血管内皮生长因子基因修饰羊膜间充质干细胞移植治疗肾病综合征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0415

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血管内皮生长因子：早期亦称作血管通透因子，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。人的血管内皮生长因子蛋白是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明血管通透因子与血管内皮生长因子是同一基因编码的同一蛋白。
乙酰肝素酶：是一种能降低硫酸乙酰肝素的内源性β-葡糖醛酸内切酶，可特异性的将其水解为小分子片段，从而改变硫酸肝素样蛋白多糖在肾小球基底膜上表达分布，影响肾小球的滤过功能。

摘要
背景：外源基因在间充质干细胞中的表达有利于增强其移植效应及提高其分化率。
目的：探讨血管内皮生长因子基因修饰羊膜间充质干细胞移植对肾病综合征大鼠肾功能及凝血功能的改善作用。
方法：从72只雄性SD大鼠中随机选出18只，作为正常组，未给予任何干预；余下的54只大鼠随机分为模型组、羊膜间充质干细胞组、血管内皮生长因子修饰组，每组18只，均于尾静脉注射阿霉素建立肾病综合征模型。造模后24 h，经尾静脉注射生理盐水、羊膜间充质干细胞悬液、血管内皮生长因子基因修饰羊膜间充质干细胞悬液各10 μL，1次/d，连续3 d。移植后12周采用全自动生化分析仪检测血脂水平、肾功能指标及凝血指标变化，采用三氯乙酸法测定24 h 尿蛋白含量，采用RT-PCR、Western blot检测大鼠肾组织HPA及VEGF mRNA和蛋白的表达。
结果与结论：①模型组24 h尿蛋白定量及血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮水平与正常组比较均明显升高(P < 0.05)，血清总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白水平则明显降低(P < 0.01)。羊膜间充质干细胞组及血管内皮生长因子修饰组上述各指标均较模型组明显改善(P < 0.05)。血管内皮生长因子修饰组各项指标优于羊膜间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②模型组各凝血指标呈高凝趋势，与模型组比较，羊膜间充质干细胞组、血管内皮生长因子修饰组高凝状况均有改善，血管内皮生长因子修饰组更为明显；③模型组HPA mRNA和蛋白表达较正常组明显增加，羊膜间充质干细胞组、血管内皮生长因子修饰组HPA mRNA和蛋白表达较模型组减少，血管内皮生长因子修饰组HPA mRNA和蛋白表达量最少；④血管内皮生长因子修饰组血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达量明显高于其他3组，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，血管内皮生长因子基因修饰羊膜间充质干细胞能够改善肾病综合征大鼠的肾功能及血液高凝状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9784-7827(高大维)

关键词: 血管内皮生长因子, 基因修饰, 羊膜间充质干细胞, 移植, 肾病综合征, 肾功能, 凝血, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The expression of exogenous genes in mesenchymal stem cells is beneficial to enhance the transplantation effect and improve the differentiation rate.
OBJECTIVE: To verify whether the transplantation of amniotic mesenchymal stem cells (AMSCs) can improve the renal function and blood coagulation in rats with nephrotic syndrome by means of vascular endothelial growth factor (VEGF) modification.
METHODS: The 18 of 72 male Sprague-Dawley rats were assigned to normal group (without any treatment), and the other 54 rats were intravenously injected with doxorubicin to establish adriamycin nephropathy rat models which were randomly divided into three groups: model group (tail vein injection of 10 μL of 0.9% PBS injection), AMSCs group (tail vein injection of 10 Μl of AMSCs suspension), VEGF modified group (tail vein injection of 10 μL of VEGF modified AMSCs suspension). The injection in each group began at 24 hours after modeling, once a day for 3 consecutive days. The levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), total protein (TP), albumin (Alb), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN) and coagulation index were measured by an automatic biochemical analyzer. The 24-hour urinary protein was determined by trichloroacetic acid method. The mRNA and protein expression of heparanase (HPA) and VEGF in renal tissue were detected by RT-PCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal group, the contents of 24-hour urinary protein, TC, TG, LDL, Cr, BUN in the model group were significantly increased (P < 0.05), while the contents of TP, Alb, HDL were significantly decreased (P < 0.01). The serum levels of TC, TG, LDL, Cr, BUN in the AMSCs group and VEGF-modified group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05), while TP, Alb and HDL were significantly higher in the model group (P < 0.05). Compared with the AMSCs group, these indexes were significantly improved in the VEGF-modified group (P < 0.05). (2) The coagulation indexes of the model group showed a tendency of hypercoagulability. Compared with the model group, the hypercoagulability in the AMSCs and the VEGF-modified group were improved, especially in the VEGF-modified group. (3) The expression of HPA gene and protein in the model group was significantly higher than that in the normal group. The expression of HPA gene and protein in the AMSCs group and VEGF-modified group was lower than that in the model group. The expression of HPA gene and protein in the VEGF modified group was the lowest, while the expression of VEGF gene and protein in the VEGF modified group was the highest among the groups (P < 0.05), and there were significant differences between groups (P < 0.05). To conclude, VEGF gene-modified AMSCs can be transplanted via tail vein to improve renal function and hypercoagulable state in rats with nephrotic syndrome.

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Key words: Vascular Endothelial Growth Factors, Amnion, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Nephrosis, Lipoid, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

高大维，杨鹏. 血管内皮生长因子基因修饰羊膜间充质干细胞移植治疗肾病综合征[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 83-88.

Gao Da-wei, Yang Peng. Treatment for nephrotic syndrome: vascular endothelial growth factor gene modified amniotic mesenchymal stem cells transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 83-88.

图/表（结果） 2

2.1 羊膜间充质干细胞的形态 培养3 d时，多数细胞体积较大，表现为纺锤形多突起的成纤维细胞样或扁平多角形；少数细胞形态小，呈三角形；第3代羊膜间充质干细胞表现为梭形或纺锤形，见图1A，B。

2.2 羊膜间充质干细胞转染后第3天和第14天VEGF蛋白的表达 VEGF转染组VEGF蛋白的表达高于阴性转染组和对照组(P < 0.05)，后两者之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.3 生化指标及凝血指标 与正常组比较，模型组血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮均明显升高(P < 0.05)，血清总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白则明显降低(P < 0.05)。羊膜间充质干细胞组及VEGF修饰组血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮均明显低于模型组，且VEGF修饰组最低(P < 0.05)；而血清总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白则较模型组明显升高，且VEGF修饰组最高(P < 0.05)。模型组各凝血指标呈高凝趋势，与模型组比较，羊膜间充质干细胞组、VEGF修饰组高凝状况均有改善，VEGF修饰组更为明显(P < 0.05)。见表1，2。

2.4 各组大鼠24 h尿蛋白含量 模型组大鼠24 h尿蛋白含量显著高于其他3组(P < 0.05)；与羊膜间充质干细胞相比，VEGF修饰组明显降低，但仍高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.5 羊膜间充质干细胞的存活和分布情况 荧光显微镜观察发现，VEGF修饰组及羊膜间充质干细胞组均可见表达红色荧光的阳性细胞，且只在肾小管和间质中可见，在肾小球内并未观察到其表达。与羊膜间充质干细胞组相比，VEGF修饰组阳性细胞较多；而在正常组及模型组的肾组织内均未见荧光细胞，见图3。

2.6 各组肾组织HPA及VEGF mRNA的表达 与模型组相比，羊膜间充质干细胞组、VEGF修饰组及正常组HPA mRNA表达量均显著减少，且正常组<VEGF修饰组<羊膜间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。各组间VEGF mRNA表达量比较发现，VEGF修饰组较其他3组均显著升高(P < 0.05)，与模型组相比，羊膜间充质干细胞组和正常组VEGF表达量亦升高(P < 0.05)，见图4。

2.7 各组肾组织HPA及VEGF的蛋白表达 模型组HPA的表达量较正常组、羊膜间充质干细胞组、VEGF修饰组升高(P < 0.05)；羊膜间充质干细胞组及VEGF修饰组均较模型组降低，且VEGF修饰组降低更明显(P < 0.05)。各组间VEGF蛋白表达量比较发现，VEGF修饰组较其他3组均显著升高(P < 0.05)，与模型组相比，羊膜间充质干细胞组和正常组蛋白表达量亦升高(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年2月至2016年11月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄健康雄性SD大鼠72只，体质量(122.4±16.8) g，SPF级，由河北医科大学动物实验室提供，动物生产批号：SYXK(冀)2013-0001。大鼠所处环境为光照12 h，恒温18-24 ℃，自由饮用高温消毒过的蒸馏水，食用无菌袋装饲料。

1.3.2 实验用试剂和仪器 1%戊巴比妥钠(陕西博精生物科技公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培养基(HyClone公司)；腺病毒载体pSNAV(上海生工公司)；鼠抗人VEGF一抗及HRP标记的山羊抗鼠二抗(北京博奥生物技术有限公司)；RNA提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)；cDNA反转录试剂盒(美国MBI公司)；阿霉素(浙江海正药业公司)。电子恒温水浴箱、超净工作台、低速自动平衡离心机(上海医疗器械七厂)；-80 ℃超低温冰箱(广东科龙电器股份有限公司)；石蜡切片机(日本产三菱牌)；PCR扩增仪(美国BioRad公司)；DYY-10稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)；SE-9000型全自动生化分析仪(日本Sysmex公司)；全自动图像分析仪(德国LEICA公司)；Vortex-Geniel漩涡震荡器(北京华昊伟业实验器材有限责任公司)；荧光倒置显微镜(英国Andor公司)。

1.4 方法

1.4.1 羊膜间充质干细胞的分离培养 应用1%戊巴比妥(0.1 mL/g)将SD孕鼠(河北医科大学动物实验室提供)进行腹腔麻醉，随后将其放于无菌环境中进行后续操作，打开腹腔，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织，置于含有500 U/mL双抗的PBS中冲洗。将羊膜组织放在含500 U/mL双抗的DMEM基础培养基中，应用无菌眼科剪剪成1 mm³大小。将组织悬液放入EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入10 mL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)，在37 ℃环境中静置30 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基终止消化，200目滤网过滤得到单细胞悬液，接种到25 cm²培养瓶中，用含有体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L表皮生长因子和500 U/mL双抗的DMEM完全培养基进行培养，3 d后进行换液，当细胞85%-90%融合时传代培养。流式细胞术鉴定细胞表面抗原。

1.4.2 腺病毒载体的构建及分组 以包含VEGF全序列的pcDNA3(+)-VEGF质粒为模板进行扩增，其中，上游引物为5’-ATC GGA ATT CAT GAA CTT TCG CTG-3’，下游引物为5’-ATC TGT CGA CTC ACC GCC TCG GCT T-3’，PCR扩增后得到带有EcoRⅠ和Sal Ⅰ酶切位点的DNA片段，用EcoRⅠ及SalⅠ同步双酶切PCR产物及腺病毒载体AAV-pSNAV，然后转化感受态细胞DH5α，进行单克隆测序得到含有VEGF基因的腺病毒表达载体AAV-VEGF。取第3代生长良好的羊膜间充质干细胞，以每孔5×10⁴个接种于96孔板，当细胞铺满70%左右时，将细胞分为3组：对照组未经任何特殊处理，阴性转染组转染腺病毒空载体，VEGF转染组转染AAV-VEGF腺病毒表达载体。以最佳感染复数为100转染，转染后继续培养72 h，倒置显微镜观察细胞形态。

1.4.3 Western blot检测VEGF蛋白的表达 转染后第3，14天，提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测提取的蛋白样品浓度，将蛋白样品与Loading buffer等体积混合，煮沸5 min使其充分变性。取变性蛋白样品加入PAEG凝胶(12%分离胶，4%浓缩胶)上样孔中，每孔60 μg，行聚丙烯酰氨凝胶电泳。取PVDF膜将目的蛋白进行转膜，TBST冲洗3次，每次10 min，放入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，期间轻轻晃动，TBST冲洗3次，每次10 min。将膜放入杂交袋中，添加TBST稀释的一抗(VEGF 1︰50稀释)，封口，4 ℃过夜，TBST冲洗3次，每次10 min，将膜再次放入袋中，添加HRP-山羊抗鼠IgG(TBST 1︰1 000稀释)，封口，室温放置1 h，TBST冲洗3次，每次10 min，用ECL进行显色、定影，放入凝胶成像仪中进行拍照及分析。重复以上操作3次。用Quantity one图像分析软件分析蛋白相对表达水平。

1.4.4 PKH26标记羊膜间充质干细胞 ①在室温条件下，将羊膜间充质干细胞悬液(2×10⁷个细胞)放入离心管中，用不含血清的培养基进行洗涤(此为2×细胞)，400×g离心5 min；②弃上清，用1 mL的Diluent C重悬细胞；③在室温条件下配置4×10^-6 mol/L的PKH26染料(此为2×染料，将原液用Diluent C稀释250倍)；④将1 mL 2×细胞和1 mL 2×染料混匀。室温条件下孵育5 min，在此期间将离心管上下颠倒数次，动作需轻柔；⑤加入2 mL血清孵育1 min终止染色；⑥加入4 mL完全培养基，400×g离心5 min；⑦弃上清，将细胞转移到新的离心管中再次洗涤，共3次；⑧用完全培养基再次洗涤细胞并离心，调整细胞至所需浓度。

1.4.5 肾病综合征模型建立 从72只雄性SD大鼠中随机选出18只，作为正常组，未给予任何干预；余下的54只大鼠随机分为模型组、羊膜间充质干细胞组、VEGF修饰组，每组18只，均于尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg建立肾病综合征模型。每日观察大鼠的饮食、精神状态、活动情况、体毛、水肿等情况。

造模后24 h，模型组尾静脉注射10 μL生理盐水，羊膜间充质干细胞组尾静脉注射3×10⁷ L^-1PKH标记的羊膜间充质干细胞悬液10 μL，VEGF修饰组尾静脉注射3×10⁷ L^-1PKH标记的VEGF修饰羊膜间充质干细胞悬液10 μL，1次/d，连续3 d。

1.4.6 血脂水平、肾功能指标及凝血指标变化 细胞移植后各组大鼠继续喂养12周，每组随机取8只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于腹主动脉处进行插管并取4 mL血液(血脂检测2 mL，肾功能指标及凝血指标检测2 mL)于采血管中，3 000 r/min离心15 min，取上清放入EP管中，并于-80 ℃条件下保存。应用全自动生化分析仪对凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)进行测定。取血后将各组大鼠放回代谢笼中，继续在上述条件下喂养，收集24 h的尿液量，应用三氯乙酸法进行24 h尿蛋白定量。

1.4.7 PKH26标记的羊膜间充质干细胞的存活和分布情况 采血和留取尿液标本后，每组取5只大鼠，将其麻醉后打开腹腔，取出双侧肾脏，分离周围包绕的组织，将右肾切下立即放入含液氮的冻存管中，放于-80 ℃冰箱中保存，待后续用于提取RNA；将左肾进行离断并沿纵轴分为两半，放于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，制作石蜡切片，片厚5 μm，行苏木精-伊红染色，应用荧光显微镜观察PKH26标记的羊膜间充质干细胞的存活及分布情况。

1.4.8 RT-PCR检测大鼠肾组织HPA及VEGF的mRNA表达 取出上述液氮处理后的肾组织，放入研钵中研磨成粉末，加入Trizol裂解液1 mL，静置10 min。依据Trizol说明书提取总RNA，用紫外分光光度计对RNA进行定量，琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行验证。根据反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。HPA引物序列：上游引物：5’-TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA AC-3’，下游引物：5’-GTA GTG ATG CCA TGT AAC TGA ATC-3’，扩增片段长度585 bp；VEGF引物序列：上游引物为5’-ATG TGT GTC CGT CTA GAT GT-3’，下游引物为5’-GGA AGT GTT GAT TGG AAA ACT GA-3’，扩增片段长度160 bp。内参照GAPDH引物序列：上游引物为5’-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AAG GCT-3’，下游引物为5’-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AAC GTT CA-3’，扩增片段长度392 bp。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶扫描仪对DNA条带进行扫描。实验重复3次。

1.4.9 Western blot检测大鼠肾组织HPA及VEGF的蛋白表达 将上述RT-PCR检测时已研磨好的部分肾组织粉末放入匀浆器中，添加蛋白裂解液，在冰上裂解1 h，提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测提取的蛋白样品浓度。取40 μg蛋白行聚丙烯酰氨凝胶电泳，应用电转法转至PVDF膜上，对非特异性抗原进行封闭，加入鼠抗人HPA抗体(1︰500稀释)和VEGF抗体(1︰200稀释)，4 ℃过夜，用含有0.1%Tween20的TBS进行洗膜，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(1︰1 000稀释)，室温放置1 h，洗膜，采用ECL进行显色，行条带分析。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠的血脂水平、肾功能指标及凝血指标变化；②羊膜间充质干细胞的存活和分布情况；③大鼠肾组织HPA及VEGF的mRNA表达；④大鼠肾组织HPA及VEGF的蛋白表达。

1.6 统计学分析 所有数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肾病综合征为一种常见病及多发病，多种病因均可引起该病的发生^[26-28]。该病主要分为两种：原发和继发，其中前者为主要原因^[29]。该病导致肾小球基底膜受到损害致使通透性发生改变，引起肾小球滤过功能出现紊乱而产生大量的尿蛋白及高血脂水平等多种临床症状。目前对于肾病综合征患者常采用肾上腺皮质激素及细胞毒性药物等进行治疗，尽管起效迅速且能够快速达到抗炎、抗病毒等效果，但长期或大量使用极易发生毒副作用，机体正常的免疫功能也会发生损害，导致治疗效果不尽理想^[13^，^30-31]。近年来研究发现，VEGF对肾脏的影响是显而易见的。当VEGF等促血管生成因子存在时，血管生成素2竞争抑制血管生成素1效应，促进血管结构松解，消除血管基底膜和周围细胞对血管形成的限制，并增加内皮细胞对VEGF等细胞因子的敏感性，形成新的毛细血管。栾健等^[32]研究表明VEGF和内抑素与糖尿病肾病血管增生密切相关。
羊膜间充质干细胞来源广泛、且不受伦理学制约，因此拥有广阔的应用前景^[33]。羊膜间充质干细胞的免疫原性极低，并且传代稳定，是一种获取简单且产量很高的良好细胞来源^[34-36]。实验应用VEGF修饰的羊膜间充质干细胞经尾静脉注入肾病综合征模型大鼠体内，观察其治疗效果，从而为临床该病的治疗提供重要参考。实验首先对羊膜间充质干细胞进行分离培养及鉴定等，然后转染AAV-VEGF腺病毒表达载体，Western blot检测发现VEGF可持续高表达14 d之久。然后将其经尾静脉注入肾病综合征模型大鼠体内，于12周末检测羊膜间充质干细胞组及VEGF修饰组血脂、肾功能及凝血指标均显著优于模型组，且VEGF修饰组上述指标的变化更明显，这提示羊膜间充质干细胞及VEGF修饰羊膜间充质干细胞均能很好地改善肾病综合征大鼠血脂水平、肾功能和机体的高凝状态，且两者联合应用效果更佳。羊膜间充质干细胞及VEGF修饰羊膜间充质干细胞对肾功能、血脂及高凝状态改善的同时，也能够降低尿蛋白水平，这表明VEGF修饰后的羊膜间充质干细胞能够很好地改善肾病综合征的肾损害。进一步行分子水平测定发现VEGF修饰组HPA及VEGF mRNA及蛋白表达水平优于其他3组。众所周知，肾小球的电荷屏障被破坏是肾病综合征患者出现尿蛋白阳性的重要原因。肾小球电荷屏障最重要的结构-肾小球基膜的主要成分为硫酸肝素蛋白聚糖。HPA能够识别并水解HS侧链上的糖苷键。研究发现，肾小球内HPA基因的活性或表达增加，将使肾小球基膜上HS的分解增加，肾小球基膜电荷屏障被破坏。与模型组相比，羊膜间充质干细胞组、VEGF修饰组HPA mRNA表达量均显著减少，且正常组<VEGF修饰组<羊膜间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，上述结果表明，应用VEGF修饰的羊膜间充质干细胞对肾病综合征大鼠进行干预能够改善肾功能及血液的高凝状态。

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