高强度间歇运动改善骨骼肌损伤和提高大鼠运动能力的机制

doi:10.12307/2023.890

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5603-5609.doi: 10.12307/2023.890

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

高强度间歇运动改善骨骼肌损伤和提高大鼠运动能力的机制

张六妹1，刘菁菁1，林晓烨2，刘琳1，陆矫1，3

1南京体育学院运动健康学院，江苏省南京市 210014；2上海体育学院运动健康学院，上海市 200000；3江苏省体育与健康协同创新中心，江苏省南京市 210014

收稿日期:2022-10-13 接受日期:2022-12-14 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-01
通讯作者: 陆矫，博士，讲师，南京体育学院运动健康学院，江苏省南京市 210014；江苏省体育与健康协同创新中心，江苏省南京市 210014
作者简介:张六妹，女，1997年生，江苏省宿迁市人，汉族，南京体育学院在读硕士，主要从事运动人体科学生化方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32000829)，项目负责人：刘琳；江苏省高校自然科学研究(19KJB180019)，项目负责人：陆矫；江苏省体育与健康协同创新中心项目(JSCIC-YP21003)，项目负责人：陆矫；国家重点研发计划项目(2020YFC2007002)，项目负责人：陆矫

Mechanism by which high-intensity intermittent exercise improves skeletal muscle injury and enhances exercise capacity in rats

Zhang Liumei1, Liu Jingjing1, Lin Xiaoye2, Liu Lin1, Lu Jiao1, 3

1School of Sports and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China; 2School of Sports and Health, Shanghai University of Sport, Shanghai 200000, China; 3Jiangsu Collaborative Innovation Center for Sport and Health, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China

Received:2022-10-13 Accepted:2022-12-14 Online:2023-12-18 Published:2023-06-01
Contact: Lu Jiao, PhD, Lecturer, School of Sports and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center for Sport and Health, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Liumei, Master candidate, School of Sports and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 32000829 (to LL); Natural Science Research of Jiangsu Higher Education Institutions of China, No. 19KJB180019 (to LJ); Jiangsu Collaborative Innovation Center for Sport and Health, No. JSCIC-YP21003 (to LJ); National Key R&D Program of China, No. 2020YFC2007002 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

腺苷酸活化蛋白激酶：是一种细胞能量传感器，作为机体能量平衡和糖脂代谢的重要激酶参与多种生理过程的调节。腺苷酸活化蛋白激酶可通过调节多种信号通路以促进细胞能量代谢，如葡萄糖摄取和糖原合成的增加、脂肪酸氧化的增强等。
高强度间歇运动：是指反复多次地进行短暂高强度有氧运动，并以休息或低强度运动为间隔的一种运动方式。

背景：高强度间歇运动增强机体适应性，提高运动表现，其潜在机制可能与骨骼肌内腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的磷酸化水平有关。
目的：明确高强度间歇运动减轻力竭运动诱导的骨骼肌损伤与提高运动能力的作用，并阐明此过程中AMPK介导葡萄糖转运蛋白4的变化与作用机制。
方法：取45只雄性SD大鼠，采用随机数字表法分为对照组、力竭运动组、高强度间歇+力竭运动组，每组15只。对照组大鼠不进行任何干预；力竭运动组大鼠以25-28 m/min的速度在跑台上运动至力竭；高强度间歇+力竭运动组进行3 d的高强度间歇运动训练(每天以28 m/min的速度在跑台上运动4次，每次10 min，穿插10 min休息)，高强度间歇运动结束后24 h复制力竭运动模型；记录大鼠运动距离。力竭运动后，检测各组大鼠血浆肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平，TUNEL染色与Western Blot检测腓肠肌细胞凋亡情况，Western Blot检测腓肠肌组织内AMPK磷酸化水平，免疫荧光染色与Western Blot检测腓肠肌组织内葡萄糖转运蛋白4表达与易位情况。

结果与结论：①高强度间歇+力竭运动组大鼠的运动距离大于力竭运动组(P < 0.05)；与对照组比较，力竭运动组肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.05)；与力竭运动组比较，高强度间歇+力竭运动组肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平降低(P < 0.05)；②TUNEL染色与Western Blot检测显示，力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率大于对照组(P < 0.05)，高强度间歇+力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率小于竭运动组(P < 0.05)，3组间凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达无差异(P > 0.05)；③Western Blot检测显示，与对照组比较，力竭运动组AMPK和p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)；与力竭运动组比较，高强度间歇+力竭运动组AMPK蛋白表达降低(P < 0.05)，p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)；④免疫荧光染色与Western Blot检测显示，与对照组相比，力竭运动组骨骼肌纤维的细胞膜葡萄糖转运蛋白4表达增多，高强度间歇+力竭运动组骨骼肌纤维的质膜葡萄糖转运蛋白4表达增多；⑤结果显示，高强度间歇运动减轻力竭运动引起的肌纤维损伤，通过提高运动中AMPK磷酸化的水平与效率，促进骨骼肌中葡萄糖转运蛋白4的表达与易位，提高大鼠运动能力。

https://orcid.org/0000-0003-0121-2032(张六妹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 高强度间歇运动, 运动损伤, 力竭运动, 凋亡, 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK), 葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)

Abstract: BACKGROUND: The potential mechanism of high-intensity intermittent exercise to enhance body adaptability and improve exercise capacity may be related to the phosphorylation level of AMP-activated protein kinase (AMPK) in skeletal muscle.
OBJECTIVE: To clarify the role of high-intensity intermittent exercise in reducing skeletal muscle damage induced by exhaustion and improving exercise capacity and to elucidate the mechanism of AMPK-mediated changes in glucose transporter protein 4 during this process.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, exhaustive exercise group (EE group) and high-intensity intermittent exercise group (HIIT+EE group), with 15 rats in each group. No intervention was given in the control group. The EE group was exhausted on the treadmill at the speed of 25-28 m/min. The HIIT+EE group underwent high-intensity intermittent exercise: running on the treadmill, 4 times a day at the speed of 28 m/min, once for 10 minutes, with an interval of 10 minutes, for 3 consecutive days, and then experienced exhaustive exercise at 24 hours after the completion of high-intensity intermittent exercise to reproduce animal models of exhaustive exercise. The exercise distance of the rats was recorded. After exhaustive exercise, plasma creatine kinase and superoxide dismutase levels were measured in each group. Apoptosis of cells in gastrocnemius muscle was detected by TUNEL staining and western blot. AMPK phosphorylation in gastrocnemius muscle was detected by western blot. Glucose transporter protein 4 expression and translocation in gastrocnemius muscle was detected by immunofluorescence staining and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The exercise distance of rats in the HIIT+EE group was greater than that in the EE group (P < 0.05). The levels of creatine kinase and superoxide dismutase were increased in the EE group compared with the control group (P < 0.05). The levels of creatine kinase and superoxide dismutase were decreased in the HIIT+EE group compared with the EE group (P < 0.05). TUNEL staining and western blot results showed that the apoptotic rate of gastrocnemius cells in the EE group was higher than that in the control group (P < 0.05), while the apoptotic rate of gastrocnemius cells in the HIIT+EE group was less than that in the EE group (P < 0.05). There was no significant difference in the expression of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 between the three groups (P > 0.05). Western blot results showed that the expression of AMPK and p-AMPK protein was increased in the EE group compared with the control group (P < 0.05), while the expression of AMPK protein was decreased and the expression of p-AMPK protein was increased in the HIIT+EE group compared with the EE group (P < 0.05). Results from immunofluorescence staining and western blot assay indicated that the expression of cytosolic glucose transporter protein 4 was increased in skeletal muscle fibers in the EE and HIIT+EE groups compared with the control group. To conclude, high-intensity intermittent exercise attenuates muscle fiber damage induced by exhaustive exercise, promotes the expression and translocation of glucose transporter protein 4 in skeletal muscle by increasing the level and efficiency of AMPK phosphorylation during exercise, and thereby improves the exercise capacity of rats.

Key words: high-intensity intermittent exercise, sports injury, exhaustive exercise, apoptosis, AMP-activated protein kinase (AMPK), glucose transporter protein 4 (GLUT4)

中图分类号:

张六妹, 刘菁菁, 林晓烨, 刘琳, 陆矫. 高强度间歇运动改善骨骼肌损伤和提高大鼠运动能力的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5603-5609.

Zhang Liumei, Liu Jingjing, Lin Xiaoye, Liu Lin, Lu Jiao. Mechanism by which high-intensity intermittent exercise improves skeletal muscle injury and enhances exercise capacity in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5603-5609.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 45只大鼠全部进入结果分析。
2.2 高强度间歇运动对大鼠运动能力和骨骼肌损伤的影响见图1。

高强度间歇+力竭运动组大鼠的运动距离明显远于力竭运动组(P < 0.05)，提示高强度间歇运动干预后，大鼠的运动能力提高，见图1A。与对照组比较，高强度间歇+力竭运动组和力竭运动组大鼠腓肠肌ATP浓度下降，高强度间歇+力竭运动组和力竭运动组间ATP浓度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1B。血糖水平结果与ATP浓度变化趋势一致，与对照组比较，高强度间歇+力竭运动组和力竭运动组大鼠血糖水平明显下调(P < 0.05)，见图1C。与对照组比较，力竭运动组大鼠血浆肌酸激酶和超氧化物歧化酶水平显著升高(P < 0.05)；与力竭运动组比较，高强度间歇+力竭运动组大鼠血浆酸激酶和超氧化物歧化酶水平显著降低(P < 0.05)，见图1D，E。苏木精-伊红染色显示，力竭运动组腓肠肌组织部分肌纤维表现出较高肿胀，高强度间歇+力竭运动组这些现象得到改善，见图1F。
2.3 高强度间歇运动对大鼠腓肠肌纤维凋亡情况的影响如图2所示，在腓肠肌横切切片中，力竭运动组存在更多的梅红色细胞核；在腓肠肌骨骼肌纵切片中，一条肌纤维中存在多个核，部分核呈现梅红色荧光信号。与力竭运动组相比，高强度间歇+力竭运动组存在较少的梅红色细胞核。力竭运动组与高强度间歇+力竭运动组细胞核大部分位于细胞间质，少数位于肌细胞内。

Bax是促凋亡基因，Bcl-2和Bax是相互对立的一对基因，Bcl-2抑制凋亡。Western Blot检测结果显示，3组大鼠腓肠肌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2比值比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 高强度间歇运动对大鼠腓肠肌AMPK及磷酸化的影响 AMPK是机体内最重要的代谢调控蛋白之一，被激活后可以通过介导GLUT4信号通路降低细胞凋亡。由图4可见，与对照组比较，力竭运动组大鼠腓肠肌中AMPK和p-AMPK蛋白表达均显著升高(P < 0.05)；与力竭运动组相比，高强度间歇+力竭运动组大鼠腓肠肌p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)，AMPK蛋白表达降低(P < 0.05)。

2.5 高强度间歇运动对大鼠腓肠肌GLUT4的影响 GLUT4是一种跨膜结构域蛋白，细胞内GLUT4蛋白的总量是维持体内葡萄糖稳态的关键因素。Western Blot检测结果如图5所示，与对照组相比，力竭运动组和高强度间歇+力竭运动组大鼠腓肠肌中GLUT4蛋白总水平明显升高，3组间质膜GLUT4蛋白水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

为了评价GLUT4易位，进行了GLUT4和WGA免疫荧光检测。GLUT4呈现红色荧光信号，在骨骼肌细胞的细胞质和细胞膜中均有分布；肌细胞膜为绿色荧光信号。当GLUT4转为至细胞膜时，红色荧光信号与WGA绿色叠加形成橘红色荧光信号，因此，GLUT4和WGA共定位代表了质膜GLUT4。免疫荧光染色结果见图6，对照组胞质与胞膜均可见红色荧光信号；与对照组相比，力竭运动组骨骼肌纤维中位于细胞膜的GLUT4增多，说明力竭运动促进了GLUT4的易位；此外，高强度间歇+力竭运动骨骼肌纤维的质膜GLUT4含量有增多趋势。

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引言

高强度间歇运动是指短时间的剧烈运动，中间穿插周期性的休息或低强度运动，这可以被视为骨骼肌纤维的“应激期”和“恢复期”[1]。在高强度运动诱导的应激期内，机体承受能量危机、缺血缺氧和氧化应激等刺激后[2]，可促进内源性因子释放[3-4]，协调各器官系统维持运动所需的高能耗，应对运动诱导的不良刺激。在恢复阶段，这些负性条件得以逆转，此外，应激期的保护效应可持续至恢复期，进一步促进机体的恢复作用。在反复应激与恢复的作用下，机体可迅速提高运动适应性[5]，增强运动能力。已有证据表明，一次高强度间歇运动训练虽然能够为机体产生保护效应[6-7]，但持续时间有限。但也有证据显示，3-5 d高强度间歇运动训练对机体产生的保护效应可以持续14 d[8-9]。周期性高强度间歇运动训练主要用于提高运动员的心肺耐力和最大摄氧量[10-11]。
此外，进一步的研究发现，高强度间歇运动训练后的运动表现提高与骨骼肌适应变化有关。高强度间歇运动可提高骨骼肌的代谢能力，使其结构与功能发生适应性变化，增强细胞在运动过程中能量物质的周转[12]，维持细胞内ATP的水平，促进骨骼肌的舒缩功能。然而，其潜在的分子生物学机制还有待进一步研究。
骨骼肌细胞内能量水平的调节由腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化水平控制。AMPK可通过调节多种信号通路以促进细胞能量代谢，如葡萄糖摄取和糖原合成的增加[13]、脂肪酸氧化的增强等[14]。在运动过程中，骨骼肌细胞能量消耗是促进AMPK表达的重要因素，并且AMPK的表达随运动强度与运动总量的升高而增加。已有的研究表明，运动诱导的AMPK表达上调与细胞内ATP水平的动态平衡有关，其潜在机制与AMPK介导葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)促进葡萄糖转运有关。在长时间的高强度运动中，由于肌糖原耗竭，骨骼肌对血液中葡萄糖的摄取与利用是维持肌肉收缩所需能量消耗的重要调节机制，因此，AMPK介导GLUT4促进骨骼肌葡萄糖转运是维持细胞内ATP水平的前提，是提高运动能力的重要保障。研究表明。运动可以促进GLUT4的大量表达和转位[15-17]，提高心肌对葡萄糖的摄取能力，减轻心肌损伤与细胞凋亡[18]。同时也有研究表明，运动通过促进GLUT4的表达和转位满足运动过程中骨骼肌能量需求的消耗[19]。因此，在高强度间歇运动诱导的骨骼肌适应中，AMPK的水平变化能否通过介导GLUT4的表达与转位，增强骨骼肌细胞摄取葡萄糖的能力，提高运动表现，改善骨骼肌细胞损伤与凋亡还需要进一步的研究。此次实验旨在明确高强度间歇运动减轻力竭运动诱导的骨骼肌损伤及提高运动能力的作用，研究在高强度间歇运动诱导的骨骼肌适应中，AMPK介导GLUT4的变化与作用机制，为减轻运动损伤、规避运动风险提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机动物实验，组间比较采用one-way ANOVA检验，两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2021年8月至2022年7月在南京体育学院生物化学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取体质量150-170 g的雄性SD大鼠45只，由上海斯莱克动物实验中心提供，许可证号：SCXK(沪)2017-0005。所有大鼠在室温为(24±2) ℃/相对湿度为30%-40%的自然光照环境下分笼饲养，饲养期间自由饮食饮水。大鼠膳食购自南京江宁区青龙山实验动物繁殖场。实验经南京体育学院科学研究伦理委员会批准(批号：GZRDW-2020-02)。
1.3.2 主要试剂与仪器肌酸激酶和总超氧化物歧化酶测定试剂盒(南京建成科技有限公司)；ATP检测试剂盒(碧云天)；山羊抗小鼠单克隆抗体Alexa Fluor® 594共轭的二抗、鼠抗单克隆抗体Bax、Bcl-2(美国Abcam)；鼠抗单克隆抗体GLUT4、兔抗单克隆抗体GAPDH(美国PeproTech)；兔抗单克隆抗体Na，K-ATpase、抗小鼠IgG、抗兔IgG(美国CST)(美国CST)；小型动物运动跑台(杭州段氏制作，型号为DSPT-216)；血糖计(型号为586，Yuwell)；倒置显微镜(ZEISS，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与训练方案取45只雄性SD大鼠，采用随机数字表法分为对照组、力竭运动组、高强度间歇+力竭运动组，每组15只：①对照组常规饲养，不进行任何干预；②力竭运动组适应性喂养1周后，连续3 d进行适应性跑台运动，运动速度为10 m/min，30 min/d；随后先进行速度为15 m/min、持续10 min的跑台热身运动，再将跑台运动速度递增至25-28 m/min，运动至力竭，建立一次性力竭运动模型；③高强度间歇+力竭运动组适应性喂养1周后，连续3 d进行适应性跑台运动，运动速度为10 m/min，30 min/d；随后进行连续3 d的高强度间歇运动训练，运动速度为28 m/min，以10 min运动、10 min休息为一组，重复4组；高强度间歇运动训练24 h后，复刻一次性力竭运动模型。正式运动期间记录大鼠运动距离。

力竭运动标准：大鼠腹部贴地，四肢瘫软，翻正反射暂时消失。

1.4.2 动物取材力竭运动后，腹腔注射5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，打开腹腔，下腔静脉取血5 mL，静置后1 000 r/min离心10 min，取血浆，-80 ℃冰箱保存。取血后，每组随机取7只大鼠进行灌注固定，打开胸腔，暴露心脏，滴注生理盐水约250 mL，并于输液软管处缓慢注入1%肝素1 mL，剪断下腔静脉，待流出液基本无血色后，继续滴注40 g/L多聚甲醛约350 mL。取大鼠腓肠肌，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，用于常规石蜡包埋，制作切片。剩余每组大鼠取新鲜腓肠肌，生理盐水漂洗，滤纸吸干，锡纸包裹投入液氮冷冻，转至-80 ℃冰箱保存待用。
1.4.3 血糖及血浆肌酸激酶和超氧化物歧化酶水平测定取大鼠尾静脉血液样本，使用血糖计检测血糖。取肌酸激酶和总超氧化物歧化酶测定试剂盒，加入样本和混合试剂，混匀，37 ℃孵育20 min，3 500 r/min离心10 min，45 ℃水浴15 min，设置660 nm波长、0.5 cm光径，通过比色法测定血浆肌酸激酶和超氧化物歧化酶水平。
1.4.4 腓肠肌ATP浓度检测使用ATP检测试剂盒检测大鼠骨骼肌中ATP浓度。取腓肠肌组织50 μg剪碎，匀浆，4 ℃下12 000×g离心5 min，取上清。按1∶4将ATP检测试剂稀释液稀释为ATP检测工作液，在96孔板加100 μL ATP检测工作液，室温放置3-5 min，加上20 μL样品或标准品，采用萤火虫荧光素酶法检测组织中ATP浓度；并采用BCA蛋白定量法测定组织中蛋白浓度，以测定单位组织内ATP水平。ATP浓度=ATP含量/蛋白浓度×100%。
1.4.5 腓肠肌形态观察腓肠肌组织切片厚度为4 μm。腓肠肌组织切片常规脱蜡至水，苏木精染液浸染5 min，流水冲洗3 min，1%盐酸乙醇分化3 s。1%伊红染色8 min，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。高倍显微镜镜下(×400)观察并摄片。
1.4.6 TUNEL染色观察腓肠肌细胞凋亡腓肠肌组织切片常规脱蜡复水，PBS洗涤后滴加TUNEL检测液，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，WGA染液浸染，37 ℃恒温孵育1 h；PBS冲洗3次，DAPI染核10 min，流水冲洗3次，最后使用防荧光淬灭封固。每组随机选取5个样本，每个样本有5个视野，捕获的25个不同的高倍图像(×400)，通过计数场内梅红色阳性细胞核数量评价TUNEL阳性率。TUNEL阳性率=阳性细胞核个数/细胞核总数×100%。
1.4.7 Western Blot检测腓肠肌组织内AMPK磷酸化水平及GLUT4表达与易位情况采用细胞膜蛋白提取试剂盒提取腓肠肌纤维膜蛋白。取约100 mg腓肠肌组织剪碎，匀浆，4 ℃下14 000×g离心30 min，吸取上清。加入膜蛋白抽提试剂约200 µL，振荡5 s，冰浴5-10 min，4 ℃下14 000×g离心5 min，收集上清，即为细胞膜蛋白。另取约40 mg腓肠肌组织剪碎，匀浆，4 ℃下12 000×g离心10 min，吸取上清，提取腓肠肌组织总蛋白。采用BCA蛋白分析试剂盒定量全蛋白和膜蛋白。提取的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上用SDS-PAGE分离，转印到PVDF膜上，牛奶封闭1 h，4 ℃下PVDF膜在与特定的一级抗体孵育过夜：AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GLUT4(1∶1 000)、GAPDH
(1∶30 000)、Na，K-ATpase(1∶1 000)。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应二抗(抗小鼠IgG，1∶1 000；抗兔IgG，1∶1 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜3次后滴加发光液，Bio-Rad化学发光成像仪进行曝光显影，Image Lab图像分析软件测定条带灰度值。
1.4.8 免疫荧光染色采用WGA染色联合GLUT4免疫荧光法分析GLUT 4的表达。组织切片脱蜡脱水后，切片用10%山羊血清封闭1 h，滴加GLUT4抗体(鼠抗单克隆抗体，1∶300)，在4 ℃下孵育过夜，次日PBS洗3次，每次5 min，Alexa Fluor® 594共轭的二抗山羊抗小鼠单克隆抗体；1∶500)避光滴加在组织上，27 ℃左右孵育1 h，WGA(1 μg/μL)在27 ℃左右孵育1 h。防荧光淬灭剂封固。
1.5 主要观察指标各组大鼠血浆肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平，腓肠肌细胞凋亡情况，腓肠肌组织内AMPK磷酸化水平，腓肠肌组织内GLUT4表达与易位情况。
1.6 统计学分析用ImageJ软件进行分析图像。所有实验数据由GraphPad Prism 8软件处理，结果以均数±标准误表示，组间比较采用one-way ANOVA检验，两两比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经南京体育学院生物统计学专家审核。

讨论

“运动是良药”，科学合理的运动是促进健康、治疗慢性疾病、提高生活质量的有效手段，但过度的运动也会对机体造成损伤。研究表明，马拉松运动后部分的运动员出现心肌损伤[20]，少数运动员偶发运动性心肌猝死。同时也有研究表明，不科学的运动可对骨骼肌产生不良影响，包括延迟性肌肉酸痛[21]、横纹肌溶解症等[22]。因此，如何正确地规避风险是目前相关领域的研究重点。此次实验结果显示，力竭运动造成骨骼肌损伤，力竭运动使血浆肌酸激酶水平大幅度提高，骨骼肌严重肿胀。此外有文献发现，过度运动后肌组织TUNEL染色细胞核阳性个数增多[13]，提示肌细胞核发生凋亡。细胞凋亡的生化特征之一是染色质裂解成单个或多个寡核体长度的片段而在DNA上产生游离的3，-OH末端。TUNEL染色通过标记DNA暴露的末端使含有碎片DNA的核可视化，WGA可与细胞膜上的N-乙酰基-β-D-葡糖胺基残基和N-乙酰基-β-D-葡糖胺低聚物偶联，标记哺乳动物细胞的细胞膜，区分胞内、胞外细胞核。此外，骨骼肌纤维呈长圆柱形，一条肌纤维内含多个细胞核，核呈扁椭圆形，位于肌膜下方。因此，横切片可以辨别骨骼肌细胞核和间质细胞核，纵切片可以看出一条肌纤维的上的细胞核是否全部损伤。腓肠肌切片中断裂的细胞核经TUNEL染色呈亮红色，与经DAPI标记后形成蓝紫色荧光信号的细胞核叠加形成梅红色荧光信号。此次实验TUNEL染色结果表明，力竭运动使腓肠肌TUNEL染色阳性细胞核个数显著增加，但骨骼肌纤维是一种多核细胞，单个肌纤维有几十个甚至上百个细胞核，单个视野下个别核TUNEL染色阳性并不能说明肌细胞核凋亡。通过检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平能够更加准确地反映细胞是否凋亡，因为Bcl-2可竞争性与Bax结合形成异源二聚体，阻止线粒体通透性转换孔开放，抑制细胞凋亡。因此，检测Bax、Bcl-2的表达水平，计算两者的比值可进一步反映肌纤维的凋亡情况。此次实验结果显示，力竭运动后，骨骼肌内Bax、Bcl-2的蛋白表达水平和两者间的比值均无显著变化，提示力竭运动所致的骨骼肌损伤不会诱导细胞凋亡的发生。综上，此次实验表明，力竭运动可导致局部骨骼肌细胞核出现DNA断裂现象，但未引起细胞凋亡；经高强度间歇运动干预后，力竭运动所致的这些骨骼肌损伤可明显得以缓解。
高强度间歇运动是一种短时高强度运动，穿插完全休息或低强度运动形成间歇期的运动形式，其运动强度从70%VO2 max-250%VO2 max不等，间歇时间可横跨几秒到数分钟[1]。通常可以根据运动强度与间隔持续时间分为冲刺间歇运动和高强度间歇运动[23]。冲刺间歇运动的运动强度≥100%VO2 max[24]，持续与间隔时间相对较短，多用于竞技体育，可迅速提高糖酵解相关酶活性[25]，提升运动员体育竞技时的峰值功率和平均功率[26-27]，是改善无氧工作能力的重要手段。而高强度间歇运动的强度相对较低，在75%VO2 max-100%VO2 max范围内，持续与间隔时间相对较长，常作为大众体育快速提高运动能力的训练方案。研究表明运动使血流加速、血流剪切力增加，内源性保护机制被激活[28]，促进血管内皮细胞分泌运动因子，通过外泌体经血液循环运输至心脏，被心肌细胞摄取，发挥对心脏的保护作用。相较于其他运动，高强度间歇运动可以提高机体心肌的适应性[29]。此次实验结果表明，高强度间歇运动可以提高大鼠运动能力，改善肌细胞核损伤，其机制可能与高强度间歇运动促进了机体内源性保护物质的释放有关。此外，骨骼肌细胞本身也存在自我调节机制，应对高强度间歇运动诱导的相对缺氧和能量危机。
AMPK被称为“细胞能量感受器”，是细胞在应对能量危机时诱导其做出适应性调节的重要分子。当细胞内ATP水平下调，AMP/ATP和/或ADP/ATP比值升高，AMPK磷酸化[30]，通过多种信号通路发挥生物功能。大量研究表明，运动可诱导AMPK磷酸化水平升高，并与运动强度和运动量呈正相关[31]。此次实验验证了力竭运动显著提高了骨骼肌纤维AMPK、p-AMPK表达水平，经高强度间歇运动干预后，大鼠在后续的力竭运动中p-AMPK表达进一步提高，并出现AMPK磷酸化效率显著增强的现象，这可能是因为：高强度间歇运动使大鼠运动能力升高，增加了力竭运动的时程，诱导AMPK磷酸化水平的进一步升高；另一方面，3 d的高强度间歇运动训练可能使细胞内AMPK产生适应性变化，在后续力竭运动中迅速使AMPK磷酸化，缓解后续大强度运动对机体产生的刺激。出于肌细胞收缩对ATP的依赖，运动诱导骨骼肌AMPK磷酸化水平的上调主要是用于应对运动所致的能量危机[32]。
机体在运动过程中尤其是应对高强度长时间的运动时，骨骼肌需要大量的能量周转来维持肌细胞的收缩与细胞内离子的稳态[33]，因此，机体需要葡萄糖作为快速供能的能源物质，维持肌细胞内ATP含量，促进运动过程中骨骼肌细胞的舒缩。AMPK介导的葡萄糖转运在此过程中扮演了重要的角色[34]，并且在细胞内糖原耗竭的情况下尤为重要。运动伊始，最先支持肌肉收缩的能量来源是肌纤维中储存的糖原，随着糖原储存的减少，肌组织逐渐增加对血糖的吸收以维持能量供应，在糖原消耗殆尽的情况下，血糖成为维持肌肉功能的必然选择。此次实验结果显示，高强度间歇运动的干预并不能提高力竭运动后骨骼肌细胞内ATP的水平，这貌似与高强度间歇运动提高AMPK磷酸化效率现象相悖。但考虑到大鼠力竭时，血糖水平显著降低，体内能源物质也接近耗竭状态，因而力竭运动中骨骼肌内的ATP水平也相应地显著下降。但有意思的是，高强度间歇运动干预非但不能改善力竭后骨骼肌内ATP的水平，反而使其下降，这表明高强度间歇运动干预可促进骨骼肌内ATP水平的进一步降低，结合高强度间歇运动减轻力竭运动导致的骨骼肌损伤，高强度间歇运动通过改善骨骼肌损伤延长力竭时程，提高运动表现力，促进细胞内ATP的进一步消耗。
虽然因力竭因素，无法直接获得骨骼肌中AMPK促进ATP生成的证据，但可以通过检测AMPK介导的葡萄糖转运间接验证AMPK对骨骼肌能量周转的调控。骨骼肌细胞对血液中葡萄糖的摄取受到肌细胞膜对葡萄糖通透性的限制，GLUT4是骨骼肌细胞膜上重要的葡萄糖转运因子，在AMPK磷酸化水平的调控下，对骨骼肌摄取血液中葡萄糖起重要调节作用。GLUT4主要存在于骨骼肌细胞、心肌细胞和脂肪细胞的胞内囊泡中，细胞膜上水平较低。有研究表明，运动过程可通过激活AMPK途径促进葡萄糖运输和GLUT4的转位。运动时AICAR激活AMPK[35]，进而通过诱导其下游效应物的表达，引起GLUT4表达量增加，促使GLUT4转运至细胞膜上，进而增加骨骼肌对葡萄糖的摄取。此外有研究表明，AMPK、GLUT4参与细胞凋亡的调节。CHEN等[36]研究证明，右旋美托咪啶通过激活MIF/AMPK/GLUT4轴增加葡萄糖转运蛋白和葡萄糖代谢，抑制活性氧产生和氧化应激，减轻心肌细胞的凋亡。王瑞瑶等[37]研究发现，小檗碱通过调节AMPK-AS160-GLUT4通路改善心肌细胞葡萄糖代谢障碍，抑制高糖环境诱导的心肌细胞凋亡。大量研究表明，运动可以通过激活AMPK提高GLUT4的整体表达水平[38-40]，同时促进GLUT4易位至细胞膜上[41]，增强骨骼肌纤维对葡萄糖的摄取，可维持能量代谢水平，提高运动能力。此次实验结果表明，GLUT4的表达与AMPK的磷酸化水平相一致，即力竭运动可以通过提高AMPK磷酸化的水平促进GLUT4的表达与转位；而经高强度间歇运动干预后，AMPK磷酸化的水平与效率进一步提高，同时也显著提升了GLUT4整体表达水平与转位。这些结果提示，高强度间歇运动通过促进AMPK磷酸化提高了骨骼肌在力竭运动中对葡萄糖的摄取能力，促进能量物质的周转，维持ATP水平，稳定骨骼肌的舒缩，延长了力竭运动的时程。
综上所述，冲刺间歇运动可显著减轻力竭运动所致骨骼肌细胞损伤；冲刺间歇运动诱导AMPK发生适应性变化，提高后续的力竭运动中AMPK磷酸化的水平与效率，并通过促进骨骼肌中GLUT4的表达与转位，提高大鼠力竭运动的时程。但AMPK能够通过多种信号通路参与细胞代谢，此次实验仅仅探讨了AMPK介导的GLUT4信号通路抑制骨骼肌损伤的作用，并没有对其他信号通路进行抑制，使AMPK的作用存在一定的局限性。在今后的研究中会对AMPK参与的其他信号通路抑制，单独进行AMPK介导GLUT4转位改善骨骼肌损伤，为其提供更完善的实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高强度间歇运动改善骨骼肌损伤和提高大鼠运动能力的机制

Mechanism by which high-intensity intermittent exercise improves skeletal muscle injury and enhances exercise capacity in rats

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