实验采用国际上常用的遗传背景确定而均一的近交系DA与Lewis大鼠建立肝移植排斥模型,使得在此基础上的研究更具有可比性与可重复性。在移植免疫研究的大鼠模型中,近交系大鼠具有遗传背景确切而且稳定、可复制性强等优点,成为了较为常用的动物。近交系大鼠主要具有以下几个方面的优点:①同一品系的每个大鼠具有相同的基因型和表现型,所以其反应一致,组间的可比性强,实验结果正确可靠。②国际上分布广泛,不同国家的科研单位由于使用同一近交系大鼠所取得的结果是相似的,便于国内和国际间学术交流和实验重复。③近交系大鼠是标准的实验材料,具有规律的生长发育特点,便于选择应用。
在熟练掌握用封闭群SD大鼠采用Kamada等[7]的经典二袖套法进行建模的基础上,选择近交系DA与Lewis大鼠建立肝移植急性排斥模型。发现DA大鼠与其他两种大鼠不同的生长发育特点,DA大鼠生长相对缓慢,其门静脉、肝下下腔静脉、肝上下腔静脉直径和肝脏的体积都比同质量的SD和Lewis小,所以在选择动物时一定要挑选更加合适的供体,考虑到供受体间血管的直径和移植物体积的匹配、以及袖套大小这几方面的要求,发现220~250 g的DA雄性大鼠作为供体,180~210 g的Lewis雄性大鼠为受体最为满意。
大鼠原位肝移植由于其手术难度大、掌操作环节多,围手术期处理复杂[13-18],在实验中过程中,不仅要具备细腻的显微外科手术技巧,还要有高度的耐心,任何一个环节的失误,都会导致手术失败。
由于DA(RT1a)和Lewis(RT11)在主要组织相容性复合物以及次要组织相容性复合物均不相同,二者的组合方式是高等强度的排斥模型。实验结果表明,异基因组受体移植后一般第3天出现食欲不佳、精神萎靡,术后第5天毛发粗糙无光泽、局部黄染,术后第7天开始黄疸进行性加重,并出现明显腹水和死亡,存活不超过12 d。与同基因移植组相比差异明显。肝组织病理结果显示,异基因组术后第3天即表现出急性排斥反应改变,第5天明显加重,第7天病理变化最为典型,均达到RAI 8~9分,光镜下肝细胞变性重,伴大量肝细胞坏死,血窦扩张充血,内皮细胞肿胀明显,汇管区及中央静脉出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,胆小管破坏伴炎细胞浸润,整个肝小叶结构凌乱。血清肝功能检测提示急性排斥大鼠术后第3天即出现明显肝功改变,天冬氨酸转氨酶、总胆红素升高,第5天指标进一步恶化,第7天开始急剧升高。综合异基因组大鼠术后在一般情况、组织病理、肝功能以及生存时间等方面的表现,与临床急性排斥反应的特点相似,可证明DA-Lewis品系组合为肝移植急性排斥组合,尤其第7天开始出现重度排斥反应,可作为反应排斥程度的检测指标的时间点,与文献报道相符[16]。
白细胞介素2和γ-干扰素是Thl细胞的代表因 子
[17-18]。根据被排斥组织局部有高浓度淋巴因子存在的事实,Rogers等
[19]的研究表明,局部高浓度白细胞介素2有利于前体Tc细胞的生长和Tc细胞的形成。研究发 现
[20-22],白细胞介素2及白细胞介素2R的表达是T细胞克隆性增殖的关键因素,在T细胞介导的急性同种异体排斥反应具有重要作用。Oliveria等
[23]检测移植肾经针吸活检细胞培养上清液的细胞因子时也发现,发生急性排斥反应者均有白细胞介素2表达增强。肾移植患者应用抗白细胞介素2R单克隆抗体可以抑制急性移植免疫排斥反应的发生。γ-干扰素同样被发现与免疫应答有密切的关系。Affleck等
[24]在检测同种异体异位心脏移植受体小鼠血清及移植心γ-干扰素表达时发现,血清γ-干扰素在移植后6 d显著升高,同时移植物中出现γ-干扰素表达,这与移植物出现组织学改变的时间吻合。表明γ-干扰素在排斥反应中起重要作用。研究证实,辅助性T淋巴细胞亚群(Th1)分泌的白细胞介素2、γ-干扰素被认为是监测排斥反应的指标
[25-26]。在实验中也发现与同基因移植相比,排斥模型移植后白细胞介素2、γ-干扰素明显升高,与病理分级成正相关,证明白细胞介素2和γ-干扰素的表达强度可以反映排斥的程度,是良好的检测排斥反应的指标。