三种培养基对人尿源性干细胞生长和增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0442

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 723-728.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0442

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

三种培养基对人尿源性干细胞生长和增殖的影响

哈木拉提•吐送¹，赵长辉¹，买买提艾力•买托合提²，马军¹，王峰¹，木拉提•热夏提¹

¹新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；²和田地区人民医院急诊科，新疆维吾尔自治区和田市 848000

修回日期:2017-09-18 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 木拉提?热夏提，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:哈木拉提?吐送，男，1983年生，维吾尔族，2017年新疆医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事泌尿系结石及肿瘤等研究
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金项目(81760123)

Growth and proliferation of human urine derived stem cells in three kinds of culture media

Hamulati Tusong¹, Zhao Chang-hui¹, Maimaitiaili Maituoheti², Ma Jun¹, Wang Feng¹, Mulati Rexiati¹

¹Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Emergency, People’s Hospital of Hotan Area, Hetian 848000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2017-09-18 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Mulati Rexiati, M.D., Associate chief physician, Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Hamulati Tusong, M.D., Attending physician, Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Regional Science Foundation of the National Natural Science Foundation of China, No. 8176012

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
尿源性细胞培养基：是由角质细胞无血清培养基和祖细胞培养基以等比例混合而成。含多种营养添加物，如细胞生长因子、牛脑垂体提取物、胰岛素、微量元素等，营养成分丰富，能够明显促进尿源性干细胞快速生长和增殖。
表皮生长因子：通过与细胞表面的表皮生长因子受体结合而起作用。与表皮生长因子受体的高亲和力结合，激发受体内酪氨酸激酶的活性，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，糖酵解与蛋白质合成增加，某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达增加，最终导致DNA合成和细胞增殖。

摘要
背景：人尿源性干细胞研究较少，目前尚无稳定高效的培养方法。
目的：比较3种培养基对人尿源性干细胞生长和增殖的影响，优化其培养方法。
方法：离心、提纯尿液获取人尿源性干细胞，利用贴壁法分别在角质细胞无血清培养基、祖细胞培养基以及尿源性细胞培养基(角质细胞无血清培养基和祖细胞培养基以等比例混合而成)进行培养，观察细胞生长状态，MTT法检测细胞增殖情况，绘制生长曲线。
结果与结论：3种培养基均能够培养出尿源性干细胞，尿源性干细胞在角质细胞无血清培养基中缓慢生长，在祖细胞培养基中生长较快，在尿源性细胞培养基中生长最好。结果表明，尿源性细胞培养基为人尿源性干细胞最佳生长培养基，能够快速、高效的培养出人尿源性干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9535-0243(哈木拉提•吐送)

关键词: 人尿源性干细胞, 角质细胞无血清培养基, 祖细胞培养基, 干细胞, 细胞培养, 生长, 增殖

Abstract:

BACKGROUND: Little is reported on human urine derived stem cells, and there is still no stable and efficient culture method until now.
OBJECTIVE: To compare the effects of three kinds of culture media on the growth and proliferation of human urine derived stem cells, and to optimize the culture methods.
METHODS: Human urine derived stem cells were isolated and purified using centrifugation method, and then cultured using adherent method in keratinocyte serum-free medium, progenitor cell culture medium, and urinary
cell culture medium (equal-proportion mixture of keratinocyte serum-free medium and progenitor cell culture medium). Cell morphology was observed, and cell proliferation was detected by MTT method to draw a cell growth curve.
RESULTS AND CONCLUSION: Human urine derived stem cells could be successfully cultured in these three kinds of culture media, which grew slowly in the keratinocyte serum-free medium, grew rapidly in the progenitor cell culture medium, and grew best in the urinary cell culture medium. To conclude, the urinary cell culture medium which can rapidly and efficiently culture target cells is the best choice for the growth of human urine derived stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Urine, Culture Media, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

哈木拉提•吐送，赵长辉，买买提艾力•买托合提，马军，王峰，木拉提•热夏提. 三种培养基对人尿源性干细胞生长和增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 723-728.

Hamulati Tusong, Zhao Chang-hui, Maimaitiaili Maituoheti, Ma Jun, Wang Feng, Mulati Rexiati. Growth and proliferation of human urine derived stem cells in three kinds of culture media[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 723-728.

图/表（结果） 1

2.1 人尿源性干细胞呈贴壁生长状态 用角质细胞无血清培养基培养的干细胞数量较少，视野中可见部分干细胞贴壁，部分没有贴壁，透明度较高，细胞呈短梭形或圆形，排列紧密，仅在第3，4天开始细胞数量略有升高，见图1A，B。

用祖细胞培养基培养1-3 d的尿源性干细胞与角质细胞无血清培养基无明显差别，仅有少量短梭形细胞，折光性较好，生长缓慢，细胞活力不强，第4，5天，大部分细胞贴壁生长，只有少量细胞悬浮，细胞开始增殖明显，速度较快，集落缓慢形成并增多，透光性也逐渐变低，见图1C，D。

在尿源性细胞培养基中培养的干细胞形态均一，轮廓清晰，呈短梭形或圆形，贴壁生长，3 d后细胞开始缓慢增殖，散落在6孔板内，细胞透亮度较好，排列相对紧密，随着培养时间的增加，培养基内集落数量也随之增多，在培养第3，4天，细胞开始迅速增殖，呈纺锤形，到第8，9天，培养基内细胞明显增多，漩涡状生长，占培养孔80%-90%，此时对其进行传代培养，得到第1代人尿源性干细胞，细胞增殖迅速。经多代增殖，细胞形态未见明显变化，见图1E，F。

2.2 三种培养基培养的尿源性干细胞的生长曲线 见图2。

角质细胞无血清培养基组细胞在第1，2天生长缓慢，第3-5天开始加速生长，第6-8天后生长渐趋缓慢。

祖细胞培养基组细胞生长较角质细胞无血清培养基组好，在第1，2天生长缓慢，第3，4天开始进入对数生长阶段，第5，6天生长较快，第7，8天呈现平台生长。

尿源性细胞培养基组较前两组生长快而好，曲线大致呈“S”形，分别从培养开始经历缓慢生长、对数生长、平台生长与衰退4个阶段，细胞在最初1-3 d缓慢生长，在4-6 d后细胞开始大量增殖，呈对数生长状态。生长至第6天后，细胞生长与衰亡的细胞大致相等，此时细胞生长进入平台期。

2.3 人尿源性干细胞的鉴定结果 尿源性细胞培养基培养尿液离心得到的沉渣，六七天开始出现细胞，细胞生长状态良好，生长迅速，形态大小相对均一，呈梭状，排列紧密。培养11 d后，细胞排列紧密，见图3。

第4代尿源性干细胞经尿源性细胞培养基培养后加入荧光标记的CD29、CD44单克隆抗体，进行流式细胞仪检测，结果显示CD29、CD44抗体呈强阳性，阳性表达率分别为99.2%、98.4%，见图4。

经成脂诱导后细胞内逐渐出现脂滴，脂滴散在分布，部分脂滴融合成较大脂滴，油红O染色后逐渐呈现红色；经成骨诱导后逐渐出现颗粒状分布的钙化结节，茜素红染色后呈红色。证明人尿源性干细胞有向成脂、成骨诱导分化的能力，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至8月在新疆医科大学第一附属医院科技楼细胞实验室完成。

1.3 材料 角质细胞无血清培养液(KSFM)、DMEM培养液、Ham’s F-12培养液、PBS、青链霉素、体积分数为10%胎牛血清、牛脑垂体提取物(BPE)、L-谷氨酰胺、祖细胞培养液(Gibco公司)；氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲腺原氨酸、表皮生长因子、腺嘌呤(Sigma公司)。

1.3.1 角质细胞无血清培养基的配制 角质细胞无血清培养液中添加5 μg/L表皮生长因子，50 μg/L牛脑垂体提取物，1%青链霉素，1% L-谷氨酰胺。

1.3.2 祖细胞培养基的配制 75%DMEM，25%Ham’s F-12培养液，体积分数为10%胎牛血清，0.4 mg/L氢化可的松，10 μg/L胰岛素，5 mg/L转铁蛋白，2×10^-⁹ mol/L三碘甲腺原氨酸，10 μg/L表皮生长因子，1.8×10^-⁴ mol/L腺嘌呤，1%青链霉素，1% L-谷氨酰胺。

1.3.3 尿源性细胞培养基的配制^[19-20] 角质细胞无血清培养液和祖细胞培养液以1︰1比例混合而成。

1.4 实验方法

1.4.1 人尿源性干细胞在3种培养基下生长情况 收集健康成人中段晨尿600 mL(已签署知情同意书)，分为3组，每组200 mL，放入50 mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃掉上清液，得到沉渣，将沉渣加入PBS混悬，再次置入离心机中离心，弃上清，分别用角质细胞无血清培养基、祖细胞培养基以及尿源性细胞培养基重新混悬尿源性干细胞，用移液枪移入6孔板中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，24 h后观察细胞贴壁情况，以后每3 d换培养基1次，倒置显微镜下观察细胞生长状态并拍照留存图像，待细胞生长至80%-90%时传代培养^[19-23]。取生长密度80%-90%的细胞，以1︰3比例进行传代接种，首先吸弃旧的培养基，加入PBS冲洗，吸弃PBS，加入0.25%胰酶消化，荧光倒置显微镜下观察细胞缩短变圆、折光度增加、细胞充分悬浮起来时终止消化，离心机中离心，重新加入尿源性干细胞培养基进行培养。

1.4.2 人尿源性干细胞生长曲线 取生长状态良好的原代人尿源性干细胞，PBS冲洗，加入0.25%胰酶进行消化，控制消化时间，观察细胞形态变化，当细胞缩短变圆、充分悬浮起来后终止消化，以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于96孔板中，分为3组，分别用角质细胞无血清培养基、祖细胞培养基以及尿源性细胞培养基培养，置入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内，每日换液1次，倒置显微镜下观察每日生长状态，接种第2天开始每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)培养4 h，弃掉上清液，加入150 μL二甲基亚砜轻轻振荡，并用酶标仪测定570 nm处的各孔吸光度值。连续测8 d，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线^[20-25]。

1.4.3 人尿源性干细胞的鉴定 收集健康成人中段晨尿200 mL，放入50 mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃掉上清液，得到沉渣，将沉渣加入PBS混悬，再次置入离心机中离心，弃上清，用尿源性细胞培养基培养，显微镜下观察拍照。

取第4代融合率为80%-90%的尿源性干细胞，吸弃培养基，经冲洗、胰酶消化、离心后，加入尿源性细胞培养基培养，分别加入荧光标记的CD29、CD44单克隆抗体，上流式细胞仪检测。

取生长状态良好的第3代人尿源性干细胞，待生长密度为80%-90%时，加入胰酶消化，离心后，接种入6孔培养板内，待细胞生长良好，分别加入成脂、成骨诱导液进行诱导分化。成脂诱导2周后用油红O染液进行染色，成骨诱导3周后用茜素红染液进行染色，染色后在显微镜下观察并拍照。1.5 主要观察指标对比3组尿源性干细胞的生长状态、贴壁情况以及细胞生长曲线。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

尿道损伤是泌尿系统常见疾病，导致这一疾病的病因有多种，主要有先天畸形、外伤、炎症、尿道损伤初期处理不当等原因引起，临床上常表现为尿道狭窄或缺失等，严重影响患者的生活质量。在泌尿系统组织工程研究初期阶段，研究者多采用成体干细胞如间充质干细胞进行组织修复或重建，虽然极大地促进了再生医学的发展，但是其仍有许多缺陷，如增长缓慢、不易取材、操作复杂等限制了其进一步发展^[26-33]。当前，尿源性干细胞的发展解决了这一系列难题。尿源性干细胞由尿液中分离获取，具有很强的增殖分化能力，能够向成骨、成脂方向分化^[19]，其安全无创伤、经济方便等优点引起人们的密切关注^[34-39]。但是，许多研究者在应用过程中仍发现一些缺点：人尿源性干细胞培养过程易混入细菌导致培养基污染，虽然干细胞的培养基复杂多样，但是尿源性干细胞作为一个新发现的干细胞群体，研究者们现在尚没有研究出一种高效、稳定、经济的培养方法，而其中的关键是培养基的选择^[40-44]。若其培养经济快捷方便，将会成为泌尿系统甚至其他系统再生组织的优良种子细胞，将会在再生医学及组织工程医学中产生巨大的应用价值^[45-49]。

现阶段，国内外对尿源性干细胞的研究较少，Zhang等^[21]利用角质细胞无血清培养基和胚胎纤维母细胞培养基的混合液从人尿液中分离获得具有多能性的干细胞，生长状态良好。陈波特^[50]采用离心分离法分离尿源性干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞，角质细胞无血清培养基和胚胎纤维母细胞培养基的混合培养基体外培养扩增，得到形态透亮，大小均一，排列紧凑的干细胞，增殖活力强，传代至6代增殖活力开始减弱。龚飞翔^[24]利用课题组配制的含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子β等生长因子的混合培养基(LMM101培养基)，从人新鲜尿液中获取尿源性干细胞，呈漩涡状或平行状排列，以梭形细胞为主。马文军等^[51]研究发现在持续性的低氧(体积分数为3% O₂)状态下能够促进兔尿源性干细胞的生长增殖，减少细胞的凋亡，增加了兔尿源性干细胞分泌功能，但是作用机制仍未明确。

本实验分别用角质细胞无血清培养基、祖细胞培养基以及尿源性细胞培养基(角质细胞无血清培养液和祖细胞培养液以等比例混合而成)进行人尿源性干细胞培养，其余培养条件一致，将细胞悬液以适宜密度接种到上述培养基上观察人尿源性干细胞的贴壁生长状态与生长曲线。实验过程中，作者发现尿源性干细胞在3种培养基中均能生长增殖，使用尿源性细胞培养基培养的人尿源性干细胞生长状态最好，细胞增殖速度最快，克隆能力最强，培养基内少有衰退凋亡的细胞，细胞呈漩涡状或平行排列生长，活力旺盛，倍增时间短，可连续传代次数多；祖细胞培养基内细胞数量相对较少，增殖速度与克隆能力较尿源性细胞培养基低，培养基内散在集落细胞；角质细胞无血清培养基组细胞最少，生长形态最差，克隆速度最慢。由此可知，尿源性细胞培养基最适合尿源性干细胞的增殖，能够快速有效培养出目的细胞，是一种理想的尿源性干细胞培养基。

尿源性细胞培养基由多种营养添加物混合而成，如细胞生长因子、牛脑垂体提取物、胰岛素、微量元素等，营养成分丰富。在培养基中加入了细胞生长因子，对细胞有明显的促进生长、增殖和分化作用，是一种重要的细胞增殖分化调节剂^[52]。加入胰岛素后，其可促进糖原、脂肪、蛋白质合成，吸收葡萄糖和氨基酸，对细胞生长增殖有明显促进作用，由此证明加入了细胞生长因子、牛脑垂体提取物等物质能够明显促进尿源性干细胞快速生长和增殖，且有研究者发现角质细胞无血清培养基能够抑制成纤维细胞的生长^[53]，间接有利于尿源性干细胞的生长。本实验发现单用角质细胞无血清培养基或祖细胞培养基培养尿源性干细胞均不能得到满意的效果，培养得到的干细胞数量少，细胞活力不强，细胞形态不够饱满成熟，传代次数较少。而尿源性细胞培养基能够快速促进尿源性干细胞增殖克隆，为最适宜的培养基，更有利于尿源性干细胞的生长。

组织工程作为新兴的医学领域，尿道支架构建联合尿源性干细胞的应用将开辟新纪元，如今随着尿源性干细胞的应用发展，未来必将会成为研究者重点发展方向^[54-58]。

目前，尿源性干细胞作为一种新兴的干细胞家族成员，研究尚处在起步阶段，积极寻找最佳的培养体系及质优价廉的培养基并进行推广应用是下一步研究的重点，为将来进一步研究提供理论基础与经验支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三种培养基对人尿源性干细胞生长和增殖的影响

Growth and proliferation of human urine derived stem cells in three kinds of culture media

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