玻璃化法处理同种异体动脉的移植

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.44.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外血管预处理及保存方法有多种，经过学者们长期大量的研究观察，各种方法均得到了改进，但是仍然存在弊端。因此找到一种更有效的或者几种体外血管预处理保存方法的结合，还需要大量的研究实践。
目的：拟通过比较玻璃化法和传统冷冻法保存处理的同种异体血管移植后效果，找出一种更为实用且制作简便的血管处理方法。
方法：选用健康青紫兰兔96只，手术切除双侧股动脉，根据不同体外血管预处理方法将实验分为3组，即新鲜血管自体移植组、冷冻+辐照预处理血管同种异体移植组及玻璃化+辐照预处理血管同种异体移植组。血管移植后1，2，8，12周，每组取6只动物进行腹主动脉数字减影血管造影、扫描电子显微镜、组织病理学观察，观察移植血管通畅率、动脉瘤形成情况及组织形态学变化。
结果与结论：移植后12周，新鲜血管自体移植组血管的累计通畅率显著高于冷冻+辐照预处理组(P < 0.05)，玻璃化+辐照预处理组与其他两组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。组织病理学检查显示，玻璃化+辐照处理的同种异体血管内膜及中层平滑肌增生较冷冻+辐照预处理组轻，管腔狭窄不明显，炎症反应较轻。经玻璃化法+辐照保存的同种异体血管制作程序简单，移植血管通畅率高，组织反应轻，是一种比较理想的同种异体血管体外处理方法。

关键词: 玻璃化, 冻干, 辐照, 动脉, 血管移植

Abstract:

BACKGROUND: Previous research has demonstrated that in vitro pre-treatment and conservation of blood vessels were improved remarkably; however, they remained still satisfactory. Therefore, to look for effective method still needs to be further studied.
OBJECTIVE: To compare vitrification and traditional freezing to preserve the allograft vascular effects after transplantation, and to find a more practical and easy production of vascular treatment methods.
METHODS: A total of 96 health bruising-blue rabbits, undergoing surgical resection of bilateral femoral artery, were divided into 3 groups: fresh vascular autograft (group A), irradiation pretreatment frozen vascular allograft (group B), and vitrification + irradiation pretreatment of vascular allograft (group C), according to different methods of in vitro vascular preconditioning experiment. At 1, 4, 8, and 12 weeks after transplantation, six experimental animals were taken from each group for abdominal aortic digital subtraction angiography, scanning electron microscopy, histopathology and other methods to observe the rate of aneurysm formation, morphological changes and organization of the vascular graft.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after transplantation, the cumulative patency rate in the group A was significantly higher than that in the group B (P < 0.05); however, there was no significant difference between group C and group A as well as group B (P > 0.05). Histopathological examination revealed that allograft vascular smooth muscle proliferation in endometrium and middle layer of group C was slightly compared with group B, showing unclear lumen stenosis and light inflammatory reaction. The vitrification irradiation preservation of allograft blood vessels, making the procedure easy, high patency rate of grafts, tissue reaction to light, was an ideal way to deal with allogenic blood vessels in vitro.

中图分类号:

R617

马广仁，刘兴炎，陈克明，葛宝丰，白孟海，孔凡宾. 玻璃化法处理同种异体动脉的移植[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(44): 8215-8219.

Ma Guang-ren, Liu Xing-yan, Chen Ke-ming, Ge Bao-feng, Bai Meng-hai, Kong Fan-bin. Vitrification treatment of allograft artery transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(44): 8215-8219.

参考文献

引言

材料方法

讨论

肢体损伤尤其是火器伤经常伴随血管损伤，组织缺血或者淤血就会影响组织创伤的修复，严重时候还能导致肢体的坏死，因此血管损伤的修复就成为科研工作者研究的重点。随着现代外科技术、材料学、免疫学的发展，越来越多的材料被用作损伤血管的替代品。一些研究取得了成功报道，但是仍然存在一些难题，比如移植排斥、血管阻塞等，小血管远期通畅率低等情况。因此替代材料要在临床上成功、广泛的应用，还需要更多的探索。
3.1 异体血管移植后出现的问题
免疫排斥反应：新鲜异体血管植入足以引起受体的全身免疫排斥反应，包括细胞免疫和体液免疫，以细胞免疫为主，其中血管内皮细胞是最主要的免疫反应“靶子”，排斥反应造成内膜增生、中膜坏死和外膜侵润，最终结果是移植物狭窄和闭塞^[2] 。在排斥过程中，内皮细胞上的抗原与其相应的抗体结合形成抗原抗体复合物，激活补体释放趋化因子，白细胞在补体参与下溶解内皮细胞，使基底膜暴露，激活凝血系统，形成血栓，激活的巨噬细胞释放白细胞介素1、肿瘤坏死因子等可提高内皮细胞表面组织因子活性，增加纤溶酶激活物抑制因子和减少血栓调理蛋白，内皮细胞在细胞因子刺激下可合成和分泌单核细胞趋化因子MCP-1/JE，吸引单核巨噬细胞迁移至移植物局部。同时表达Class Ⅱ抗原，提供所有激活CD4⁺ T细胞所必需的信号，并可产生各种细胞因子，引起表型的变化。另外内皮细胞膜还可作为血管紧张素转化酶场所，以使血管紧张素Ⅰ转化成血管紧张素Ⅱ，使血管收缩。
移植后血管内皮化：血管内皮细胞是一个矛盾的统一体。它既是血管内的强抗原表达细胞，诱发受体的免疫排斥反应；又具有重要的生理功能，可以调节血管的舒缩反应、抑制血栓形成。目前研究的重点还有移植血管在受体内的内皮化问题，通过物理或化学的方法预处理保存的动脉，移植后虽然通畅，但存在着较多的坏死组织。移植后再通的血管可能只是成功地起了支架作用，动脉内层最终将由宿主血管内皮细胞爬行替代。一般认为，通畅的移植血管若3个月时间还不能完全内皮化，则说明血管移植有可能失败。其失败的最主要原因是不能内皮化的移植血管极易形成血栓。关于移植血管内皮细胞的来源可归纳为以下4个方面：①爬行学说：宿主细胞跨超吻合口向移植血管移行，扩展直至覆盖整个血管内膜^[3] 。②宿主内皮细胞或多能干细胞通过毛细血管壁钻入移植血管^[4] 。③着陆学说：血液中的内皮细胞附着于移植血管内表面^[5] 。④分化学说：平滑肌细胞分化、移行而来^[6] 。
3.2 体外血管预处理及保存方法 体外血管预处理及保存方法有多种，比如辐照法、冷冻法、玻璃化法、化学去细胞法、绿茶多酚的应用等。经过学者们长期大量的研究、观察，各种方法均得到了改进。但是各种方法仍然存在弊端，因此找到一种更有效的或者几种体外血管预处理保存的方法的结合，还需要研究人员大量的研究、实践。
辐射法：辐照法是将血管再无菌条件及无创伤原则下用⁶⁰Coγ射线照射，理论上辐照技术不仅可以消毒灭菌，还可以降低甚至消除同种异体血管的抗原性。2006年沈国良等^[7]研究了辐照同种异体血管移植的可行性认为辐照同种异体血管完全符合理想的血管移植物所具备的条件；在不使用任何免疫抑制的条件下，应用辐照同种异体血管进行同种异体血管移植是可行的。辐照同种异体血管移植后2周移植血管内膜出现内皮细胞，移植后3个月移植血管内膜内皮细胞覆盖完整。张业伟等^[8]进行了经辐照的同种异体血管在肝移植中的应用的研究，发现经辐照的同种异体大隐静脉符合理想的血管移植物的条件，同时具有较弱的抗原性。
低温保存法：1994年以来，Pegg等^[9-10]研究了兔子冠状动脉和颈总动脉的低温保存方法，研究了抗冻剂浓度和降温速率对成活率的影响。1995年上海第二医科大学附属新华医院和上海理工大学合作也在寻求对牛主动脉的保存方法^[11] 。魏民等^[12]根据方差分析，认为影响冷冻效果的实验因素依次为维持时间、冷冻处理、低温冷冻溶液、解冻处理、平衡处理、洗脱处理。最优组合为动脉直接进入2.5 mol/L的DMSO，通过3个温度梯度降至-70 ℃，维持60 min，直接投入液氮中保存，使用时直接投入水浴复温，采用平衡液一步洗脱低温冷冻溶液。经过低温保存后的血管结构保存比较完整，但是血管收缩、舒张功能显著降低。Ellis等[^13]对人体肺动脉进行了低温保存，冻存后血管的收缩力降为新鲜时的76%。Nataf等^[14]对人体乳动脉进行了低温保存，也同样发现血管的收缩功能下降较大。实验中结合冷冻+辐照的方法处理血管，使移植血管在保护液中程序降温，并在液氮中保存2周时间，这是冷冻降低抗原的最佳时间，然后消融后冲洗掉保护液，做辐照处理，使血管抗原性降至很低的程度，而血管的物理特性如弹性、脆性、抗拉性均较好保存。本实验发现自体血管对照组移植后血管通畅率为91.7%，经过低温冷冻及辐照处理后血管通常率为70.8%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。这就说明经冷冻+辐照处理的同种异体移植血管虽然能使血管抗原性降低、能到达较高的通常率，但同时也发现处理后的血管部分出现了裂纹及断裂现象，移植血管有部分出现了动脉瘤，说明此种方法对组织的破坏相对较重。
玻璃化法：此法是将某种物质转变成玻璃样无定形体(玻璃态)的过程，通过玻璃化法降温保存细胞时，细胞内外的水都不形成结晶，细胞结构不会受到破坏从而细胞得以存活。玻璃化研究的重点是，寻找细胞毒性较小且较易实现玻璃化的溶液。将现有的低温保护剂混合使用，从而降低单保护剂的浓度、减少毒性，是一种较好的解决方法。混合使用保护剂还能使单独使用时的毒性得到中和^[15] 。选用的DMSO为最常用的低温保护剂，辅以甲酰胺或乙酰胺，既可以达到玻璃化要求的高浓度，又可以降低DMSO的毒性^[16] 。玻璃化法保存的动脉内皮细胞部分连续，内皮细胞少量变性(线粒体肿胀)，平滑肌细胞少量变性坏死(内质网扩张，线粒体肿胀、嵴断裂或消失，核碎裂)，部分胶原纤维排列紊乱，可见融合现象，但是血管整体保存较好。玻璃化法保存的异体血管在4周时血清抗体大量产生并达到峰值，以后缓慢降低。相对于新鲜异体血管，其血清抗体产生较晚，峰值较低。本实验中玻璃化+辐照法预处理血管组和冷冻+辐照法预处理血管组不同，采用了玻璃化法+辐照对血管进行预处理，发现本组的血管经过此法处理后血管未发现裂纹和断裂现象，移植血管也未出现动脉瘤形成，并且吻合口狭窄不明显。移植后8周就出现了新生内膜和肌层组织，移植后12周可见血管内表面几乎被新生的中膜层和内膜层取代，原血管组织渐被吸收。电镜观察可见移植后1周血管内膜有零散内皮细胞覆盖，移植后8周可见内膜几乎内皮细胞完整覆盖，弹力纤维排列整齐完整，血管通畅率可达79.2%，因此玻璃化法保存的动脉异体移植的效果优于低温冷冻法保存的动脉异体移植。
本实验证实，经过玻璃化方法处理的同种异体动脉移植同种异体动脉达到了很高的远期通畅率，且方法简单易行，是否能应用于临床，还有待进一步研究。

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