靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA：筛选和评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0483

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2104-2108.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0483

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA：筛选和评价

朱华民^1，2，王旭³，徐艳³，杨力建²，陈少华²，吴秀丽²，李扬秋^2，3

¹南方医科大学深圳医院，广东省深圳市 518102；²暨南大学医学院血液病研究所，广东省广州市 510632；³暨南大学再生医学教育部重点实验室，广东省广州市 510632

修回日期:2017-12-02 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 李扬秋，博士，研究员，暨南大学医学院血液病研究所，广东省广州市 510632；暨南大学再生医学教育部重点实验室，广东省广州市 510632
作者简介:朱华民，男，1977年生，湖北省武汉市人，汉族，2014年暨南大学毕业，博士，副主任医师，主要从事血液科临床工作及血液免疫治疗研究。

Screening and evaluation of Smo-siRNA targeted to inhibition of Molt-4 cell proliferation

Zhu Hua-min^{1, 2}, Wang Xu³, Xu Yan³, Yang Li-jian², Chen Shao-hua², Wu Xiu-li², Li Yang-qiu^{2, 3}

¹Shenzhen Hospital, Southern Medical University, Shenzhen 518102, Guangdong Province, China; ²Institute of Hematology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; ³Key Laboratory for Regenerative Medicine of Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Revised:2017-12-02 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Li Yang-qiu, M.D., Investigator, Institute of Hematology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Key Laboratory for Regenerative Medicine of Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:Zhu Hua-min, M.D., Associate chief physician, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, Shenzhen 518102, Guangdong Province, China; Institute of Hematology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
靶向治疗：是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)。设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。
Hedgehog信号通路：是人类胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路。该信号通路在人类多种肿瘤中异常激活，并对这些肿瘤的生长起着促进作用。Smo是Hedgehog信号传递所必需的受体，在无Hedgehog信号的情况下，激活Smo可导致Hedgehog靶基因的活化；Smo基因突变时，可出现与Hedgehog基因突变相同的表征。T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型，临床上一直存在难治疗、耐药和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要目标。

摘要
背景：研究表明，T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关。Smo基因是该信号通路中的关键基因，控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递。
目的：筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA)。
方法：①根据siRNA设计原理，设计并化学合成Smo-siRNA 1，2，3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA；②利用Nuclefector^TM核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞)，分别在转染24，48，72 h 采用qRT-PCR 检测Smo mRNA相对表达水平，CCK-8法检测细胞生长抑制率，Hoechst33258 染色观察细胞凋亡形态，流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡率。
结果与结论：①利用Nuclefector^TM核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞，Smo-siRNA 1沉默效果最佳，有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P < 0.05)，并且以48 h作用效果最明显；②转染后24 h，Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P < 0.05)；③Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化；④与对照组比较，Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P < 0.05)；⑤结果表明，小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖，并促进凋亡，提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3792-275X(朱华民)

关键词: 干细胞, 小干扰RNA, Smo基因, Molt-4细胞, 细胞凋亡, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the occurrence and development of T lymphocytic leukemia is related to the abnormality of Hedgehog pathway. The Smo gene is a key gene in this signaling pathway and controls the transmission of Hedgehog signaling into the cell membrane.
OBJECTIVE: To design and screen a highly efficient and specific Smo-siRNA which is able to downregulate the Smo gene expression in Molt-4 cells, thereby inhibiting the Molt-4 cells proliferation and inducing apoptosis.
METHODS: (1) Smo-siRNAs numbered 1, 2 or 3, and the scrambled non-siRNA control (SC) were obtained by chemosynthesis. Untreated and sc-treated cells were used as controls. (2) Smo expression levels in Molt-4 cells were analyzed using qRT-PCR at 24, 48, 72 hours after siRNAs delivered by NuclefectorTM. Cell proliferation in vitro was assayed by the cell counting kit-8. The morphology and percentage of apoptotic cells were revealed by Hoechst33258 staining and flow cytometry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Smo-siRNAs were successfully transferred into Molt-4 cells, and exhibited best silencing results. After transfection with Smo-siRNA1, the mRNA level of Smo was significantly reduced (P < 0.05), and the lowest level was at 48 hours after transfection. (2) Cell proliferation of Molt-4 cells was significantly inhibited by Smo-siRNA at 24 hours after transfection. (3) Hoechst staining results showed morphological changes of Molt-4 were in accordance with those of apoptotic cells. (4) The apoptotic rate was significantly increased in the Smo-siRNA group compared with the control group (P < 0.05). Findings from this study showed that suppression of Smo by RNA interference could effectively inhibit proliferation and induce apoptosis in Molt-4 cells, indicating that Smo-siRNA as gene targeted therapy or synergistic treatment has therapeutic potential in T-cell malignancies.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: RNA, Small Interfering, Leukemia, T-Cell, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱华民，王旭，徐艳，杨力建，陈少华，吴秀丽，李扬秋. 靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA：筛选和评价[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2104-2108.

Zhu Hua-min, Wang Xu, Xu Yan, Yang Li-jian, Chen Shao-hua, Wu Xiu-li, Li Yang-qiu. Screening and evaluation of Smo-siRNA targeted to inhibition of Molt-4 cell proliferation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2104-2108.

图/表（结果） 1

2.1 Smo-siRNA特异性抑制Smo在Molt-4 T细胞中表达水平 利用转染试剂将Alexa Red Oligo转染进入Molt-4细胞，转染后6 h在倒置荧光显微镜下可见部分细胞显示红色荧光。Smo-siRNA转染Molt-4细胞为C-005程序，通过荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率为(60.12±10.13)%。

转染24，48，72 h，各组Molt-4细胞Smo mRNA相对表达量发生变化，见图1。其中，Smo-siRNA1，2转染组Molt-4细胞Smo mRNA 相对表达量均出现下降，并且分别与空白对照组、阴性对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，其中以48 h Smo mRNA相对表达量降低最明显；而Smo-siRNA3组Molt-4细胞Smo mRNA相对表达量与空白对照组、阴性对照组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 Smo-siRNA抑制Molt-4 T细胞增殖 转染后24，48，72 h，CCK-8法检测Smo-siRNA作用后Molt-4细胞的生长情况，见图2。结果显示：转染后24 h，Smo-siRNA1组细胞增殖受抑制，与空白对照组、阴性对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)；Smo-siRNA2，3组细胞增殖受抑制，但是与空白对照组、阴性对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；转染后48，72 h，Smo-siRNA1组细胞增殖受抑制，与空白对照组、阴性对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，其中以72 h抑制作用最明显；Smo- siRNA2，3组细胞增殖受抑制，但是与空白对照组、阴性对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 Hoechst染色检测细胞凋亡形态 转染Smo-siRNA1 72 h后，收集各组Molt-4细胞，进行Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察到均可见明显的凋亡细胞，细胞核膜完整，体积变小，核质固缩，部分细胞核发生边集、破碎、裂解。空白对照组和MOCK组细胞未见明显凋亡(图3)。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 转染Smo-siRNA1序列72 h后，收集各组细胞用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率，见图4。结果显示：Smo-siRNA1处理组细胞的凋亡明显增加，与空白对照组、MOCK组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，而空白对照组、MOCK组之间相比差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1] de Lima M, Porter DL, Battiwalla M, et al. Proceedings from the National Cancer Institute's Second International Workshop on the Biology, Prevention, and Treatment of Relapse After Hematopoietic Stem Cell Transplantation: part III. Prevention and treatment of relapse after allogeneic transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2014;20(1):4-13.

[2] 李扬秋, 刘启发. 血液肿瘤靶向治疗和免疫治疗[J]. 肿瘤防治研究,2004, 31(6):封二,335.

[3] Taipale J, Beachy PA. The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer. Nature. 2001;411(6835):349-354.

[4] Clement V, Sanchez P, de Tribolet N, et al. HEDGEHOG-GLI1 signaling regulates human glioma growth, cancer stem cell self-renewal, and tumorigenicity. Curr Biol. 2007;17(2):165-172.

[5] Stecca B, Mas C, Clement V, et al. Melanomas require HEDGEHOG-GLI signaling regulated by interactions between GLI1 and the RAS-MEK/AKT pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(14):5895-5900.

[6] Ingham PW, McMahon AP. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes Dev. 2001; 15(23):3059-3087.

[7] Tasaki A, Akiyoshi T, Koga K, et al. Immunohistochemical staining of hedgehog pathway-related proteins in human thymomas. Anticancer Res. 2005;25(6A):3697-3701.

[8] Frank-Kamenetsky M, Zhang XM, Bottega S, et al. Small-molecule modulators of Hedgehog signaling: identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists. J Biol. 2002;1(2):10.

[9] Cooper MK, Porter JA, Young KE, et al. Teratogen-mediated inhibition of target tissue response to Shh signaling. Science. 1998;280(5369):1603-1607.

[10] Fan CM, Porter JA, Chiang C, et al. Long-range sclerotome induction by sonic hedgehog: direct role of the amino-terminal cleavage product and modulation by the cyclic AMP signaling pathway. Cell. 1995;81(3):457-465.

[11] 朱华民,李扬秋. 实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病患者Shh、Smo基因的表达水[J].第三军医大学学报学报, 2014,36(3): 267-270.

[12] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408.

[13] Singh RR, Cho-Vega JH, Davuluri Y, et al. Sonic hedgehog signaling pathway is activated in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma. Cancer Res. 2009;69(6):2550-2558.

[14] Pola R, Ling LE, Silver M, et al. The morphogen Sonic hedgehog is an indirect angiogenic agent upregulating two families of angiogenic growth factors. Nat Med. 2001;7(6): 706-711.

[15] Litingtung Y, Chiang C. Specification of ventral neuron types is mediated by an antagonistic interaction between Shh and Gli3. Nat Neurosci. 2000;3(10):979-985.

[16] Goodrich LV, Scott MP. Hedgehog and patched in neural development and disease. Neuron. 1998;21(6):1243-1257.

[17] Grimm D, Kay MA. Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time. J Clin Invest. 2007;117(12): 3633-3641.

[18] Taipale J, Chen JK, Cooper MK, et al. Effects of oncogenic mutations in Smoothened and Patched can be reversed by cyclopamine. Nature. 2000;406(6799):1005-1009.

[19] Taipale J, Cooper MK, Maiti T, et al. Patched acts catalytically to suppress the activity of Smoothened. Nature. 2002;418(6900): 892-897.

引言

近年来，血液系统恶性肿瘤的发病率有升高趋势，严重危害人类的健康。如何更好提高患者的长期缓解率，是肿瘤治疗的最终目的。但是，传统的治疗方案包括放化疗，并不能很好控制疾病复发，异基因造血干细胞移植治疗在很大程度上改善了血液肿瘤的疗效，使部分患者得以长期生存，但是缺乏供者以及移植并发症等仍然制约了疾病的治疗进展。近年来，在一些具有明确肿瘤标志物的血液肿瘤中开展的靶向治疗，取得理想的效果，是血液肿瘤治疗上的一大进步^[1]。在生物学研究中，所谓的靶向治疗，是指在细胞和分子水平，针对肿瘤细胞表面或者细胞中具有特异的标志分子(靶标)，设计适当的靶向药物(包括单克隆抗体、小分子药物或基因药物)，特异地靶向肿瘤细胞后，启动肿瘤细胞死亡程序，杀伤肿瘤细胞，或者抑制肿瘤细胞特异性表达酶的活性和特异性基因表达，对肿瘤细胞的致癌作用进行破坏、封闭。在一般情况下，靶向治疗不会波及肿瘤周围的正常组织。分子靶向治疗的方法在于对生物标记物进行了标准化，用于识别某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因(基因谱)的存在^[2]。

Hedgehog信号通路是人类胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路，文献报道该信号通路在人类多种肿瘤中异常激活^[3-6]，并对这些肿瘤的生长起着促进作用。Smo基因(Smoothened)是该信号通路中的关键基因，控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递。Smo是Hedgehog信号传递所必需的受体，在无Hedgehog信号的情况下，激活Smo可导致Hedgehog靶基因的活化；Smo基因突变时，可出现与Hedgehog基因突变相同的表征^[7-10]。T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型，临床上一直存在难治疗、耐药和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要目标。

课题组研究证实，与健康对照比较，Jurkat、Molt-4细胞株中Smo基因表达水平均上调，T淋巴细胞白血病中Smo表达水平显著高于健康对照组(待发表)。本实验根据siRNA设计原理，设计并化学合成Smo-siRNA1，2，3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA(SC)，利用Nuclefector^TM核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入Molt-4细胞，并设未予任何处理的空白对照组，然后分别在转染24，48，72 h 采用qRT-PCR 检测Smo mRNA相对表达水平；采用CCK-8法检测细胞生长抑制率；流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2012年6月至2013年9月在暨南大学医学院血液病研究所完成。

1.3 材料 人T淋巴细胞白血病细胞系Molt-4株(生命科学研究院细胞资源中心，上海)。RPMI 1640培养基(GIBCO公司，USA)；胎牛血清(PAA公司，奥地利)；TRIzol 试剂(Invitrogen公司，USA)；兔抗人Smo单抗(CST公司，USA)；siRNA由Invitrogen公司进行化学合成。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 Smo-siRNA1，2，3组为实验组，分别转染Smo-siRNA1，2，3；对照组分别为转染无关干扰序列RNA的阴性对照组及未予任何处理的空白对照组。

1.4.2 细胞培养 人T淋巴细胞白血病细胞系Molt-4株接种在含体积分数10%新生牛血清、100 U/mL 链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱连续培养，两三天传代1次。

1.4.3 Smo-siRNA的设计与合成 Smo-siRNA设计遵循Invitrogen 公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth^TMRNAi设计法则由网上在线进行设计而成。

在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找Smo基因序列(ACCESSION NM_005631.4)，通过Invitrogen公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth^TM RNAi设计法则，成功地在线设计出若干条针对Smo基因mRNA上不同序列的siRNA(长度都为21 nt)，并从中再根据经验选出3条进行合成，分别将它们命名为Smo-siRNA1，2，3，其靶位点起始于Smo mRNA序列上1 221 bp，1 458 bp，1 851 bp，分别位于Smo序列不同外显子上。

根据siRNA设计原则，还设计出与Smo基因序列无同源性的阴性对照siRNA(SC)，BLAST比对后确证它们与人类基因组中的mRNA没有序列同源性。相对以前的设计方法，采用上述方法合成出来的siRNA，稳定性提高的同时还有效去除脱靶效应。设计出来的siRNA交给Invitrogen 公司进行化学合成，所合成的siRNA具有周期短、纯度高特点，对组织或细胞的毒副作用较小；由于其有容易降解的特点，将转染后24-72 h设定为检测指标时间。利用Alexa Red Oligo观察和流式细胞仪检测其荧光值(发射光波长565 nm、激发光波长555 nm)，分析细胞活力和转染效率。

1.4.4 核转染 每组单次收集2.5×10⁶个处于对数生长期的Molt-4细胞，1 100 r/min离心10 min，完全去除上清；用100 μL预热至室温的Supplement和Nucleofector^TM Solution混合液(二者比例2︰9，现配)悬浮细胞；各组分别用核转染专用的移液管加入无关干扰序列的阴性对照siRNA或1 μL siRNA1，2，3，混匀，加入核转杯，启动核酸转染仪特异性程序，依据常用指南，各组细胞转染时所选择的程序分别为C-005，转染完成后马上用移液管将转染后的细胞液接种在含体积分数10%新生牛血清、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基的培养瓶中，置于37 ℃，含体积分数为5% CO₂培养箱中培养。空白对照则直接接种于同样预处理过的培养基中。每组均增设总数为1×10⁷个Molt-4细胞的4个平行杯，转染后接种于终体积为20 mL同一培养瓶中，以保证各项检测指标所需的细胞数。

1.4.5 RNA提取、反转录和RT-PCR 总RNA使用TRIzol从Molt-4细胞中分离，cDNA通过使用Superscript Ⅱ RNA酶反转录酶试剂盒合成。

利用SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测各组Molt-4细胞Smo基因表达情况^[11]，应用于荧光实时定量PCR的引物序列见表1，以β₂M基因作为内参照。每一样本分别进行β₂M和Smo检测，应用Real Master Mix试剂盒，总反应体积为20 µL，包括终浓度为0.5 mmol/L的上、下游引物1 μL、2.5×Real Master Mix 8 μL、dH₂O 9 μL和cDNA 1 μL。经过95 ℃、1 min变性，共进行40个循环扩增后，每一循环包括95 ℃、72 ℃、62 ℃，各15 s。并在81 ℃读板(1 s)。以0.17 ℃/s变化速度从55 ℃到95 ℃，每隔2 s记录一次荧光值，并描绘熔解曲线。在Chromo 4 荧光定量PCR仪中进行反应。每样本检测均重复3次。以β₂M为内参照，利用Ct值，计算Molt-4细胞中Smo基因相对mRNA表达量，其计算公式为：相对mRNA表达量=2^-^?Ct×100%，其中，?Ct= Ct(Smo)-Ct(β₂M)^[12]。

1.4.6 Smo-siRNA 转染后各组细胞增殖抑制效应 用CCK-8法观察各组Molt-4细胞体外增殖的抑制情况。将各组转染后Molt-4细胞液接种在96孔培养板中，并设空白对照组、阴性对照组，每组设3个平行孔，每孔100 µL(含约5×10⁵ Molt-4细胞或者仅含100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素和体积分数为10%新生牛血清的RPMI1640培养基)，置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱，37 ℃条件下，常规培养24，48，72 h，分别向每孔内加入CCK-8 10 µL，37 ℃孵育2 h，然后用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，可间接反映细胞存活数量。每孔均重复测量3次。据此可计算Smo-siRNA1，2，3转染后，各时间点Molt-4细胞的增殖抑制率。

1.4.7 Smo-siRNA转染后各组细胞凋亡效应 转染Smo-siRNA1 72 h后，收集各组Molt-4细胞，进行Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态，流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率。

流式细胞仪AnnexinV/PI双染法：离心收集每组约5×10⁵个Molt-4细胞(Smo-siRNA1)，并设未加任何RNA进行空转染的转染条件对照组(MOCK组)，PBS洗涤2次，离心去上清，用Annexinv-FITC结合液195 µL重悬细胞，加入Annexinv-FITC 5 µL，避光孵育10 min，离心后去上清，再用Annexinv-FITC结合液190 µL重悬细胞，加入碘化丙啶染色液10 µL，冰浴、避光放置，进行流式细胞仪检测，用MULTCYCLE软件分析结果。

1.5 主要观察指标 ①Smo-siRNA转染后Smo在Molt-4 T细胞中表达水平；②Smo-siRNA转染后Molt-4 T细胞的增殖抑制效应；③Smo-siRNA转染后Molt-4 T细胞的凋亡效应。

1.6 统计学分析 使用SPSS 13.0统计软件进行配对t 检验和单因素方差分析。检验水准均为α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

在血液系统恶性肿瘤中T细胞肿瘤恶性度高，疗效差，易复发。如果常规方法治疗，效果欠佳，缺乏更好的针对性治疗，主要原因是很难选择到一个合适的有针对性的治疗靶点。理论上肿瘤性T细胞表达异常的分子可以帮助研发抑制T细胞肿瘤的分子靶向药物。已经有研究表明，某些类型的T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关。在一些T淋巴细胞白血病中，Smo呈高表达状态^[13-16]。为了进一步明确Hedgehog通路分子在T淋巴细胞白血病中的表达情况，以及靶向抑制该信号通路分子对T淋巴细胞白血病的抑制作用，本研究首先检测了T淋巴细胞白血病Molt-4细胞中Smo的表达特点。进一步研究通过RNA干扰技术筛选出可高效抑制肿瘤T细胞Smo表达的Smo-siRNA，希望能为今后T细胞肿瘤相关的分子靶向治疗提供一些依据。

3.1 Smo-siRNA的沉默效应分析 RNA干扰发生在转录后水平，而不是转录水平，称为转录后基因沉默^[17-19]。虽然比较普通电穿孔技术，Nuclefector^TM核转染仪有诸多优点，但是在转染过程中仍然不可避免对细胞有所损伤而产生细胞应激反应进而可能凋亡并影响Smo基因表达。另一方面，作为一种小片段双链RNA分子，也有可能对Smo基因表达产生某种非特异影响。为排除以上因素产生混淆作用，实验分组如下：Smo-siRNA1，2，3组为实验组，分别转染Smo-siRNA1，2，3，未加入任何RNA进行空转染的转染条件对照组(MOCK组)、转染无关干扰序列RNA的阴性对照组及未予任何处理的与实验同步培养的空白对照组。

实验通过Nuclefector^TM核转染仪将设计合成的Smo-siRNA分别转入Molt-4细胞筛选出对靶基因有抑制效应的Smo-siRNA。该定量RT-PCR实验表明，Smo-siRNA1可以有针对性抑制Smo mRNA的表达，抑制效果最显著。Smo-siRNA1最显著作用在转染48 h后，而转染72 h可以看到Smo mRNA表达水平有逐渐恢复趋势。这与实验是采取化学合成的siRNA，采用瞬时转染，随着细胞分裂和增殖，siRNA细胞内发挥作用越来越少，基因沉默作用越来越弱有关。也与Smo-siRNA2，3抑制Smo mRNA的作用不明显有关，或者实验中该mRNA的表达水平随着时间的推移很容易降解有关。

3.2 Smo-siRNA的生物学效应分析研究发现，Smo-siRNA1处理Molt-4细胞后48，72 h，Molt-4细胞表现出显著增殖抑制，且与对照组相比差异有显著性意义。Hoechst染色结果显示：Smo-siRNA1作用后的Molt-4细胞，细胞核膜完整，体积较小，核染色质固缩，出现胞核边集、破碎、开裂，显示凋亡形态特征。流式细胞仪用来检测细胞凋亡率，结果显示经Smo-siRNA1转染72 h，细胞凋亡率与对照组相比差异有显著性意义，说明Smo-siRNA1有促进T肿瘤细胞株(Molt-4细胞)凋亡的作用。以上结果说明Smo-siRNA1可以抑制Molt-4细胞的增殖，诱导其凋亡。

Smo对Molt-4细胞生长起到关键作用。Smo-siRNA转入T肿瘤细胞株后可以诱导细胞凋亡，因为它的序列特异性，可以特异性降解Smo mRNA，从而降低Smo蛋白水平，达到抑制Molt-4细胞生长作用。因此，实验中筛选出的Smo-siRNA1可能候选为T淋巴细胞白血病的治疗药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA：筛选和评价

Screening and evaluation of Smo-siRNA targeted to inhibition of Molt-4 cell proliferation

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.