外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0455

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 807-814.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0455

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外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响

陈忠尧，曹泽宇，黄艳，汲婧，陈晓芳

北京航空航天大学生物与医学工程学院生物力学与力生物学教育部重点实验室，北京市 100191

修回日期:2017-09-14 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 陈晓芳，博士，副教授，硕士生导师，北京航空航天大学生物与医学工程学院生物力学与力生物学教育部重点实验室，北京市 100191
作者简介:陈忠尧，男，1991年生，河北省唐山市人，汉族，北京航空航天大学生物与医学工程学院在读硕士，主要从事再生医学和用于细胞表观遗传检测的芯片实验室研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81301334)

Microenvironmental cues influence the reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells

Chen Zhong-yao, Cao Ze-yu, Huang Yan, Ji Jing, Chen Xiao-fang

Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Ministry of Education, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China

Revised:2017-09-14 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Chen Xiao-fang, Ph.D., Associate professor, Master’s supervisor, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Ministry of Education, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China
About author:Chen Zhong-yao, Master candidate, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Ministry of Education, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301334

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外环境：是细胞膜以外的溶液和固体环境，以及细胞受到的物理刺激。在体外培养条件下外环境包括培养基内的可溶性因子，基质材料的理化性质，以及对细胞施加的力、电、磁等刺激因素。
细胞重编程：是利用特定转录因子把终末分化的体细胞转变为具有全能性，类似于胚胎干细胞的诱导多能干细胞的过程。许多外环境因素包括可溶性小分子，生长因子，基质材料的硬度，表面形貌，黏附分子，细胞间连接以及力、电、磁场等多种物理刺激对此过程具有重要影响。

摘要
背景：诱导多能干细胞具有广阔的应用前景，转录因子介导的细胞重编程效率较低，不利于多能干细胞的临床应用。近年来研究发现多种微环境因素对细胞重编程有显著影响，能够有效提高重编程效率，对这些因素的总结和归纳有利于建立适合细胞重编程的培养环境，促进该技术的广泛应用。
目的：对有利于多能干细胞干性维持和提高细胞重编程效率的微环境因素进行归纳总结。
方法：由第一作者检索Web of Science数据库2006年至今有关外环境理化因素对多能干细胞干性维持和细胞重编程影响的文章，从中挑选80篇与研究目的相关性较强，质量较高的文章进行总结。
结果与结论：细胞与基质材料的黏附以及细胞间黏附不仅调控细胞的基因表达，还通过肌动蛋白骨架与核膜直接连接，影响细胞的表观遗传状态，因而可以调控细胞重编程。此外低氧、动态培养和电信号等因素也能够影响重编程效率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2058-5731(陈晓芳)

关键词: 细胞重编程, 诱导多能干细胞, 多能性, 微环境, 表面形貌, 软硬度, 培养基质, 细胞间黏附, 低氧, 电刺激, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Induced pluripotent stem cells hold enormous potential as a tool to generate cells for disease therapy and modeling. However, the lower efficiency of cell reprogramming using exogenous transcription factors limits the clinical use of induced pluripotent stem cells. Recent studies have indicated that microenvironmental cues can promote the production of pluripotent cells. Further summarization on these reports will provide new strategies to enhance the safety and efficiency of the reprogramming technology.
OBJECTIVE: To summarize the effect of microenvironmental cues on the reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells and the maintenance of pluripotency.
METHODS: Scientific papers from 2006 to present included in Web of Science were searched by the first author. Eighty papers focusing on the effect of microenvironmental cues on the reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells and the maintenance of pluripotency were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell-matrix interaction and cell-cell adhesion regulate gene expression and have effects on the epigenetic states of the chromatin through a direct connection between actin cytoskeletons and the nuclear membrane; thus, manipulation of the cell-matrix interaction and cell-cell adhesion can improve the induction of pluripotency. In addition, other environmental factors including hypoxia, dynamic culture and electrical stimulation can also promote cell reprogramming.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Induced Pluripotent Stem Cells, Electric Stimulation, Cell Hypoxia, Cell Adhesion, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈忠尧，曹泽宇，黄艳，汲婧，陈晓芳. 外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 807-814.

Chen Zhong-yao, Cao Ze-yu, Huang Yan, Ji Jing, Chen Xiao-fang. Microenvironmental cues influence the reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 807-814.

图/表（结果） 2

2.1 纳入文献基本情况 细胞处在复杂的环境中，受到可溶性因子和不可溶环境因素的共同影响。许多不同来源和不同种类的信号都作用在共同的信号通路上，比如培养基质的软硬程度和表面形貌都会影响细胞黏着斑的形成和细胞骨架的排列，以及下游的一系列信号传导过程^[6]。文章从材料和实验方法的角度对检索到的文献进行简单分类，探讨以下3个方面因素对多能干细胞干性维持和体细胞重编程过程的影响。

2.2 培养基质的理化特征 培养基质的理化特征直接影响细胞黏着斑的形成和细胞肌动蛋白骨架的排列，进而影响下游基因表达和细胞形态、贴壁、增殖、迁移和分化等一系列行为^[6]。细胞与基质间的相互作用能够对几乎所有细胞类型产生影响，包括多能干细胞。另一方面，由于细胞种类的不同、形貌特征的差别和基质材料本身理化性质的差异，导致培养基质对细胞的影响有所不同^[7]。

2.2.1 培养基质的表面微纳结构 目前应用一些成熟的加工技术，比如光刻、热压、腐蚀及合成等，能够在不同的材料表面形成几十纳米到几百微米范围的微纳结构，这些方法也用于对细胞培养基质材料进行处理^[8]。研究表明，表面粗糙度、不规则微纳颗粒、微纳纤维、不同尺寸和形状的微纳结构等都能够影响多能干细胞的自我更新和干性维持。

Jeon等在polydimethylsiloxane(PDMS)材料上加工出了粗糙度为8的表面并在其上培养小鼠胚胎干细胞。结果表明，相比于粗糙度为1的光滑PDMS材料，粗糙度为8的PDMS材料促进了小鼠胚胎干细胞的自我更新，小鼠胚胎干细胞能够在PDMS材料表面长期维持多能性，而在普通培养皿表面经过长期传代后出现随机分化。粗糙的PDMS材料表面有利于小鼠胚胎干细胞的干性维持，不利于细胞贴壁和分化^[9]。相反的，Chen等^[10]利用腐蚀的方法增加玻璃表面粗糙度，他们发现光滑的玻璃表面(粗糙度为1)更有利于人胚胎干细胞贴壁、增殖和多能性的长期维持，而粗糙的玻璃表面(粗糙度为100)会引起人胚胎干细胞分化。2篇报道中结果的差异可能与所用材料本身的差异有关，另外，小鼠胚胎干细胞与人胚胎干细胞不同，其维持干性所需条件也有很大差别。Kong等^[11]在聚苯乙烯材料上加工了不同形状的纳米柱，结果表明在没有碱性成纤维细胞生长因子的情况下，培养在具有纳米结构的基底上的人胚胎干细胞能够更好的维持干性。Bae等^[12]在聚苯乙烯材料上加工了不同直径的纳米柱(100-350 nm)，他们发现相比于光滑表面，具有纳米柱的表面不利于细胞形成稳定的黏着斑，限制了细胞迁移，增强了钙黏附蛋白E(E-cadherin)介导的细胞间连接，促进了多能性的维持。此外，微米和纳米级的纤维结构及合成的不规则颗粒结构都会影响胚胎干细胞的多能性^[13-16]。

最新的研究发现，培养基底表面形貌对重编程过程也有显著影响。Song Li研究小组在PDMS基底上加工出了宽度10 μm的沟槽，他们发现，沟槽表面能够显著提高细胞重编程的效率，如图1所示。机制研究发现沟槽结构抑制了细胞组蛋白脱乙酰激酶HDAC2活性，增强了组蛋白H3甲基转移酶亚单位WDR5的表达，进而使核小体组蛋白H3的乙酰化(AcH3)修饰以及H3上赖氨酸4的二甲基化(H3K4me2)和三甲基化(H3K4me3)修饰都显著增强，这些表观遗传的变化促进了细胞重编程。微沟槽与小分子表观遗传修饰剂valproic acid(VPA)和Tranyl-cypromine hydrochloride(TCP)作用效果类似，并且能够取代这两个小分子促进细胞的命运转变。此外，沟槽结构促进上皮相关基因的表达，增强了细胞的间质-上皮转化(mesenchynal to epithelial transition，MET)。作者还证明了微沟槽结构引起的一系列变化可能是由细胞内肌动蛋白骨架的重构以及肌动蛋白-肌球蛋白间的相互作用力引起^[17]。另有报道指出敲低丝氨酸/苏氨酸激酶Tesk1和Limk2能够降低Cofilin的磷酸化程度，去磷酸化的Cofilin与肌动蛋白骨架结合，导致其解聚，进而促进细胞重编程^[18]。对间充质干细胞的研究也表明表面形貌刺激能够直接改变细胞的表观遗传状态^[19]，而表观遗传状态对细胞重编程至关重要^[20]。

表面微纳结构也能够促进成纤维细胞向其他细胞类型的转变。Leong小组发现表面微沟槽能够促进转录因子Ascl1、Brn2和Myt1L诱导的成纤维细胞向神经细胞重编程^[21]。表面结构对神经轴突的分支数也有显著影响，在微沟槽表面轴突分支减少，而在微柱表面分支增加。轴突分支数目的变化与成纤维细胞对外界力学环境的感受有关，非肌肌球蛋白Ⅱ在其中发挥重要作用^[21]。Kim等发现具有纳米沟槽的聚氨酯丙烯酸酯表面能够有效提高转录因子Ascl1、Pitx3、Nurr1和Lmx1a介导的成纤维细胞向多巴胺神经元重编程。其分子机制是纳米沟槽引起的细胞骨架重构促进了细胞的间质-上皮转化和组蛋白H3K4me3修饰^[22]。此外，微沟槽表面促进成纤维细胞向心肌细胞方向重编程也有报道，原理是微沟槽促进组蛋白乙酰化(AcH3)修饰^[23]。这些研究说明了表面微结构引起的表观遗传变化有助于细胞克服重编程过程中的阻碍因素^[20]，进而提高重编程的效率。

2.2.2 基底的软硬程度 二维和三维培养的细胞都能够感受基底或周围基质的软硬度，并做出相应的反应以调节分化、形态、增殖和迁移等生命活动。研究表明基底硬度对胚胎干细胞的多能性有重要影响。Chowdhury 等^[24]报道小鼠胚胎干细胞能够在硬度为0.6 Pa的水凝胶上更好的维持多能性，无需在培养液中添加白血病抑制因子。软质基底上，细胞与基质之间的结合减弱，干性能够更好的维持。同样，培养在三维聚乙二醇水凝胶中的小鼠胚胎干细胞在较软的基质中具有较高的增殖和自我更新能力^[25]。与小鼠胚胎干细胞相反，人胚胎干细胞在软基底上会发生分化，而在较硬的基底上(10-25 kPa)能够较好的维持干性^[26-28]。在较硬基底上，人胚胎干细胞形成更加致密的肌动蛋白网络，细胞骨架产生的收缩力增加，E-cadherin和Oct4表达上调。小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞对基底力学性质的不同反应可能与两种细胞本身的差异有关^[29-30]。

另一方面，研究表明软基底有可能促进细胞重编程。培养在软的聚丙烯酰胺凝胶上的小鼠和人成纤维细胞，其胚胎干细胞标志基因Oct4和Nanog的表达水平比培养在硬凝胶上的同类细胞显著提高^[31]。培养在硬度较低的PDMS上的人胚胎肾细胞(HEK)形成具有碱性磷酸酶活性的细胞团，并且Oct4和Nanog表达上调，而培养在硬度更大的玻璃基底上的人胚胎肾细胞不形成细胞团，也不具有碱性磷酸酶活性。细胞团内大部分细胞的肌动蛋白骨架产生了更大的收缩力，利用细胞松弛素使骨架收缩力降低则无法形成细胞团，因此骨架收缩力与多能性标志基因的表达上调有关^[32]。此外，软基底能够提高小鼠胚胎成纤维细胞向诱导多能干细胞方向重编程的效率。小鼠胚胎成纤维细胞感染OSKM四因子后，在软基底上(100 Pa)培养1 d再转移到种有滋养层细胞的培养皿内继续培养，重编程效率提高1倍^[33]。此外，当小鼠胚胎成纤维细胞种在三维水凝胶内进行重编程时，硬度较小的水凝胶具有较高的重编程效率^[33]。

2.2.3 培养基质的化学特征 培养基质的化学特征包括其成分和表面修饰都会影响细胞的贴壁、增殖和分化等行为，特定的基质材料能够帮助胚胎干细胞和诱导多能干细胞维持干性，甚至促进体细胞向诱导多能干细胞方向重编程。早期的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞培养以及人体细胞向诱导多能干细胞方向重编程，需要利用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养细胞或者在培养皿上包被一层Matrigel(一种由小鼠肉瘤细胞产生的细胞外基质)，这些培养方法引入了动物来源的物质，存在安全性和稳定性等问题，无法满足临床应用和大规模工业生产的需求，因此许多研究探索利用合成材料或者细胞外基质蛋白替代滋养细胞和Matrigel。多个研究小组采用细胞微阵列的方法，将几百或上千种待测物质点在玻片上，观察人多能干细胞在这些物质上的生长状况^[34-37]，筛选出了多种能够支持人多能干细胞贴壁和干性维持的高分子聚合物以及细胞外基质蛋白^[38]。基于这些研究成果，利用成分确定的且无动物来源的物质进行人多能干细胞的培养技术已经广泛应用^[2-3]。除了支持人多能干细胞生长，很多合成材料比如poly2-(methacryloyloxy) ethyl dimethyl-(3-sulfopropyl) ammonium hydroxide (PMEDSAH)^[39]、聚多巴胺等^[40]，以及细胞外基质蛋白比如玻连蛋白(Vitronectin)^[41-42]、层连蛋白(Laminin)^[43-44]、胶原蛋白(Collagen)等还能够支持人体细胞向诱导多能干细胞方向重编程^[45]。然而在这些报道中，基质材料都是与特定的培养液成分配合使用，基质材料本身能否加快重编程过程，提高重编程效率还有待研究。

特殊的培养基质材料改变重编程过程、影响重编程效率的报道目前还不多见。Yoo等^[46]发现石墨烯能够促进小鼠成纤维细胞向诱导多能干细胞方向重编程，在石墨烯材料上，具有碱性磷酸酶活性和表达Oct4-GFP的克隆数量相比玻璃基底都有显著提高，并且内源的胚胎干细胞标志基因Oct4，Nanog，Sox2和Esrrb的表达都明显上调。石墨烯促进了小鼠成纤维细胞的间质-上皮转化，提高了组蛋白H3K4me3修饰，进而促进细胞重编程。Chang等^[47]发现，从幼年小鼠尾部提取的胶原蛋白能够使年长小鼠的成纤维细胞表现出与幼年小鼠细胞类似的活力，增殖速度提高，凋亡降低，并且重编程为诱导多能干细胞的效率也显著提高。此外，Smith等^[48]发现，接枝Laminin的PEG材料能够提高小鼠成纤维细胞向心肌细胞重编程的效率。

2.3 细胞间黏附 细胞间黏附对于多能干细胞生存和干性维持有非常重要的作用，由于细胞间相互黏附，多能干细胞形成紧密的克隆。人胚胎干细胞具有上皮细胞的特点，具有细胞极性、E-cadherin介导的细胞间黏附和integrin介导的细胞-基质间黏附等特征。当上皮结构被破坏后，上皮细胞通常会启动凋亡程序^[49]。人胚胎干细胞处于克隆生长时，细胞黏附和肌动蛋白-肌球蛋白引起的收缩达到平衡，维持着稳定的形态和功能^[50]，当单个人胚胎干细胞无法与其他细胞接触时，肌动蛋白-肌球蛋白的过度收缩会引起细胞凋亡。在传代过程中，通常利用温和的蛋白质水解酶比如Accutase或者是机械力将人胚胎干细胞分散成小团以保护细胞间黏附，避免凋亡。Rho相关激酶(ROCK)抑制剂Y-27632能够减弱肌动蛋白-肌球蛋白之间的收缩，避免肌动蛋白-肌球蛋白的过度收缩引起的细胞凋亡^[51-52]。E-cadherin是维持细胞间黏附的最主要分子，当人胚胎干细胞过表达E-cadherin或者在培养基底表面修饰E-cad能够显著增强单个人胚胎干细胞存活和形成克隆的能力^[53-54]。胚胎干细胞存在两种多能性状态，即原始态多能性和始发态多能性^[30]。小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的形态及维持多能性所需的信号分子有很大差别，通常认为小鼠胚胎干细胞处于原始态多能性，需要白细胞介素来维持其未分化状态；而人胚胎干细胞处于始发态多能性，需要碱性成纤维细胞生长因子来维持自我更新。细胞间黏附对维持两种细胞多能态都有重要作用，对于原始态小鼠胚胎干细胞，细胞间黏附能够稳定白细胞介素受体，维持细胞对白细胞介素的敏感性，破坏细胞间黏附会使原始态小鼠胚胎干细胞转变为始发态小鼠胚胎干细胞。而对于始发态小鼠胚胎干细胞，破坏细胞间黏附会引起细胞分化^[55]。

在成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的过程中，细胞间黏附发挥着关键作用。重编程初始阶段会发生间质-上皮转化，E-cadherin表达升高和细胞间黏附增强^[56-57]。

间质-上皮转化是重编程过程中的重要环节，许多促进间质-上皮转化的分子比如BMP、miR-200和Tets等能够提高重编程效率^[56^，^58]，上皮细胞重编程成功率明显优于成纤维细胞^[59]，而抑制间质-上皮转化的分子比如转化生长因子β则阻碍重编程^[57]。实时动态成像证明细胞间黏附在重编程早期就能够观察到，并且相互黏附的细胞团大多数最终形成了Oct4-EGFP阳性的诱导多能干细胞克隆^[60]。E-cadherin是介导细胞间黏附的主要分子，降低E-cadherin表达明显阻碍重编程，而增强E-cadherin表达则显著提高重编程效率^[61]，甚至可以取代四因子中的Oct4。另有研究发现，ESKM诱导的诱导多能干细胞和OSKM诱导的诱导多能干细胞其功能和基因表达都非常类似^[62]，用多肽或抗体破坏E-cadherin介导的细胞间黏附显著降低重编程效率^[61]。值得一提的是，N-cad能够替代E-cadherin重新建立细胞间黏附并恢复细胞重编程能力^[63]，这些研究说明细胞间黏附，而并非某种特定的钙黏素(cadherin)分子是成纤维细胞转变为诱导多能干细胞过程中必不可少的关键因素。

另一方面，增强细胞间黏附有助于分化细胞获得干细胞特征，达到重编程的效果。在低吸附表面或者悬浮培养条件下，细胞团聚成三维小球，细胞间黏附增强。聚团培养的RT4膀胱癌细胞系表现出肿瘤干细胞的特点，具有更强的成瘤和转移能力。Hek293细胞团则表现出肾祖细胞和一些胚胎干细胞的特征，比如碱性磷酸酶活性，Oct4、Nanog等基因的高表达和体内成瘤能力^[64]。对成纤维细胞进行成团培养，能够促进间质-上皮转化转化，并引起Oct4启动子区域的去甲基化和Oct4的表达。尽管当细胞重新被接种在培养皿上平面培养时，Oct4启动子区域再次被甲基化，其表达也被抑制，但是细胞仍然表达一些成体干细胞相关基因^[65]。在小鼠胚胎干细胞培养基中培养的小鼠成纤维细胞团表现出神经祖细胞的特征，表达神经祖细胞相关因子Sox2、Pax6等，并且能够分化成神经元和胶质细胞^[66]。三维成团培养的人成纤维细胞也能够在无外源基因物质的条件下重编程为神经祖细胞^[67]。对小鼠睫状体上皮细胞进行短期的成团培养，能够使其表达视网膜前体细胞基因，并在只导入一个外源转录因子Oct4的情况下重编程为诱导多能干细胞^[68]。此外，在PEG水凝胶内进行三维重编程，增强了细胞间黏附，促进了间质-上皮转化，并且提高了组蛋白H3K4me3修饰，促进干性相关基因的表达，重编程效率比二维条件下显著提高^[33]。该研究表明，与表面微沟槽类似，增强细胞间黏附也能够提高细胞的可塑性，促进细胞命运转变。

2.4 其他理化因素

2.4.1 低氧环境 胚胎发育处在低氧环境中(体积分数为1.5%-5.3% O₂)，低氧环境下(体积分数为5% O₂)培养的人胚胎干细胞相比常氧环境(体积分数为21% O₂)干性维持更好，自发分化减少，并且更容易形成拟胚体^[69]。低氧对小鼠胚胎干细胞克隆生长也有促进作用，尽管目前报道的研究结果仍有一些矛盾^[70]。低氧环境还有利于造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞的自我更新^[71]。Yamanaka实验室证明低氧环境(体积分数为5% O₂)能够使人和小鼠体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率提高3倍以上，而且可以取代转录因子Sox2和c-Myc，实现二因子重编程。转染了OSKM四因子的小鼠胚胎成纤维细胞在低氧环境下，基因表达向小鼠胚胎干细胞方向转变^[72]。Mathieu等^[73]把发生随机分化的人胚胎干细胞置于体积分数为2% O₂的培养条件下，细胞能够重新恢复多能性。另有研究表明低氧对成纤维细胞重编程为神经祖细胞和类心肌细胞也有促进作用^[74-75]。这些研究表明，氧气体积分数对多能干细胞自我更新以及体细胞重编程具有调控作用，尽管其分子机制还有待进一步研究。

2.4.2 动态培养 Junren等发现，旋转振荡能够显著提高重编程效率，其原因是液体的对流促进营养物质和细胞因子等的交换，而并非流体剪切力的作用。重编程中期，当细胞过于密集时p57表达提高，抑制细胞增殖和重编程，旋转振荡降低了p57的表达，克服了接触抑制引起的细胞老化，这说明处在重编程过程中的部分细胞能够分泌某些有助于克服细胞老化和凋亡的因子^[76]。与这一现象一致的是频繁换液降低重编程效率，而在体积微小的微流管道内重编程效率显著提高^[77]。

2.4.3 电磁场 Baek等^[78]发现50 Hz、1 mT的低频磁场能够使四因子重编程效率提高30倍，而且只需要Oct4一个转录因子就可以成功重编程。磁场作用下，细胞增殖速度加快，组蛋白赖氨酸甲基转移酶MLL2表达增加，Oct4，Nanog，Esrrb等干性相关基因的组蛋白H3K4me3修饰水平提高。Jin等^[79]发现280 nA、1 Hz电信号促进转录因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向神经元重编程。

外环境因素影响细胞重编程重要文献如表1所示。

参考文献

[1] Yamanaka S, Takahashi K. Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblast cultures. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 2006;51(15):2346-2351.

[2] Takahashi K, Yamanaka S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17(3):183-193.

[3] Theunissen TW, Jaenisch R. Molecular control of induced pluripotency. Cell Stem Cell. 2014;14(6):720-734.

[4] Lin J, Li MR, Ti DD, et al. Microenvironment-evoked cell lineage conversion: Shifting the focus from internal reprogramming to external forcing. Ageing Res Rev. 2013; 12(1):29-38.

[5] Dingal PC, Discher DE. Combining insoluble and soluble factors to steer stem cell fate. Nat Mater. 2014;13(6):532-537.

[6] Crowder SW, Leonardo V, Whittaker T, et al. Material Cues as Potent Regulators of Epigenetics and Stem Cell Function. Cell Stem Cell. 2016;18(1):39-52.

[7] Mashinchian O, Turner LA, Dalby MJ, et al. Regulation of stem cell fate by nanomaterial substrates. Nanomedicine (Lond). 2015;10(5):829-847.

[8] Bettinger CJ, Langer R, Borenstein JT. Engineering substrate topography at the micro-and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(30):5406-5415.

[9] Jeon K, Oh HJ, Lim H, et al. Self-renewal of embryonic stem cells through culture on nanopattern polydimethylsiloxane substrate. Biomaterials. 2012;33(21):5206-5220.

[10] Chen W, Villa-Diaz LG, Sun Y, et al. Nanotopography influences adhesion, spreading, and self-renewal of human embryonic stem cells. ACS Nano. 2012;6(5):4094-4103.

[11] Kong YP, Tu CH, Donovan PJ, et al. Expression of Oct4 in human embryonic stem cells is dependent on nanotopographical configuration. Acta Biomater. 2013; 9(5):6369-6380.

[12] Bae D, Moon SH, Park BG, et al. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 2014;35(3): 916-928.

[13] Nur-E-Kamal A, Ahmed I, Kamal J, et al. Three-dimensional nanofibrillar surfaces promote self-renewal in mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 2006;24(2):426-433.

[14] Carlson AL, Florek CA, Kim JJ, et al. Microfibrous substrate geometry as a critical trigger for organization, self-renewal, and differentiation of human embryonic stem cells within synthetic 3-dimensional microenvironments. FASEB J. 2012;26(8):3240-3251.

[15] Lyu Z, Wang H, Wang Y, et al. Maintaining the pluripotency of mouse embryonic stem cells on gold nanoparticle layers with nanoscale but not microscale surface roughness. Nanoscale. 2014;6(12):6959-6969.

[16] Jaggy M, Zhang P, Greiner AM, et al. Hierarchical Micro-Nano Surface Topography Promotes Long-Term Maintenance of Undifferentiated Mouse Embryonic Stem Cells. Nano Lett. 2015;15(10):7146-7154.

[17] Downing TL, Soto J, Morez C, et al. Biophysical regulation of epigenetic state and cell reprogramming. Nat Mater. 2013; 12(12): 1154-1162.

[18] Sakurai K, Talukdar I, Patil VS, et al. Kinome-wide functional analysis highlights the role of cytoskeletal remodeling in somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 2014;14(4):523-534.

[19] Li Y, Chu JS, Kurpinski K, et al. Biophysical regulation of histone acetylation in mesenchymal stem cells. Biophys J. 2011;100(8): 1902-1909.

[20] Pasque V, Jullien J, Miyamoto K, et al. Epigenetic factors influencing resistance to nuclear reprogramming. Trends Genet. 2011;27(12):516-525.

[21] Kulangara K, Adler AF, Wang H, et al. The effect of substrate topography on direct reprogramming of fibroblasts to induced neurons. Biomaterials. 2014;35(20):5327-5336.

[22] Yoo J, Noh M, Kim H, et al. Nanogrooved substrate promotes direct lineage reprogramming of fibroblasts to functional induced dopaminergic neurons. Biomaterials. 2015;45:36-45.

[23] Morez C, Noseda M, Paiva MA, et al. Enhanced efficiency of genetic programming toward cardiomyocyte creation through topographical cues. Biomaterials. 2015;70:94-104.

[24] Chowdhury F, Li Y, Poh YC, et al. Soft substrates promote homogeneous self-renewal of embryonic stem cells via downregulating cell-matrix tractions. PLoS One. 2010;5(12): e15655.

[25] Ranga A, Gobaa S, Okawa Y, et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nat Commun. 2014;5:4324.

[26] Keung AJ, Asuri P, Kumar S, et al. Soft microenvironments promote the early neurogenic differentiation but not self-renewal of human pluripotent stem cells. Integr Biol (Camb). 2012;4(9): 1049-1058.

[27] Musah S, Morin SA, Wrighton PJ, et al. Glycosaminoglycan- binding hydrogels enable mechanical control of human pluripotent stem cell self-renewal. ACS Nano. 2012;6(11): 10168-10177.

[28] Higuchi A, Kao SH, Ling QD, et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 2015;5:18136.

[29] Koestenbauer S, Zech NH, Juch H, et al. Embryonic stem cells: similarities and differences between human and murine embryonic stem cells. Am J Reprod Immunol 2006;55(3): 169-180.

[30] Weinberger L, Ayyash M, Novershtern N, et al. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17(3):155-169.

[31] Higuchi S, Watanabe TM, Kawauchi K, et al. Culturing of mouse and human cells on soft substrates promote the expression of stem cell markers. J Biosci Bioeng. 2014; 117(6):749-755.

[32] Guo J, Wang Y, Sachs F, et al. Actin stress in cell reprogramming. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(49): E5252-5261.

[33] Choi B, Park KS, Kim JH, et al. Stiffness of Hydrogels Regulates Cellular Reprogramming Efficiency Through Mesenchymal-to-Epithelial Transition and Stemness Markers. Macromol Biosci. 2016;16(2):199-206.

[34] Zonca MR Jr, Yune PS, Heldt CL, et al. High-throughput screening of substrate chemistry for embryonic stem cell attachment, expansion, and maintaining pluripotency. Macromol Biosci. 2013;13(2):177-190.

[35] Anderson DG, Levenberg S, Langer R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2004;22(7):863-866.

[36] Mei Y, Saha K, Bogatyrev SR, et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 2010;9(9):768-778.

[37] Brafman DA, Shah KD, Fellner T, et al. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 2009;18(8):1141-1154.

[38] Joddar B, Ito Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 2013; 168(2):218-228.

[39] Villa-Diaz LG, Kim JK, Lahann J, et al. Derivation and long-term culture of transgene-free human induced pluripotent stem cells on synthetic substrates. Stem Cells Transl Med. 2014;3(12):1410-1417.

[40] Zhou P, Wu F, Zhou T, et al. Simple and versatile synthetic polydopamine-based surface supports reprogramming of human somatic cells and long-term self-renewal of human pluripotent stem cells under defined conditions. Biomaterials. 2016;87:1-17.

[41] Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 2011;8(5):424-429.

[42] Kim HT, Lee KI, Kim DW, et al. An ECM-based culture system for the generation and maintenance of xeno-free human iPS cells. Biomaterials. 2013;34(4):1041-1050.

[43] Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014;4:3594.

[44] Lu HF, Chai C, Lim TC, et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 2014;35(9):2816-2826.

[45] Yamasaki S, Taguchi Y, Shimamoto A, et al. Generation of human induced pluripotent stem (Ips) cells in serum- and feeder-free defined culture and TGF-Β1 regulation of pluripotency. PLoS One. 2014;9(1):e87151.

[46] Yoo J, Kim J, Baek S, et al. Cell reprogramming into the pluripotent state using graphene based substrates. Biomaterials. 2014;35(29):8321-8329.

[47] Chang BS, Choi YJ, Kim JH. Collagen complexes increase the efficiency of iPS cells generated using fibroblasts from adult mice. J Reprod Dev. 2015;61(2):145-153.

[48] Smith AW, Hoyne JD, Nguyen PK, et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to cardiomyocyte-like cells using Yamanaka factors on engineered poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels. Biomaterials. 2013;34(28):6559-6571.

[49] Phadnis SM, Loewke NO, Dimov IK, et al. Dynamic and social behaviors of human pluripotent stem cells. Sci Rep. 2015;5: 14209.

[50] Lecuit T, Lenne PF. Cell surface mechanics and the control of cell shape, tissue patterns and morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(8):633-644.

[51] Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2007;25(6):681-686.

[52] Chen G, Hou Z, Gulbranson DR, et al. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2010;7(2):240-248.

[53] Li L, Wang BH, Wang S, et al. Individual cell movement, asymmetric colony expansion, rho-associated kinase, and E-cadherin impact the clonogenicity of human embryonic stem cells. Biophys J. 2010;98(11):2442-2451.

[54] Rodin S, Antonsson L, Niaudet C, et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 2014;5:3195.

[55] Pieters T, van Roy F. Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology. J Cell Sci. 2014;127(Pt 12): 2603-2613.

[56] Samavarchi-Tehrani P, Golipour A, David L, et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 2010;7(1):64-77.

[57] Li R, Liang J, Ni S, et al. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 2010;7(1):51-63.

[58] Hu X, Zhang L, Mao SQ, et al. Tet and TDG mediate DNA demethylation essential for mesenchymal-to-epithelial transition in somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 2014;14(4):512-522.

[59] Shu X, Pei D. The function and regulation of mesenchymal-to-epithelial transition in somatic cell reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 2014;28:32-37.

[60] Megyola CM, Gao Y, Teixeira AM, et al. Dynamic migration and cell-cell interactions of early reprogramming revealed by high-resolution time-lapse imaging. Stem Cells. 2013;31(5): 895-905.

[61] Chen T, Yuan D, Wei B, et al. E-cadherin-mediated cell-cell contact is critical for induced pluripotent stem cell generation. Stem Cells. 2010;28(8):1315-1325.

[62] Redmer T, Diecke S, Grigoryan T, et al. E-cadherin is crucial for embryonic stem cell pluripotency and can replace OCT4 during somatic cell reprogramming. EMBO Rep. 2011;12(7): 720-726.

[63] Bedzhov I, Alotaibi H, Basilicata MF, et al. Adhesion, but not a specific cadherin code, is indispensable for ES cell and induced pluripotency. Stem Cell Res. 2013;11(3):1250-1263.

[64] Su G, Zhao Y, Wei J, et al. The effect of forced growth of cells into 3D spheres using low attachment surfaces on the acquisition of stemness properties. Biomaterials. 2013;34(13): 3215-3222.

[65] Liu Y, Mukhopadhyay P, Pisano MM, et al. Repression of Zeb1 and hypoxia cause sequential mesenchymal-to- epithelial transition and induction of aid, Oct4, and Dnmt1, leading to immortalization and multipotential reprogramming of fibroblasts in spheres. Stem Cells. 2013;31(7):1350-1362.

[66] Su G, Zhao Y, Wei J, et al. Direct conversion of fibroblasts into neural progenitor-like cells by forced growth into 3D spheres on low attachment surfaces. Biomaterials. 2013;34(24): 5897-5906.

[67] Mirakhori F, Zeynali B, Rassouli H, et al. Induction of Neural Progenitor-Like Cells from Human Fibroblasts via a Genetic Material-Free Approach. PLoS One. 2015;10(8):e0135479.

[68] Ni A, Wu MJ, Chavala SH. Sphere formation permits Oct4 reprogramming of ciliary body epithelial cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 2014;23(24): 3065-3071.

[69] Ezashi T, Das P, Roberts RM. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(13):4783-4788.

[70] Hammoud AA, Kirstein N, Mournetas V, et al. Murine Embryonic Stem Cell Plasticity Is Regulated through Klf5 and Maintained by Metalloproteinase MMP1 and Hypoxia. PLoS One. 2016;11(1):e0146281.

[71] Hawkins KE, Sharp TV, McKay TR. The role of hypoxia in stem cell potency and differentiation. Regen Med. 2013; 8(6): 771-782.

[72] Yoshida Y, Takahashi K, Okita K, et al. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2009;5(3):237-241.

[73] Mathieu J, Zhang Z, Nelson A, et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 2013;31(9): 1737-1748.

[74] Cheng L, Hu W, Qiu B, et al. Generation of neural progenitor cells by chemical cocktails and hypoxia. Cell Res. 2014;24(6): 665-679.

[75] Wang Y, Shi S, Liu H, et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cell Reprogram. 2016;18(1):1-7.

[76] Sia J, Sun R, Chu J, et al. Dynamic culture improves cell reprogramming efficiency. Biomaterials. 2016;92:36-45.

[77] Luni C, Giulitti S, Serena E, et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 2016;13(5): 446-452.

[78] Baek S, Quan X, Kim S, et al. Electromagnetic fields mediate efficient cell reprogramming into a pluripotent state. ACS Nano. 2014;8(10):10125-10138.

[79] Jin Y, Seo J, Lee JS, et al. Triboelectric Nanogenerator Accelerates Highly Efficient Nonviral Direct Conversion and In Vivo Reprogramming of Fibroblasts to Functional Neuronal Cells. Adv Mater. 2016;28(34):7365-7374.

[80] Tajik A, Zhang Y, Wei F, et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nat Mater. 2016; 15(12):1287-1296.

引言

自2006年日本科学家Yamanaka报道通过外源表达4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(并称为OSKM因子)能够将体细胞重编程为类似于胚胎干细胞的诱导多能干细胞以来^[1]，该技术得到了广泛的关注。科学家们预期在再生医学、疾病模型、药物筛选和基础生命科学等领域具有广阔的应用前景，然而由于安全性等问题，该技术还无法进行临床应用。Yamanaka在最初的报道中采用反转录病毒将4个转录因子导入体细胞，该方法虽然能够使外源转录因子稳定表达，但是因为外源基因随机插入细胞基因组，具有较大的安全隐患，因此无法应用于临床。在随后的几年里，许多研究小组报道了非插入方法，利用人工合成mRNA、人工合成转录因子蛋白、仙台病毒、腺病毒、质粒载体及转座子等方法将OSKM因子转入细胞中，但不会插入基因组^[2]。不依赖转录因子的重编程将进一步提高该技术的安全性。

此外，细胞重编程还存在效率低的问题，在最初的报道中，能够转变为诱导多能干细胞的细胞不足0.1%。为了提高重编程效率，许多科学家将目标集中在寻找能够调控重编程重要信号通路的生物分子和化合物上，并且找到了许多能够提高重编程效率的分子^[3-4]。除了可溶性分子，干细胞的命运也受到其他环境因素的影响，比如培养基质的理化性质和细胞间相互作用等因素都能够影响多能干细胞自我更新与分化^[5]。近年来研究发现，这些外环境理化因素也能够对细胞重编程过程产生影响。通过对这些因素进行系统和全面的分析，有助于建立促进细胞重编程的胞外环境，进而提高重编程效率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

讨论

诱导多能干细胞在再生医学、疾病模型、药物筛选、生命科学研究等领域具有广阔的应用前景，建立安全高效的重编程技术是使其未来能够广泛应用的前提条件，也是诱导多能干细胞研究的热点之一。细胞处在复杂的外环境中，环境因素能够调控细胞的形态、增殖、迁移和分化等重要生命活动。近年来许多研究发现外环境因素影响多能干细胞的干性维持和自我更新，因此这些因素也可能对体细胞重编程为诱导多能干细胞的过程具有调控作用。围绕着这一问题，作者进行了文献检索，发现培养基质理化性质、细胞间黏附、氧气体积分数和电磁信号等都条件对细胞重编程和干性维持有显著影响。对这些环境因素的系统研究和分析将为改进重编程技术，建立安全有效的重编程方法提供依据。

细胞通过整合素黏附在培养基质表面，基质表面形貌、软硬度和成分都调控黏着斑的形成。细胞之间通过钙黏素相互连接，整合素和钙黏素又通过肌动蛋白骨架与核膜相连。最新研究表明，细胞骨架产生的收缩力直接改变染色质结构，调控基因表达^[80]。然而何种骨架结构能够促进重编程目前仍无定论，有文献报道利用微沟槽结构使细胞核拉长能够提高重编程效率，也有报道证明减少细胞与基质黏附，增强细胞间黏附能够提高多能性标志基因的表达，还有报道指出抑制肌动蛋白骨架聚合能够促进重编程。对这一问题的后续研究将有助于揭示重编程机制，促进诱导多能干细胞的进一步应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响

Microenvironmental cues influence the reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[11]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[12]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[13]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[14]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[15]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.