两种交联剂对β-磷酸三钙明胶复合骨支架理化及生物学性能影响的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0055

摘要/Abstract

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文题释义：

高分子交联：由高分子链间形成新的连接键而生成网状结构高分子的反应，利用化学试剂引发的交联反应称为化学交联，通过光、射线引发的交联反应分别称为光交联和辐照交联。

戊二醛与京尼平交联剂的细胞毒性：戊二醛交联剂水溶性好，交联速度快，价格低，材料内残留的戊二醛细胞毒性较大，易引发周围组织纤维化，经蒸馏水反复洗涤，可有效降低材料的细胞毒性。有文献报道戊二醛交联的明胶基支架更利于成纤维细胞的黏附及增殖。京尼平交联的材料细胞毒性小，亲和性高，还有促成纤维细胞、软骨细胞增殖的作用。

背景：不同交联方法会改变支架的理化性能与生物学性能。

目的：分别以京尼平、戊二醛作为交联剂制备β-磷酸三钙/明胶复合骨支架，比较支架的理化及生物学性能差异。

方法：分别以京尼平(交联72 h)、戊二醛(交联24 h)作为交联剂，通过相分离/冷冻干燥技术制备β-磷酸三钙/明胶复合骨支架，检测两组支架的孔隙率、交联度、抗压强度、体外溶胀度及降解率。①体外细胞毒性实验：分别以浓度为25%、50%、100%的两组支架浸提液培养兔骨膜成骨细胞24，48，72 h，检测细胞增殖率，评定细胞毒性分级；②体内修复实验：在18只兔颅骨两侧制作直径8 mm的骨缺损模型，两侧分别分别植入京尼平与戊二醛交联的β-磷酸三钙/明胶复合骨支架，植入后4，8，12周进行缺损处大体、X射线及组织学观察。

结果与结论：①两组支架孔隙率、抗压强度与最大压缩力比较差异无显著性意义；京尼平交联组支架交联度高于戊二醛交联组(P < 0.05)，体外溶胀度及降解率低于戊二醛交联组(P < 0.05)；②京尼平交联支架浸提液仅100%浓度组培养24 h时细胞生长抑制不超过总数的50%，毒性为2级，其余为1或0级；戊二醛交联支架浸提液100%浓度组24 h细胞生长抑制超过总数50%，毒性为3级，25%、50%浓度组培养24 h及100%浓度组培养48 h的细胞毒性为2级，其余为1级；③X射线及组织学观察显示，随时间植入时间的延长，两组新骨组织从周围长入，支架材料呈向心性降解，京尼平交联组植入8，12周的新骨形成率高于戊二醛交联组(P < 0.05)；④结果表明，采用京尼平、戊二醛交联制备的β-磷酸三钙/明胶复合骨支架理化性能接近，京尼平交联需要的时间较长，但制备的支架生物活性更优。

ORCID: 0000-0003-2637-7319(潘朝晖)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 京尼平, 戊二醛, β-磷酸三钙, 明胶, 复合骨支架, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: The physiochemical properties and bioactivity of composite scaffolds can be altered by different crosslinkers.

OBJECTIVE: To compare the physiochemical properties and bioactivity of composite scaffolds composed of β-tricalcium phosphate and gelatin, which are crosslinked by 1% genipin or gluteraldehyde, respectively.

METHODS: Porous scaffolds composed of β-tricalcium phosphate and gelatin were made by phase separation/freeze-drying technique. Crosslinking time was 72 hours when genipin acted as a crosslinker and 24 hours when glutaraldehyde as a crosslinker. Physiochemical properties including porosity, degree of cross-linking, in vitro swelling ratio, degradation rate and compressive strength were detected. Bioactivities analyses were performed through co-culturing rabbit periosteal osteoblasts with 25%, 50% and 100% scaffold extracts for 24, 48, 72 hours. The proliferation rate and cytotoxicity gradation were evaluated. In addition, bilateral 8-mm skull defects were made in 18 rabbits and repaired with scaffolds crosslinked by genipin or gluteraldehyde, respectively. Gross observation, X-ray analysis and histological observation were performed at 4, 8 and 12 postoperative weeks.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity, compressive strength and maximum compressive force showed no statistical difference between the two crosslinker groups. Compared with the gluteraldehyde group, higher degree of crosslinking and lower swelling ratio and degradation rate were observed in the genipin group (P < 0.05). (2) In the genipin group, less than 50% growth inhibition was observed when co-cultured with 100% scaffold extract for 24 hours. Thus, the cytotoxicity was graded as 2, and the remains were graded as 1 or 0. In the gluteraldehyde group, excessive 50% growth inhibition was observed when co-cultured with 100% scaffold extract for 24 hours, and the cytotoxicity was graded as 3. For 25% and 50% subgroups (culture for 24 hours) and 100% subgroup (culture for 48 hours), the cytotoxicity was graded as 2, and the remains were graded as 1. (3) X-ray and histological observation showed the in-growth of new bone tissues from the periphery of the defect and the scaffold degraded centripetally. New bone formation was better in the genipin group than the gluteraldehyde group at 8 and 12 postoperative weeks (P < 0.05). To conclude, both genipin and gluteraldehyde can be used as crosslinkers to prepare the composite bone scaffold composed of β-tricalcium phosphate and gelatin. Two scaffolds have similar physicochemical properties; however, the former has a superior bioactivity except for a longer time for crosslinking with genipin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Gelatin, Cross-Linking Reagents, Glutaral, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

潘朝晖，栾兆新，高朋. 两种交联剂对β-磷酸三钙明胶复合骨支架理化及生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(6): 833-839.

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图/表（结果） 8

2.1 扫描电镜观察两组支架均有大量微孔存在，微孔之间亦有较多的连接孔(图1)。京尼平交联组微孔直径(165±43) μm，戊二醛交联组微孔直径(137±57)μm，两组微孔直径比较差异无显著性意义。

2.2 支架的理化性能两组支架孔隙率、抗压强度与最大压缩力比较差异无显著性意义，两组支架交联度、溶胀度比较差异有显著性意义；由于材料的亲水性，前4周两组材料降解率均为负值，随着时间的延长降解率逐渐增加，两组支架12周时的降解率比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.3 骨膜成骨细胞的培养与鉴定骨膜组织贴壁4 d后，成纤维样细胞从组织块边缘游出，呈短梭形或圆形。第6天细胞数量显著增加，12 d达80%融合，细胞均呈短梭形、三角形或不规则多边形，细胞核呈圆形或椭圆形。碱性磷酸酶染色显示大量细胞的胞浆内有灰黑色的颗粒沉积(图2)，诱导成骨分化后，胞浆内灰黑色加深，颗粒增多。

2.4 细胞毒性实验结果京尼平交联支架浸提液培养 24 h，25%浓度组细胞生长状况良好，50%浓度组少量细胞呈圆形，100%浓度组不到半数细胞呈圆形；培养48 h，25%浓度组细胞生长良好，50%、100%浓度组细胞少量细胞形态发生变化；培养72 h，3个浓度组细胞生长均较好，未见细胞溶解。戊二醛交联支架浸提液培养24 h，25%、50%浓度组约半数细胞呈圆形，100%浓度组大部分细胞呈圆形或溶解；培养48 h时，3个浓度组细胞生长情况较24 h有改善，贴壁细胞数目增多；培养72 h时，3个浓度组细胞生长可见轻度抑制(表3)。

2.5 体内修复实验结果

2.5.1 实验动物数量分析实验期内18只动物均存活，未发生并发症。

2.5.2 大体观察植入后4周，两组材料与周围组织结合紧密，无炎症反应。植入后8周，京尼平交联组缺损区边缘不清晰，可见骨组织环绕生长，并向中心长入；戊二醛交联组边缘亦为新生骨组织环绕，中心长入不明显。植入后12周，京尼平交联组缺损区中间残存材料，其余由硬度略低于周边骨质的骨组织替代；戊二醛交联组支架与周边骨融合固定，残存材料多于前者(图3)。

2.5.3 X射线检查植入后4周，两侧缺损区边缘线清晰，中部有高密度影。植入后8周，两侧周缘均渐模糊，中间仍有部分高于正常骨密度影。植入后12周，左侧边缘区及大部分面积与周围正常骨组织密度无差异，中部残存少量高密度影；右侧缺损区周缘密度与周围正常骨组织密度无差异，中部仍有部分密度增高影(图4)。

2.5.4 组织学观察植入后4周，两组未见中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，少量纤维组织从周围长入，仅见少量新骨形成。植入后8周，京尼平交联组边缘新骨形成较多，呈向中心替代趋势；戊二醛交联组边缘有新骨形成。植入后12周，京尼平交联组材料中间有明显骨组织长入；戊二醛交联组见边缘骨组织增多，中部逐渐被新骨替代(图5)。形态学测量提供了两组材料新骨形成及材料吸收的定量结果，具体见表4，植入体内4周时，两组新骨形成及材料残留比较差异无显著性意义；植入8，12周后，两组新骨形成骨比较差异有显著性意义(P < 0.05)，残留材料比较差异无显著性意义。

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引言

创伤、感染、肿瘤切除等原因导致的骨缺损临床上较常见，如果缺损骨量超出自身骨愈合能力需行骨移植手术。为克服自体供骨量有限、有产生供区并发症的风险，以及异体骨移植可能导致传染疾病、发生免疫排斥的不足，研究者们致力研发性能良好的人工骨替代材料。生物陶瓷复合明胶及生物辅助物构建的多孔复合骨支架因化学组成、几何结构与松质骨类似，利于细胞长入和营养运输，业已成为人工骨材料研究领域的一个热点^[1-2]。

利用相分离/冷冻干燥技术制备三维多孔结构的β-磷酸三钙/明胶复合骨支架，要获得足够的力学特性及稳定性，以支持细胞的黏附、生长，通常需要交联反应。不同的交联方法，不仅能改变支架的机械性能，也会影响材料理化及生物学特性。目前可供选择的化学交联剂类型较多，交联剂的种类、浓度、交联时间等因素均是影响支架理化及生物学性能的重要因素^[3-5]。京尼平和戊二醛为处理基于胶原或明胶生物医学材料的常用化学交联剂，前者细胞毒性低，与胶原形成交联结合，持续3个月以上^[6]，但成本较高，交联后材料呈深蓝色，可能使其应用受限；后者交联时间短，性价比好，应用较广，但残留材料内的戊二醛如不去除，可产生明显的细胞毒性反应^[7-8]。既往的研究通常以一种交联剂作为研究对象，对于两者的生物相容性、性价比等问题仍存在争议^[9-11]。对比研究不同交联剂的交联效能及细胞毒性可为后期骨支架材料研制提供有益指导。实验旨在了解相似条件下京尼平、戊二醛分别做为交联剂制备β-磷酸三钙/明胶骨支架的理化及生物学性能的差别，为后续构建性能更佳的人工骨支架奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至12月在解放军第八十九医院全军创伤骨科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：健康成年新西兰大白兔19只，购自鲁抗医药实验动物中心，动物合格证号：SCXK(鲁)20080002，雌雄不拘，体质量2.5-3.5 kg。实验过程符合国家相关部门及动物保护中心的有关规定。

实验用主要材料、试剂及仪器：β-磷酸三钙颗粒购自上海瑞邦生物材料有限公司，直径5-10 μm；明胶颗粒购自美国Sigma公司；京尼平粉末购自日本和光纯药工业株式会社；戊二醛购自上海试剂厂；α-MEM完全培养基、胎牛血清(美国Invitrogen公司)；二甲基亚砜(上海化学试剂有限公司)；扫描电镜(JSM6610LV，日本电子株式会社)；力学试验机(CSS-44010，长春力学试验机研究所有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 制备京尼平交联的β-磷酸三钙/明胶复合骨支架参考金勋杰等^[12]和Liu等^[13]报道进行。精确称量18 g明胶颗粒放入烧杯中，加入100 mL去离子水，在60 ℃恒温水箱中不断搅拌溶解，制成180 g/L的明胶溶液备用。取明胶溶液15 mL，加入1%京尼平7.5 mL，5 000 r/min搅拌5 min后加 β-磷酸三钙颗粒11 g(β-磷酸三钙与明胶质量比4∶1)，搅拌30 min后，倒入直径5 mm、高20 mm圆柱形模具，36 ℃恒温水箱中交联72 h。梯度冷冻干燥24 h。

1.4.2 制备戊二醛交联的β-磷酸三钙/明胶复合骨支架参考Liu等^[13]及Takahashi等^[14]的报道进行。精确称量18 g明胶颗粒放入烧杯中，加入100 mL去离子水，在60 ℃恒温水箱中不断搅拌溶解，制成180 g/L的明胶溶液备用。取明胶溶液15 mL，加β-磷酸三钙颗粒11 g，5 000 r/min搅拌5 min，混匀，等量分装入圆柱形模具。每个模具中加1%戊二醛溶液1.5 mL，模具中加入的戊二醛总量与上述京尼平总量相同，快速搅拌30 s，放入36 ℃恒温水箱中交联 24 h，冷冻干燥。

1.4.3 表征及物化性能测试

扫描电镜观察：取两种β-磷酸三钙/明胶复合骨支架各5个，脱水干燥，表面喷金，扫描电镜观察、测量孔径大小。

排液法测支架孔隙率：10 mL量筒装体积为V₁的无水乙醇，分别浸入两种支架，真空脱气，记体积为V₂，取出支架记录量筒内乙醇体积为V₃。

按公式孔隙率P=(V₁-V₃)/(V₂+V₃)计算^[4]。

Mi氏法测交联度：取两种β-磷酸三钙/明胶复合骨支架各10个，每个样本加4 mL茚三酮溶液，100 ℃加热20 min，冷却至室温后加50%异丙醇20 mL。分光光度计在波长为570 nm下测吸光度。5 mmol/L氨基乙酸溶液做标准曲线，确定自由氨基酸的摩尔数。按公式交联度CI=(M_对照-M_样品)/ M_对照×100%计算，其中M_对照为未加交联剂支架自由氨基酸摩尔数，M_样品表示各支架组自由氨基酸摩尔数^[15]。

Liu氏法测支架体外溶胀度和降解率：取两种β-磷酸三钙/明胶复合骨支架各6个，无菌条件称质量，记m₀，放入无菌EP管中。按m(支架)∶V(PBS) = 1 g : 40 mL比例加入PBS，24 h后取出支架，无菌滤纸吸去表面水分后无菌称质量，记m₁；然后将样品放回EP管密封。每3 d无菌换液1次，每周后取出无菌称质量至12周，记m₂。溶胀度= (m₁-m₀)/m₀×100%，降解率=(m₁-m₂)/ m₁×100%^[16]。

抗压强度：取两种β-磷酸三钙/明胶复合骨支架各10个，样本底面打磨平整，置入力学试验机压头之间，加载速度0.5 mm/min。记录抗压强度和最大压缩力。

1.4.4 生物学性能评估

兔骨膜成骨细胞的分离、培养及鉴定：采用组织块培养法。取成年新西兰大白兔1只，3%戊巴比妥钠以30 mg/kg静脉麻醉，无菌条件下取兔胫骨上段内侧骨膜组织，浸入 4 ℃的1×PBS中，清洗3次，快速将组织块剪成1 mm³小块，平铺于25 cm培养瓶底部，加入6 mL含体积分数10%胎牛血清、1×青链霉素混合液的α-MEM完全培养基，倾斜(底部朝上)置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中2-4 h后轻轻翻转，使培养基缓缓浸入组织块，继续培养，24 h后更换新鲜8 mL完全培养基。每2 d换液1次，达到80%融合后，用2 mL 0.25%胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化2 min，弃去消化液，加入3 mL完全培养基终止消化，吹打分散细胞，转入15 mL锥形离心管1 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入新鲜完全培养基，按1∶2传代，用第6代细胞进行实验。

细胞化学染色：取生长状态良好细胞，0.25%胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化，1 000 r/min离心10 min，细胞计数，调整细胞悬液浓度，按照10⁵/孔、5×10⁴/孔、10⁴/孔分别接种于6孔板，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，使细胞贴壁。更换新鲜完全培养基3 mL/孔，培养2 d后分别行细胞化学染色：①碱性磷酸酶染色：细胞在4 ℃体积分数10%甲醛中固定10 min；蒸馏水冲洗2次；滴加固定剂，固定1 min；滴加工作液室温作用45 min；蒸馏水冲洗2次，晾干；用核固红染液复染2 min，蒸馏水冲洗1次，干后镜检；②诱导成骨分化：参照Liu等^[13]所述方法配制成骨诱导培养液，取生长状态良好细胞，0.25%胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化，1 000 r/min离心10 min，细胞计数，调整细胞悬液浓度，按照10⁴/孔接种6孔板，同时设成骨诱导组和未诱导组，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，使细胞贴壁。成骨诱导组更换成骨诱导介质(α-MEM、体积分数10%胎牛血清、1×青链霉素混合液、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、300 μmol/L维生素C、1 μmol/L 地塞米松)，未诱导组更换完全培养基(α-MEM、体积分数10%胎牛血清、1×青链霉素混合液)，继续培养；每3 d换液1次；诱导7 d后，按照上述方法进行碱性磷酸酶染色，评估成骨分化。

浸提液细胞毒性实验：按表面积与体积比1.0 cm²/mL用完全培养基制备两组支架100%浓度浸提液，分别倍比稀释至50%和25%^[17]。取第6代兔骨膜成骨细胞，每孔 100 μL(5 000个细胞)种植于96孔板，分阴性对照组(完全培养基)、25%浓度组、50%浓度组、100%浓度组和阳性对照组(5%二甲基亚砜)，每组5个复孔，每板设1个试剂空白孔。每个实验孔先加入80 μL完全培养基或材料浸提液或二甲基亚砜，再加入100 μL细胞悬液，混匀。空白孔仅加入180 μL完全培养基。37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24，48，72 h，MTT法测各孔吸光度值(A值)，增殖率(RGR)=实验组平均A值/阴性对照组平均A值×100%计算各组细胞相对增殖率，根据细胞相对增殖率判定毒性级别，同时结合细胞形态进行评定，细胞毒性评级参考ISO-10993-5细胞毒性实验^[18] (表1)。

1.4.5 兔颅骨缺损修复实验取健康成年新西兰大白兔18只，动物购入后常规适应环境(温度20-30℃，湿度50%-70%)1周再用于实验。术前禁食水6 h，戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉注射麻醉，麻醉成功后，俯卧位固定四肢于手术台上。颅顶周围皮肤常规脱毛备皮，碘伏消毒，铺无菌洞巾。在兔两眼球连线中点垂直平分线水平，设计并切开一长约4 cm大小的纵行切口，切开骨膜层至顶骨骨面，骨膜剥离器小心剥离、去除骨膜，暴露额骨及双侧顶骨。以8 mm环钻在两侧顶骨平行位置分别制备全层骨缺损，缺损区边缘间距为4-6 mm。小心保护硬脑膜完整，左侧植入京尼平交联支架，右侧植入戊二醛交联支架。

术后4，8，12周，每个时间点随机取6只兔，取缺损区及周围5 mm正常骨质行大体、X射线拍片观察后，浸入体积分数10%甲醛液中固定5 d，5%甲酸溶液中脱钙，每个标本分为2个10 mm×10 mm×3 mm，常规石蜡包埋， 5 μm厚度切片。Haaris苏木精水溶液中染色，盐酸乙醇分色，伊红染色观察(n=6)。分段采集4倍物镜下含有植入材料的全部视野，用基于计算机的图像分析系统(Image-Pro Plus 5.1)进行半自动的组织形态测量学分析。以环绕植入材料直径8 mm的圆形填充区面积为缺损总面积，分别测量填充区内新骨形成及残留材料的面积，结果以总面积百分数表示。

1.5 主要观察指标两组支架的孔隙率、交联度、抗压强度、体外溶胀度及降解率；两组支架的细胞毒性；两组支架植入兔颅骨缺损后的骨再生情况。

1.6 统计学分析所有数据均采用x(_)±s表示，SPSS 17.0软件行两独立样本t 检验。P < 0.05时差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨缺损的修复问题因其特有的生物学和力学性能要求，至今未得到很好解决。作为骨再生的一个关键环节，理想的骨支架理论上应包括骨结合、骨传导、骨诱导、可降解以及特定的力学特性等优势^[19-20]。以β-磷酸三钙为主要成分的人工骨，具有良好的生物相容性和骨传导性，已成为临床填充各种腔隙性骨缺损的骨替代材料^[21]。但是其不足之处也非常明显，如：①无骨诱导特性；②脆性大，塑性困难，力学强度不佳；③降解与新骨形成速度不协调等^[22]。明胶是胶原蛋白、纤维及不溶性蛋白的多级降解产物，与胶原具有同源性，具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苏氨酸和天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸等与细胞膜整合素结合区相关序列，能被特异性分子识别并介导相关细胞黏附，促进细胞的生长、分化，并且具有生物相容性好，无毒性，抗原性低等优点。因此，通过相分离/冷冻干燥技术制备β-磷酸三钙/明胶复合骨支架，不仅可有效解决β-磷酸三钙脆性大等不足，还能促进细胞的生长、分化。但支架中未经处理的明胶在生理环境下会发生快速降解、吸收，导致骨支架降解与新骨生成不协调，产生新的骨缺损，将严重影响植骨效果。

应用特定交联剂能延长明胶的体内存留时间，改善骨支架的物理性能，其机制可能与促进明胶分子形成共价和氢键结合有关。红外光谱研究提示戊二醛在中性溶液中仅与羟基反应，形成C-O-C结合的双峰，京尼平自身形成二聚体或低聚体，形成2个半氨基团和胶原结合^[10]。但交联剂同时也会影响支架的生物学性能。戊二醛为应用广泛的交联剂，水溶性好，交联速度快，价格低。材料内残留的戊二醛细胞毒性较大，易引发周围组织纤维化。经蒸馏水反复洗涤，可有效降低材料的细胞毒性^[23]。也有文献报道戊二醛交联的明胶基支架更利于成纤维细胞的黏附及增殖^[9]。京尼平交联的材料细胞毒性小，亲和性高，还有促成纤维细胞、软骨细胞增殖的作用^[24]。但各研究所用交联剂的浓度、交联时间等条件差异较大，可比性不强。

此次实验力求控制材料固液比、交联剂浓度及冷冻干燥时间等变量在制备两组材料过程中一致^[25]。参考Takahashi等^[14]、Khan等^[26]及Yao等^[27]研究，将固液比设为3 : 4，即β-磷酸三钙与明胶溶液、京尼平/戊二醛的质量体积分数为75%，β-磷酸三钙与明胶比为4 : 1，冻结温度设定为-80 ℃，交联剂浓度为1%，并使其在明胶、β-磷酸三钙质量分数中占0.5%。结果显示戊二醛交联时间短，需24 h。戊二醛交联组的体外溶胀度及降解率高于交联72 h的京尼平交联组，说明两种交联剂达到较为稳定交联的时间差别较大，交联后支架的亲水性不同，戊二醛交联组的亲水性较好。两组支架物理结构区别不大，孔径均在100 μm以上，孔隙率达90%左右，该结构均有利于细胞生长和营养运输。分析戊二醛交联组亲水性高的原因与其交联度相对低有关。充分亲水性使材料吸收液体，有利于细胞黏附和增殖^[28]。交联剂降低支架的亲水性能与其增加支架水接触角有关。亲水性的降低与使用的交联剂类型无关^[29]。两组支架的抗压强度接近人松质骨，由于支架的溶胀度会使其植入体内后的机械强度进一步降低，因此，均不能满足单独用于负重部位节段性骨缺损重建的力学要求。

细胞毒性分析显示，京尼平交联支架浸提液25%、50%浓度组细胞增殖率在72 h内基本呈逐渐上升趋势，但100%浓度组在前24 h内细胞增殖呈负增长，而后细胞增殖率逐渐上升，至72 h时细胞增殖数量与25%、50%浓度组基本无差异。戊二醛支架浸提液各浓度组在前24 h内细胞增殖率均有下降趋势，100%浓度组下降较为明显，说明在初期京尼平、戊二醛对细胞增殖均有一定的抑制作用或细胞毒性，但戊二醛交联组细胞增殖率明显低于京尼平组，且戊二醛支架材料浸提液各组在前24 h内细胞均呈负增长，说明戊二醛交联交联组的细胞毒性均大于京尼平交联组，提示戊二醛交联制备的支架使用前需反复浸泡洗涤，以减轻细胞毒性。实验所取的兔颅骨缺损模型尺寸为8 mm，虽小于评价颅骨再生的临界骨缺损10-15 mm范围，但此尺寸的缺损已被验证作为评价骨替代材料有无成骨作用的有效骨缺损模型^[30]。骨膜在骨的形成、改建中有着重要影响，保留骨膜可加快骨缺损区的修复，但同时也干扰了评价骨替代材料的骨诱导/骨传导作用效果，因此在制作骨缺损模型时，需剔除骨膜，排除骨膜对两组材料成骨作用的影响。同一颅骨2个缺损区边缘间距为4-6 mm，基本可排除两缺损区两组支架材料的相互影响。实验制备的多孔复合支架中的β-磷酸三钙在降解吸收时可为新骨形成提供钙源。支架中所含的明胶有利于骨缺损区周围生长因子、骨祖细胞或成骨细胞的附着，间接起到骨诱导作用。术后大体观察、X射线检查及组织切片显示两组支架均可重建兔颅骨标准骨缺损，相对而言，京尼平交联组支架在术后第8，12周的新骨长入更多。

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