ningbo Municipality, No. 2014A610253

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
超顺磁性氧化铁标记：超顺磁性氧化铁是一种纳米级大小的磁性铁颗粒，该颗粒的顺磁性，使得它对外加磁场具有很高的灵敏性并且能够影响磁场分布的均匀性。随着研究的不断深入，发现纳米级大小的超顺磁性氧化铁颗粒可以进入干细胞内，而且几乎不影响干细胞的生长、克隆增殖及分化等，通过磁共振成像可以将有超顺磁性氧化铁标记的细胞区分开，是一种很好的干细胞移植活体无创示踪材料。纳米级超顺磁性氧化铁作为一种磁性标记物引起了研究者极大的兴趣。
诱导多功能干细胞技术：通过向体细胞中导入特定基因或是特定基因产物，如蛋白质等，使得该体细胞成为具有分化成各种细胞的能力。目前该项研究在人类多种疾病中广泛开展，具有较大的研究价值。

摘要
背景：超顺磁性氧化铁标记技术是一种经典的干细胞活体无创示踪手段，目前已广泛应用于干细胞移植相关的基础与临床研究中。诱导多功能干细胞是目前最有潜力用于细胞移植治疗的种子细胞之一，超顺磁性氧化铁标记技术是否也能够用于诱导多功能干细胞的无创示踪，关键看该材料标记后是否严重影响细胞的分化，目前这方面的研究鲜有报道。
目的：探究超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响。
方法：分离、培养大鼠皮肤成纤维细胞，用高效重组载体和病毒包装含有目的基因(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产。使用包装有目的基因的慢病毒载体感染大鼠皮肤成纤维细胞，得到诱导多功能干细胞。实验分2组：实验组诱导多功能干细胞采用超顺磁性氧化铁体外标记后行神经诱导分化，对照组诱导多功能干细胞(未用超顺磁性氧化铁体外标记)直接行神经诱导分化。对磁标记诱导多功能干细胞进行普鲁士蓝染色和透射电镜观察。免疫组化检测诱导分化后神经元特异性烯醇化酶的表达，流式细胞仪检测分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例。
结果与结论：①超顺磁性氧化铁粒子标记后普鲁士染色和透射电镜观察可见细胞胞浆内含致密铁颗粒；②诱导多功能干细胞进行神经诱导分化后神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达；③实验组诱导多功能干细胞分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，超顺磁性氧化铁粒子标记对诱导多功能干细胞向神经元样细胞分化无明显影响，合理应用这种新型细胞标记术将促进对再生医学种子细胞的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-8442-0173(谢青松)

关键词: 超顺磁性氧化铁, 示踪, 病毒载体, 干细胞, 诱导多功能干细胞, 颅脑损伤, 浙江省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Superparamagnetic iron oxide (SPIO) labeling technology is a classic noninvasive tracing method, which has been widely used in the stem cell transplantation. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are currently one of the most promising seed cells for cell transplantation. Whether SPIO labeling can also be used to noninvasively trace induced pluripotent stem cells is rarely reported, and concern has been raised about whether SPIO markedly impacts the differentiation of iPSCs.
OBJECTIVE: To investigate the effects of SPIO labeling on the differentiation of iPSCs in vitro.
METHODS: Rat fibroblasts were isolated and cultured. Efficient recombinant vector and plasmids that were packaged by virus and contained target genes (Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc) were transfected into 293T cells for virus packaging and production. The packaging lentiviral vectors that contained target genes infected rat fibroblasts to obtain iPSCs. SPIO-labeled (experimental) or unlabeled (control) iPSCs were subjected to neural induction and differentiation. Prussian blue staining and transmission electron microscope observation were performed for SPIO-labeled iPSCs. Immunohistochemical method was used to detect neuron-specific enolase expression after induced differentiation. Flow cytometry was used to detect the proportion of neurons and glial cells differentiated from iPSCs.
RESULTS AND CONCLUSION: There were dense iron particles in the cytoplasm of SPIO-labeled iPSCs shown by Prussian staining and under transmission electron microscope. Differentiated iPSCs were positive for neuron-specific enolase. In addition, the proportion of neurons and glial cells showed no difference between the experimental and control groups. To conclude, SPIO labeling has no obvious effect on the capacity of iPSCs differentiating into neurons. Reasonable application of this new cell labeling technique will promote the development of seed cells in regenerative medicine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Induced Pluripotent Stem Cells, Craniocerebral Trauma, Superoxides, Tissue Engineering

中图分类号:

R349.2

谢青松，单钰栋，傅小君，许信龙，华杰，闻路通. 超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2114-2119.

Xie Qing-song, Shan Yu-dong, Fu Xiao-jun, Xu Xin-long, Hua Jie, Wen Lu-tong. Superparamagnetic iron oxide labeling influences in vitro differentiation of induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2114-2119.

图/表（结果） 1

2.1 荧光显微镜观察分离培养获得的成纤维细胞 取传代后48 h的大鼠成纤维细胞，荧光显微镜观察可见细胞贴壁生长，呈梭形且生长速度快(图1)，胞浆中可见波形蛋白染色，获得的成纤维细胞纯度约为96%。

2.2 慢病毒基因重组载体系统的构建 分别用EcoRⅠ酶切慢病毒载体(图2)和含有目的基因(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的质粒，割胶回收线性化的载体及含有目的基因的质粒片段。将包含有目的基因的质粒片段与该慢病毒载体连接，得到慢病毒基因重组载体(图3)。将含有目的基因的慢病毒基因重组载体转染到293T细胞中获得大量能够表达该重组载体的高质量病毒。

2.3 标记前后iPSCs的形态 取培养的iPSCs，吸掉细胞培养基，用PBS冲洗，胰酶消化，在荧光显微镜下观察，此时的iPSCs细胞质中未见明显的有色成分(图4A)；在光学显微镜下观察SPIO转染标记的iPSCs，此时的iPSCs细胞质中局部染色，呈浅褐色(图4B)。SPIO标记细胞行普鲁士蓝染色后，光镜观察可见细胞质内大量蓝色致密颗粒(图4C)，iPSCs的磁化标记有效率达95%以上(SPIO标记阳性率=阳性细胞数/细胞总数×100%)。透射电镜观察可见iPSCs胞浆内含大量黑色超顺磁氧化铁(图4D)。

2.4 免疫组化检测神经元细胞标记物神经元特异性烯醇化酶的阳性表达 诱导分化后大部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶阳性表达，iPSCs诱导分化率为(82.28±17.72)%，见图5A，B，而使用一抗为PBS的对照组则无阳性表达，见图5C，D。

2.5 流式细胞仪检测分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例 实验组的神经元样细胞占总细胞的比例为74.4%，对照组的神经元样细胞占总细胞的比例为76.6%，两组差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组的胶质样细胞和对照组的胶质样细胞占总细胞的比例分别为25.6%和23.4%，两组差异无显著性意义(P > 0.05)。见图6。

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引言

诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞，可利用重编程技术从分化的体细胞中获得，是再生医学理想的种子细胞^[1-4]。目前，科学家已成功从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导获得iPSCs，并在体外将iPSCs成功分化为心血管细胞、原始生殖细胞、神经元样细胞、神经胶质细胞等^[5-7]。由于神经元细胞死亡后，自身再生修复极其困难，而iPSCs取材容易，且可分化为神经元样细胞，用于治疗颅脑损伤、脑卒中等疾病致残的医学难题具有先天优势及诱人前景。但iPSCs要最终用于临床治疗中枢神经系统疾病，仍有许多瓶颈和临床技术问题急需攻克^[8-9]，如iPSCs在颅脑损伤组织中的动态迁移规律、与宿主神经细胞的功能整合、治疗效果及生物安全性等情况均不明确，因此需要对这种细胞进行标记，以便对其进行有效的识别和追踪监测，明确移植细胞在治疗中所起的功能作用，还需要标记后不影响iPSCs分化为神经元样细胞。超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide particles，SPIO)标记技术是近年来迅速发展的一种新型细胞标记技术，利用MRI在活体上示踪磁标记细胞具有无创性、可重复性、动态性等特性，对活体细胞的示踪具有良好的前景^[10-13]。虽然这种标记技术已经用于其他干细胞，但将该技术用于示踪iPSCs，并研究该材料标记后对iPSCs体外诱导分化的影响却鲜有报道。iPSCs移植后分化为神经元样细胞以替代修复因疾病而死亡的神经元，从而治疗颅脑损伤等中枢神经系统疾病。因此，有必要明确SPIO标记后对iPSCs分化为神经元样细胞有无显著影响。实验拟利用SPIO对iPSCs进行标记，检测SPIO标记对iPSCs体外分化的影响，为该细胞标记示踪技术用于iPSCs移植治疗脑损伤等中枢神经系统疾病奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2017年3月在温州医科大学附属慈溪医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD近交系大鼠40只，雄性，6周龄，体质量200-250 g，由扬州大学动物实验中心提供，清洁级饲养。

1.3.2 实验用主要仪器 倒置相差显微镜TE2000(利康公司)；流式细胞仪(EPICS-XL型)(Coulter Co.Healeah, FL)；多功能酶标仪(Bio-Tek公司)；透射电子显微镜(7650型)(Hitachi公司，日本)；免疫荧光显微镜(Olympus公司，日本)；原子吸收分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司)；倒置相差光学显微镜与倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)。

1.3.3 实验用主要试剂 超顺磁性氧化铁(SPIO，二巯基丁二酸修饰三氧化二铁纳米颗粒，上海擎华生物科技有限公司)，DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；DAPI(美国Invitrogen公司)；Hank’s液(意大利Euroclone公司)；普鲁士蓝染色剂(北京雷根生物技术有限公司)；Total RNA 试剂盒(MRC公司)；EcoRⅠ内切酶、RT-PCR 试剂盒、One Step RNA PCR Kit(AMV)、凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、T₄DNA连接酶(宝生物公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 成纤维细胞的分离、培养 处死大鼠，取皮肤组织放入体积分数为75%乙醇中浸泡消毒，然后放入含有Hank’s液的平皿中漂洗3次，将皮肤剪成1 mm²大小，平铺于25 cm²培养瓶中，间隔约0.5 cm，底面朝上，加入适量含体积分数为15%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置入37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养24 h，使皮肤能够牢固平贴于平皿上。24 h后再加入足量的培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养，1周后将组织块去除，即可见成纤维细胞生长(在这1周内除了中间换1次培养基，尽量勿动培养瓶)。此后，每2 d换1次培养液，8-10 d可见细胞铺满瓶底，成纤维细胞爬出并融合90%左右时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-10代细胞进行实验。

1.4.2 慢病毒基因重组载体的构建和病毒液的制备 用高效重组载体和病毒包装含有目的基因(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的质粒共转染293T细胞^[14-17]，进行病毒包装和生产，收集病毒液。具体步骤为：首先，对含Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc基因的质粒进行测序，酶切目的基因，并用PCR验证，然后，插入EGFP荧光标记目的基因，使用高效重组载体和病毒包装含有目的基因(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液。浓缩、纯化病毒液，病毒液滴度为(5×10¹¹ PFU/L)。最后，用高质量的病毒液感染细胞。

1.4.3 用大鼠成纤维细胞制备iPSCs及鉴定 用包装有目的基因(Oct4，Sox2，Klf4 和c-Myc)的慢病毒载体感染大鼠成纤维细胞，得到iPSCs(此方法为2012年诺贝尔医学奖获得者及近年来文献报道的获得iPSCs的公认方法)^[9-13]，首先取第3代成纤维细胞以1×10⁵密度接种于24孔板中。转染第1天，根据成纤维细胞的MOI值计算所需要的病毒量，对病毒浓缩液进行稀释，移除原培养基后，改用含有所需病毒液的培养基，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。转染第2天，吸掉细胞培养基，改换正常新鲜培养基。转染第5天，换液后荧光显微镜下观察病毒转染情况和细胞形态。

1.4.4 SPIO标记iPSCs 将10 g/L质量浓度的SPIO原液(DMSA@Fe₂O₃，二巯基丁二酸修饰三氧化二铁纳米颗粒)用DMEM/F12无血清培养基稀释，然后使用漩涡混合器间歇混合10 min，制备成含终质量浓度为25 mg/L的SPIO氧化铁标记液。待第3代iPSCs长至培养瓶底85%面积时，弃去原含血清的培养液，PBS冲洗2遍，取标记液予以等量换液，放入培养箱孵育过夜24 h。标记的iPSCs进行普鲁士蓝染色、光学显微镜及透射电镜观察。

1.4.5 iPSCs的诱导分化 神经元特异性烯醇化酶是普遍存在于生物体细胞质中的一种糖代谢相关酶，在自然界存在5种同工酶，它们均为3种免疫性质不同的Q、P、Y亚基组成的二聚体，其中Y型同工酶特异性的存在于神经元细胞。因此神经元特异性烯醇化酶可做为iPSCs分化为神经元样细胞的标志物。实验进一步诱导iPSCs向神经元样细胞分化，按照先前的研究及实验步骤^[18]，诱导分化48 h后，吸弃6孔板内的培养液，PBS冲洗；40 g/L多聚甲醛固定至少30 min，PBS冲洗；体积分数为3%H₂O₂甲醇溶液浸泡15 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2 min×3次；滴加正常山羊血清封闭液，室温10 min；滴加1︰100稀释的兔抗大鼠NSE，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 10 min，PBS冲洗2 min×3次；滴加三抗，37 ℃ 10 min，PBS冲洗2 min×3次；DAB显色，蒸馏水冲洗，脱水透明封固。对照组采用PBS代替一抗。

1.4.6 流式细胞仪检测 将SPIO标记iPSCs作为实验组，未用SPIO标记iPSCs作为对照组。分化48 h后将实验组和对照组细胞分别用200目筛网过滤，收集细胞悬液入15 mL离心管中；4 ℃离心，PBS洗涤2次，1 000 r/min，每次5 min；用PBS调整细胞浓度至1×10¹¹L^-1，分装Ep管；每管加入体积分数为75%冷乙醇固定细胞，-30 ℃过夜；4 ℃离心洗涤2次，弃上清；每管加入0.25% Triton 600 μL重悬细胞，室温静置5 min；4 ℃离心洗涤2次，弃上清；两组均加入一抗GFAP(1∶1 000)和RIP(1∶100)各 100 μL，4 ℃孵育过夜；4 ℃离心洗涤2次，弃上清；每管加入100 μL二抗FITC(1∶100)，室温避光孵育60 min；4 ℃离心洗涤2次，弃上清；1 mL PBS重悬细胞；阴性对照以100 μL PBS代替一抗，其余处理步骤同上，上流式细胞仪检测。

1.5 主要观察指标 流式细胞仪检测分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用独立样本的t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较行χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

创伤性脑损伤是指由外力对头部的冲击或撞击，急速的加速或减速，外物穿入脑内等引起的脑功能的改变，包括知觉丧失或降低，精神状态的改变，记忆力受损等^[19-22]。由于中枢神经细胞自身再生修复极其困难，颅脑损伤等中枢神经疾病常常永久性致残，且随着经济和交通的发展，发病率还在逐年增高，长期受到世界各国科研工作者的重视^[23-25]。世界卫生组织研究表明，到2020年创伤性脑损伤将成为死亡和致残的主要疾病^[26-27]。干细胞再生医学的发展为人类攻克颅脑损伤致残这一世界性难题带来了希望，但是各种神经干细胞的来源限制无法满足实验及临床需要^[28-29]。

2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体转染小鼠成纤维细胞成功得到类似胚胎干细胞的一种细胞类型(即iPSCs)^[30]。该iPSCs是由一些多能遗传基因导入皮肤等受体细胞中制备而成，然后进一步进行体外诱导分化，得到理想的细胞株。iPSCs在体外可诱导分化为心血管细胞、原始生殖细胞，神经元样细胞、神经胶质样细胞等，是再生医学理想的种子细胞，具有先天优势及诱人前景^[31-33]。但iPSCs在颅脑损伤组织中的动态迁移规律、与宿主神经细胞的功能整合、治疗效果及生物安全性等情况均不明确，这就有必要采用目前的干细胞活体示踪技术来研究iPSCs在脑内的生物行为。

SPIO是迄今为止最广泛使用于体内的细胞对比剂，其原理是通过细胞摄取磁性粒子而被磁性标记，当标记细胞植入体内后，可以通过MRI技术来实时示踪所标记细胞^[34-37]，超顺磁性氧化铁纳米粒子较其他细胞标记物具有更高的生物相容性和生物降解性，将其标记干细胞后进行MRI成像已经成为一项特定的探测目标细胞的技术，因此，SPIO标记iPSCs可用于临床动态无创监测iPSCs在颅脑损伤组织中的动态迁移规律，评估iPSCs与宿主神经细胞的整合情况及脑损伤后的结构修复情况。SPIO标记iPSCs对其分化功能的影响将会是iPSCs在临床应用上的最大问题。作者通过实验顺利构建重组载体并且成功转染成纤维细胞获得iPSCs。SPIO标记24 h后普鲁士蓝染色发现，iPSCs细胞质内可见大量致密的蓝染铁颗粒，细胞标记率均达95%以上。免疫组化检测神经细胞标记物(神经元特异性烯醇化酶)的阳性表达，发现iPSCs诱导分化率为(82.28±17.72)%，进一步使用流式细胞仪检测iPSCs分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例，结果表明，实验组与对照组中的神经元样细胞及胶质样细胞在总细胞中所占的比例相差不大，即差异无显著性意义(P < 0.05)。

综上所述，实验中的新型超顺磁性氧化铁具有标记效果好、操作简单、性质稳定等特点，对iPSCs标记良好，对其分化为神经元样细胞等功能无显著影响，这为进一步研究iPSCs移植入体内后的动态迁移规律、与宿主细胞的功能整合、治疗效果等方面提供了理论依据。该细胞标记示踪技术除可用于iPSCs移植治疗颅脑损伤等中枢神经系统疾病，还可用于iPSCs移植治疗其他疾病的研究，值得进一步研究和推广。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响

Superparamagnetic iron oxide labeling influences in vitro differentiation of induced pluripotent stem cells

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