随着分子生物学技术的飞速发展和对牙周病学诊断和治疗技术的逐步深入,牙髓、牙周病的治疗在口腔内科学中是一个重要的课题,而如何促进牙髓、牙体硬组织以及牙周组织的生理性修复和再生是该课题的中心环节。而牙周组织的再生已成为牙周病治疗的重点和难点
[17]。牙周组织的修复和重建,有赖于残余牙周膜中牙周韧带细胞在多种生物介质调控下,完成分裂、趋化、分化和细胞外基质生物合成等一系列关键的细胞活 动
[18]。有研究发现,一些生物因子有助于牙周组织的重建,其中PDGF对于碱性磷酸酶阳性和阴性的细胞均表现出强大的趋化作用,并能刺激DNA以及胶原和非胶原蛋白的合成
[19],从而促进组织的再生。
牙周膜细胞(periodontal ligament cell,PDL-C)是牙周组织再生的前提细胞,为一种复杂的细胞群,包括成纤维细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞和间充质细胞等,这是形成新的牙周组织的基础。牙周组织的再生修复首先要有一定数量的健康的牙周膜细胞,而生长因子恰能增强这些细胞的增殖活性。Graves等[20]认为牙周组织再生过程中都有一种递质表达,把此种递质称为生长因子,结果发现这种物质能刺激细胞的一系列活动,包括促进趋化性、细胞的增殖分化及细胞外基质蛋白的表达;而通过加入外源性生长因子的实验,结果表明这些因子刺激了牙周膜细胞的增殖,加速了牙周组织新生。这些因子包括PDGF、胰岛素样生长因子、转化生长因子β、碱性成纤维生长因子、骨形态发生蛋白等。Gestrelius等[21]用含各类生长因子的釉质基质诱导剂在体外研究对PDL-C增殖影响发现:①能促进PDL-C的增殖。②增加PDL-C的蛋白产生量。③促进PDL-C矿化小结形成。④但对牙周膜细胞的迁移和附着无显著影响。
PDGF能显著增强人PDL-C分裂活性;诱导纤维连接蛋白、Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ型胶原及组织金属蛋白酶抑制剂因子的合成;刺激成骨细胞活性,抑制胶原酶和纤维蛋白酶原激活因子。PDGF为成纤维细胞和成骨细胞潜在的丝裂和趋化因子,能刺激其DNA、胶原蛋白及非胶原蛋白的合成,加速骨细胞代谢,促进牙骨质新生[22]。
本实验采用MTT比色法观察PDGF-β对hPDLFs的增殖效果。MTT法是利用活细胞线粒体中的脱氢酶使MTT分子还原为不溶性蓝紫色结晶体,形成量与细胞数量和活性呈正相关的关系,通过比色测定即可反映出活细胞数量和活性。本实验结果表明,加入质量浓度为10 μg/L的PDGF-β后,细胞增殖加速,在加入生长因子PDGF-β后,实验组的吸光度显著高于对照组,说明PDGF-β对hPDLFs的增殖具有明显的促进作用。对于牙周组织的再生治疗,关键在于刺激剩余牙周膜细胞的增殖,使其活性提高。本实验表明PDGF-β具有明显的促增殖的作用。PDGF-β对hPDLFs代谢方面的报道已有不少,冯超[23]体外培养hPDLFs用不同浓度的PDGF-β作用,用MTT法测定细胞增殖,结果发现PDGF-β可促进hPDLFs增殖。吉建新等[13]发现PDGF-β对hPDLFs促增殖效应在1~ 50 μg/L,在5 d范围内呈浓度-时间依赖关系,最佳效应时间为3 d,最佳质量浓度为10 μg/L。Tsuyoshi-Fuiita等[24]用3H-TdR掺入法测定PDGF-β对HPDLFsDNA合成的影响,从而测定其它增殖效应,结果发现10 μg/L的PDGF-β比对照组能明显促进hPDLFs增殖。
本实验通过组织块法成功地培养了hPDLFs。组织块法是培养牙龈成纤维细胞的经典方法[25],其操作简单,污染率低,对组织损伤小,故本实验采用组织块法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养。并通过波丝蛋白角蛋白免疫组化染色对细胞进行组织来源的鉴定,鉴定结果表明其来源于中胚层的成纤维细胞样细胞。因此,认为PDGF-β对hPDLFs的增殖及趋化具有一定的潜在促进作用[16, 26]。
本实验采用PDGF-β对传代后的第3代细胞进行诱导,通过MTT法对细胞不同时期的增殖情况进行测定。发现在加入最适质量浓度为10 μg/L的PDGF-β因子后,细胞增殖开始加速,实验组的增殖速度高于对照组,因此说明PDGF-β作为成骨细胞和成纤维细胞潜在的分裂繁殖和趋化因子对体外培养的hPDLFs具有促进增殖及趋化的作用。
慢性牙周炎治疗研究的热点是恢复牙周组织原有的结构和功能,使已丧失的牙周膜、牙骨质和牙槽骨达到协调一致的再生。应用外源性生长因子已成为一种有前景的牙周治疗的手段。通过体外牙周膜细胞模型的构建,发现在体外环境下PDGF-β对hPDLFs的增殖具有显著的促进作用。但也有学者认为PDGF在作用于hPDLFs增殖的过程中起双向调节作用
[27],在刺激增殖的同时还抑制hPDLFs的生长
[28],并认为任何一种生物因子都不是独立作用于细胞,而是与其他因子共同协调,形成一个有机整体,共同完成对牙周组织的修复作用
[29-30]。生长因子作为牙周组织再生修复的重要调节因子,它对牙周组织再生修复的作用是比较肯定的。但是牙周组织再生修复是一个复杂的过程,是受多种因素影响的,本实验也仅仅是在体外的环境下完成,当各种生物因子作用于人体复杂的环境中,其调节机制是否发生改变还尚不十分清楚,但本实验证明了PDGF-β的存在对hPDLFs的增殖具有诱导,为牙周组织再生的研究指明了一个方向。