半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达

doi:10.12307/2023.954

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5610-5615.doi: 10.12307/2023.954

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半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达

梁卫东1，张树文2，蔡晓宇1，荀传辉1，盛军1，曹锐1，郝宏刚1，盛伟斌1，3，4

1新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区人民医院骨科脊柱二病区，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；3新疆地区高发疾病研究教育部重点实验室(新疆医科大学)，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；4新疆骨科疾病临床医学研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2022-10-08 接受日期:2022-12-12 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-01
通讯作者: 梁卫东，男，1983年生，新疆维吾尔自治区阿勒泰地区人，蒙古族，2010年新疆医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事椎间盘退变方面的研究。张树文，男，1992年生，新疆维吾尔自治区博湖县人，汉族，2021年新疆医科大学毕业，博士，医师，主要从事椎间盘退变方面的研究。
作者简介:盛伟斌，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆地区高发疾病研究教育部重点实验室(新疆医科大学)，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆骨科疾病临床医学研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2017D01C326)，项目负责人：梁卫东

Differentially expressed galectin-1 during intervertebral disc degeneration

Liang Weidong1, Zhang Shuwen2, Cai Xiaoyu1, Xun Chuanhui1, Sheng Jun1, Cao Rui1, Hao Honggang1, Sheng Weibin1, 3, 4

1Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Spine Surgery II, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China;

Received:2022-10-08 Accepted:2022-12-12 Online:2023-12-18 Published:2023-06-01
Contact: Liang Weidong, Master, Associate chief physician, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Key Laboratory of the Ministry of Education for High Incidence Diseases in Xinjiang Region (Xinjiang Medical University), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Xinjiang Clinical Research Center of Orthopaedic Diseases, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Zhang Shuwen, MD, Physician, Department of Spine Surgery II, People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Sheng Weibin, MD, Chief physician, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Key Laboratory of the Ministry of Education for High Incidence Diseases in Xinjiang Region (Xinjiang Medical University), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Clinical Research Center of Orthopaedic Diseases, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Youth Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region Natural Science Foundation, No. 2017D01C326 (to LWD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘退变：椎间盘中的髓核组织、纤维环及软骨终板随着年龄、遗传、环境及外界干扰等因素引起的细胞外基质合成、分解代谢异常导致聚合蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白分解代谢增加的病理现象，是诸多椎间盘相关疾病的前提和基础。
半乳糖凝集素：属于动物凝集素家族中的一员，存在于从线虫、海绵到哺乳动物等各种动物体内，参与细胞黏附、生长调节和免疫反应等多种生物学功能，其中半乳糖凝集素1已被证明在调节细胞生长、黏附、迁移、细胞凋亡、免疫调节中扮演重要角色。

背景：半乳糖凝集素1调控诸多组织、器官的生理病理过程，其与椎间盘退变的关系尚不明确。
目的：分析半乳糖凝集素1在不同退变程度椎间盘中的差异性表达，并探讨其对大鼠椎间盘退变的影响。
方法：收集新疆医科大学第一附属医院15例患者的椎间盘标本，采用Pfirrmann分级后检测半乳糖凝集素1在不同退变程度椎间盘中的差异性表达。建立SD大鼠腰椎退变模型，随机分为3组，造模后隔日进行干预，对照组、模型组分别尾静脉注射生理盐水，半乳糖凝集素1干预组尾静脉注射半乳糖凝集素1重组蛋白，1次/d，各组均干预7 d；造模术后8周使用Bruker Pharmascan 7.0T核磁共振仪进行Pfirrmann分级后观察椎间盘的病理变化，并检测椎间盘中半乳糖凝集素1、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达。

结果与结论：①qRT-PCR、免疫组织化学染色及Western Blot结果提示随着椎间盘退变的加重，半乳糖凝集素1表达逐渐减少，3组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；②术后8周，大鼠腰椎MRI提示半乳糖凝集素1干预可降低改良Pfirrmann分级；苏木精-伊红染色提示半乳糖凝集素1干预减少椎间盘退变的病理改变；免疫组化及Western blot结果提示半乳糖凝集素1干预在增加椎间盘中半乳糖凝集素1表达的同时减少Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的降解，3组之间相比差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果提示随着椎间盘退变程度的加重半乳糖凝集素1表达逐渐减少；半乳糖凝集素1干预可以延缓大鼠椎间盘针刺退变模型的进展。

https://orcid.org/0000-0002-2542-2335(梁卫东)；https://orcid.org/0000-0003-2360-7326(张树文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 半乳糖凝集素1, 椎间盘, 退变, 差异表达, Ⅱ型胶原, 蛋白聚糖

Abstract: BACKGROUND: Galectin-1 is involved in the physiological and pathological processes of many tissues and organs, but its relationship with intervertebral disc degeneration remains unclear.
OBJECTIVE: To analyze the differential expression of galectin-1 in intervertebral discs and to investigate the effect of galectin-1 on intervertebral disc degeneration in rats.
METHODS: Intervertebral disc specimens were collected from 15 patients in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University. Pfirrmann grading was used to definite the degree of degeneration, and the differential expression of galectin-1 in intervertebral discs with different degrees of degeneration was detected. A lumbar degeneration model was established in Sprague-Dawley rats. The model rats were randomly divided into control group, model group and galectin-1 group. Interventions were carried out on alternate days after modeling. Control and model groups were given normal saline injection into the tail vein, while galectin-1 recombinant protein was injected into the tail vein of the galectin-1 group once a day for 7 days. Eight weeks after modeling, pathological changes in the intervertebral disc were observed after Pfirrmann grading using Bruker Pharmascan 7.0T MRI and the expression of galectin-1, type II collagen and Aggrecan in the disc was examined.
RESULTS AND CONCLUSION: qRT-PCR, immunohistochemical staining and western blot analysis indicated that galectin-1 expression decreased gradually with the aggravation of intervertebral disc degeneration, and there were significant differences among three groups (P < 0.05). At 8 weeks after modeling, MRI scan of the rat lumbar vertebra results indicated that galectin-1 could reduce the modified Pfirrmann grade of intervertebral disc degeneration, and hematoxylin-eosin staining suggested that galectin-1 could reduce the pathological manifestations of intervertebral disc degeneration. Immunohistochemistry and western blot results suggested that intervention with galectin-1 could increase the expression of galectin-1 in the intervertebral discs while reducing the degradation of type II collagen and Aggrecan, and there were significant differences among groups (P < 0.05). To conclude, the expression of galectin-1 gradually decreases with the aggravation of intervertebral disc degeneration, and the intervention with galectin-1 delays the progression of intervertebral disc degeneration in rats.

Key words: galectin-1, intervertebral disc, degeneration, differential expression, type II collagen, Aggrecan

中图分类号:

梁卫东, 张树文, 蔡晓宇, 荀传辉, 盛军, 曹锐, 郝宏刚, 盛伟斌. 半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5610-5615.

Liang Weidong, Zhang Shuwen, Cai Xiaoyu, Xun Chuanhui, Sheng Jun, Cao Rui, Hao Honggang, Sheng Weibin. Differentially expressed galectin-1 during intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5610-5615.

图/表（结果） 8

2.1 人椎间盘标本RT-PCR检测结果无退变组、中度退变组及重度退变组椎间盘髓核组织中Gal-1基因的相对表达量分别为1.073±0.381，0.692±0.711和0.362±0.330，多组之间比较差异有显著性意义(F=236.900，P < 0.001)。其中无退变组与中度退变组、重度退变组比较差异均有显著性意义(q=16.260，P < 0.001；q=30.320，P < 0.001)，中度退变组与重度退变组比较差异有显著性意义(q=17.220，P < 0.001)。结果见图1。

2.2 人椎间盘标本免疫组化染色结果无退变组、中度退变组及重度退变组椎间盘髓核组织中Gal-1蛋白免疫组织化学半定量结果分别为0.965±0.135，0.830±0.190和0.775±0.544，多组之间比较差异有显著性意义(F=50.710，P < 0.001)。其中无退变组与中度退变组、重度退变组比较差异均有显著性意义(q=10.140，P < 0.001；q=14.220，P < 0.001)，中度退变组与重度退变组比较差异有显著性意义(q=4.993，P < 0.01)。结果见图2，样本图片均来源于人腰椎椎间盘标本。

2.3 人椎间盘标本Western blot 检测结果无退变组、中度退变组及重度退变组椎间盘髓核组织中Gal-1蛋白的相对表达量分别为1.000±0.318，0.682±0.374和0.626±0.056，多组之间比较差异有显著性意义(F=121.000，P < 0.001)。其中无退变组与中度退变组、重度退变组比较差异均有显著性意义(q=17.350，P < 0.001；q=20.390，P < 0.001)，中度退变组与重度退变组比较差异无显著性意义(q=3.047，P=0.159)。结果见图3。

2.4 加强型MRI检测术后8周大鼠腰椎造模节段MRI T2加权像提示，随着退变等级的加重，Pfirrmann分级逐渐增高，Pfirrmann分级由3位医师进行评估，数据收集后，对评估结果不同的椎间盘进行讨论，最终共同确定其等级。其中对照组MRI 提示椎间盘呈高信号，椎间隙高度正常，椎间盘纤维环、髓核组织界限明显；模型组椎间盘呈低信号，椎间隙变窄，椎间盘纤维环、髓核界限不清；Gal-1干预组椎间盘呈中等信号，椎间隙高度保持正常，椎间盘纤维环、髓核界限模糊。结果见图4。

2.5 大鼠椎间盘苏木精-伊红染色结果造模术后8周苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组椎间盘形态正常，髓核及纤维环结构分明，细胞分布均匀；模型组椎间盘结构紊乱，髓核与纤维环结构不清晰，细胞角增长组明显减少；Gal-1蛋白干预后，椎间盘结构较模型组明显改善，结构相对清晰，但髓核细胞较正常组减少，见图5。

2.6 免疫组化检测大鼠椎间盘Gal-1的表达造模术后8周免疫组化结果显示，对照组、模型组、Gal-1干预组中Gal-1蛋白免疫组织化学半定量结果分别为1.055±0.696，0.359±0.371，0.684±0.325，多组之间比较差异有显著性意义(F=200.900，P < 0.001)，其中Gal-1干预组与模型组相比差异有显著性意义(q=13.23，P < 0.001)。结果见图6。

2.7 Western blot检测蛋白聚糖、Gal-1、Ⅱ型胶原蛋白的表达大鼠髓核组织Gal-1在对照组、模型组和Gal-1干预组中的相对表达量分别为1.000±0.828，0.172±0.229和0.771±0.599，多组之间比较差异有显著性意义(F=53 743.000，P < 0.001)。其中对照组与模型组之间比较差异有显著性意义(q=449.000，P < 0.001)，Gal-1干预组与模型组相比差异有显著性意义(q=324.600，P < 0.001)。
Ⅱ型胶原、蛋白聚糖在不同组表达有明显差异。Ⅱ型胶原在对照组、模型组和Gal-1干预组的相对表达量分别为1.000±0.610，0.390±0.407和0.593±0.202，多组之间比较差异有显著性意义(F=3 385.000，P < 0.001)。其中对照组与模型组之间比较差异有显著性意义(q=114.200，P < 0.001)，Gal-1干预组与模型组相比差异有显著性意义(q=37.930，P < 0.001)。
蛋白聚糖在对照组、模型组和Gal-1干预组的相对表达量分别为1.000±0.457，0.543±0.244和0.756±0.213，多组之间比较差异有显著性意义(F=3 141.000，P < 0.001)。其中对照组与模型组之间比较差异有显著性意义(q=112.000，P < 0.001)，Gal-1干预组与模型组相比差异有显著性意义(q=52.250，P < 0.001)。见图7，8。

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引言

腰痛是广泛的全球性健康问题，据报道有70%-80%的人会出现不同程度的腰痛，并且随着人口老龄化及疾病的年轻化呈明显上升趋势，不仅对患者产生巨大的生理及心理负担，而且带来了巨大的经济和社会负担[1-2]。近年来，研究逐渐表明腰背部疼痛与椎间盘退变的发生密切相关，约40%的腰痛直接由椎间盘退变所致[3]。因此，对椎间盘退变发病机制的充分理解以及对其发生、发展因素的有效干预可以减少椎间盘退变疾病的发病率，从而降低其对社会经济的影响。
迄今为止，学者已经证实椎间盘退变的发病机制是多因素的，不仅与遗传有关，而且与日常生活习惯、环境等密不可分。尽管学者深入探讨了椎间盘退变的机制，但是椎间盘退变的防治仍然任重而道远。既往研究中强调基质金属蛋白酶、解聚素、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶和蛋白聚糖酶在人类椎间盘退变的过程中扮演重要角色；在椎间盘退变的发病机制中变性的细胞外基质是由蛋白水解酶基质金属蛋白酶家族和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶家族进行分解代谢；在稳态条件下，椎间盘组织中基质金属蛋白酶的活性很低，但是蛋白酶活性可以由白细胞介素1、肿瘤坏死因子等促炎因子激活从而促使基质金属蛋白酶的形成及加速细胞外基质的分解代谢[4]。
半乳糖凝集素(Galectins)是动物凝集素家族中的一员，存在于从线虫、海绵到哺乳动物等各种动物体内，参与细胞黏附、生长调节和免疫反应等多种生物学功能[5]。目前，已发现 14个 Galectins 家族成员，人体至少存在 12 种，其结构上包含有一段长约 135 个氨基酸的糖类识别区，对β-半乳糖苷具有特殊的亲和力。Galectins作为凝集素家族的一员日益受到学者关注，由于其分布广泛，且参与细胞的黏附、增殖、凋亡和炎症反应，因此被用于探讨多种疾病的生理病理过程，也很有可能成为脊柱退行性疾病预防和治疗新的作用靶点[6]。随着对Galectins整个家族成员深入的研究，Galectin-1(Gal-1)已被证明参与组织器官的生长代谢，Gal-1是典型的胞浆蛋白，但在细胞表面、细胞外基质、胞浆和核内均有表达，由于缺乏胞膜转运的信号肽，Gal-1不经过经典的内质网、高尔基体依赖的分泌途径修饰，也不进行糖基化[7]。又由于Gal-1的大部分功能是在细胞表面和细胞外执行，因此许多证据可以表明 Gal-1以一种鲜有的机制分泌，并且其分泌和表达依赖于细胞类型，但具体机制还不明确[8]。
此前，在胚胎期小鼠的椎间盘间叶原基发现Gal-1的基因表达，相比成熟成年小鼠髓核组织，在未成熟的髓核中 Gal-1 mRNA 的转录表达谱显示更高的水平[9]。基于此，作者认为 Gal-1 在调节椎间盘细胞生长、发育和衰老以及退变过程中是至关重要的。因而，此次研究首先分析 Gal-1 在不同退变程度椎间盘组织中的差异表达，其次在动物体内验证Gal-1对椎间盘退变的影响，为其临床应用提供科学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物学、随机对照动物实验，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，Tukey法进行各组之间两两比较。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2022年1月在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院完成。
1.3 材料
1.3.1 椎间盘样本于新疆医科大学第一附属医院椎间盘标本库中收集15例椎间盘标本，其中男9例，女6例；椎间盘退变12例，脊柱骨折1例，特发性脊柱侧凸2例；颈椎3例(C5/6椎间盘突出2例，C6/7骨折1例)，胸椎4例(T5/6、T7/8特发性脊柱侧弯各1例，T10/11胸椎间盘突出2例)，腰椎8例(L3/4、L4/5、L5S1椎间盘突出分别为1，4，3例)；根据椎间盘退变的影像学Pfirrmann 分级确定椎间盘退变程度：1级(无退变组)3例，2、3级(中度退变组)6例，4、5级(重度退变组)6例。此次研究获得患者及家属知情同意，并得到新疆医科大学第一附属医院伦理评审委员会批准，伦理审批文书编号：20190225-22。
纳入标准：①脊柱椎间盘退变；②脊柱骨折；③特发性脊柱侧弯。
排除标准：①脊柱结核；②脊柱布鲁氏杆菌病；③化脓性脊柱炎；④脊柱肿瘤。
1.3.2 实验动物 SPF级6周龄雄性SD大鼠由新疆医科大学动物实验中心提供，体质量180 g左右，许可证号：SCXK(新)20032001。大鼠按随机数字法分为对照组、模型组及Gal-1蛋白干预组，每组5只。
1.3.3 试剂 PCR相关试剂材料：Gal-1、GAPDH引物序列设计生产(中国上海生工生物工程股份有限公司)，反转录试剂盒(美国Thermo公司)，SYBRGreen PCR试剂盒(美国Thermo公司)；Western blot相关试剂材料：半乳糖凝集素Gal-1(1∶1 000)、蛋白聚糖(1∶1 000)、Ⅱ型胶原(1∶1 000)一抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(美国Abcam公司)，RIPA强效裂解液(中国上海碧云天生物技术有限公司)，BCA定量试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，ECL显色液(中国北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；苏木精-伊红相关试剂：苏木精-伊红(中国上海展云化工有限公司)，盐酸乙醇(中国江苏无锡菩禾生物医药技术有限公司)，兔二步法检测试剂盒(中国中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(中国中杉金桥生物技术有限公司)，中性树胶(中国上海懿洋仪器有限公司)。Gal-1重组蛋白，厂家：Sinobiological，货号：80248-RNAE；戊巴比妥由实验室配制。
1.3.4 仪器电泳仪(中国上海伯乐生命医学产品有限公司)，电转仪(中国大连竞迈生物科技有限公司)，酶标仪(美国Thermo公司)，倒置拍照显微镜(德国莱卡公司)，移液器(德国Eppendorf公司)，石蜡切片机(德国莱卡公司)，小动物X射线机(美国Faxitron公司)，小动物7.0核磁共振仪(德国布鲁克科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 患者标本收集、分组于新疆医科大学第一附属医院椎间盘标本库中收集15例椎间盘标本，根据患者信息于影像中心调取患者MRI资料，2名高年资临床医师根据Pfirrmann分级评估责任节段椎间盘退变严重程度并进行分级[10]，分为无退变组、轻度退变组、重度退变组进行后续实验，如2名医师分级有争议则由第3名医师进行评估分级。
1.4.2 动物模型制作、分组 15只SD大鼠随机分为3组，每组5只。对照组暴露L5/6椎间盘，不做细针穿刺，尾静脉注射生理盐水100 μL，1次/d；模型组暴露L5/6椎间盘，18G微量穿刺针穿刺，尾静脉注射生理盐水100 μL，1次/d；Gal-1干预组暴露L5/6椎间盘，18G微量穿刺针穿刺，尾静脉注射50 μg/mL的Gal-1重组蛋白(使用PBS溶解)100 μL，1次/d。各组均给药7 d。

SD大鼠术前禁食水1 d，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后去仰卧位，消毒、铺巾，取右侧旁正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，逐层暴露L5/6椎间盘和终板。于椎间盘纤维环中点使用18G 微量穿刺针以针头帽制作的套筒为保护装置进行穿刺，平行软骨终板进针，进针深度为纤维环全层针刺(控制刺入深度为2.3 mm)。造模完成后依次缝合皮下筋膜及皮肤[11]。对照组实验动物直接缝合皮下筋膜及皮肤。术后连续3 d给予青霉素8×104 U肌注预防感染。术后单笼饲养，造模后隔日开始按照上述措施分组干预。

1.4.3 MRI检测 SD大鼠造模术后8周行MRI检查，大鼠腹腔麻醉后采用Bruker Pharmascan 7.0T动物专用MRI扫描仪行腰椎矢状位T2WI扫描。扫描参数如下：序列重复时间/回波时间(TR/TE)3 000/30 ms，层厚0.5 mm，间隔0 mm。采用改良Pfirrmann椎间盘退变分级系统评分[10]。SD大鼠行MRI检测后过量麻醉处死去除造模节段，多聚甲醛固定48 h，中性脱钙液脱钙1个月，脱蜡、梯度脱水，石蜡包埋后切片(厚度4 μm)备用。
1.4.4 qRT-PCR 人体椎间盘髓核组织采用Trizol提取试剂盒提取组织内总RNA，反转录成cDNA，稀释引物后对cDNA 模板进行扩增实验。引物具体如下：Gal-1 (human)-F：5’-AGG CGA GGT GGC TCC TGA CGC TAA G-3’；Gal-1 (human)-R：5’-TTG CTG TTG CAC ACG ATG GTG TTG G-3’； Gapdh (human)-F：5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’； Gapdh (human)-R：5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。
Real time-PCR反应体系：总体积20 μL，其中ddH2O 7.0 μL，SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10.0 μL，Forward primer 1.0 μL，Reverse primer 10 mol/L 1.0 μL，cDNA 1.0 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 10 min，(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)40个循环。根据阴性对照调整阈值和基线以确定各个标本的Ct值，求出ΔΔCt值后计算各组2-ΔΔCt值。
1.4.5 蛋白质印迹法(Western blot) 人体椎间盘髓核组织和SD大鼠髓核组织分别使用加入蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液提取蛋白，BCA法定量后备用；制备10%聚丙烯酰胺凝胶，25 μg总蛋白上样电泳后将蛋白转至PVDF膜上；5%脱脂牛奶封闭、TBST洗膜；4 ℃孵育一抗过夜；一抗孵育完毕后TBST洗膜，常温孵育HRP标记的二抗(1∶5 000)；ECL显色、一体式化学发光仪成像，采用Image J软件对条带恢复值进行分析，计算蛋白相对表达量。
1.4.6 苏木精-伊红染色 SD大鼠椎间盘组织切片于65 ℃烤箱烤片2 h、二甲苯脱蜡30 min，分别于无水乙醇、体积分数95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇脱水各5 s。蒸馏水洗后行苏木精染色5 min，蒸馏水洗至组织呈蓝紫色，盐酸乙醇分化2 s，PBS反蓝。伊红染色2 min后蒸馏水洗。分别于75%、85%、95%、无水乙醇脱水5 s后透明，待组织晾干后低价中性树胶封固，镜下观察拍照。
1.4.7 免疫组织化学检测人体椎间盘髓核组织切片和SD大鼠髓核组织切片分别于65 ℃烤箱烤片2 h、二甲苯脱蜡30 min，分别于无水乙醇、体积分数95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇脱水各5 s。内源过氧化物酶灭活10 min，5%胎牛血清封闭5 min，加入一抗Gal-1(1∶250)，4 ℃ 孵育过夜。二抗(1∶200)孵育1 h，PBS洗涤3次后DAB显色2 min后终止显色。苏木精染色2 min后冲洗反蓝，梯度脱水。透明，中性树胶封固，镜下观察拍照。
1.5 主要观察指标 ①人体椎间盘髓核组织：Gal-1在椎间盘标本中基因水平的表达，Gal-1在椎间盘标本中的蛋白水平；②动物实验：椎间盘退变的影像学分级，Gal-1、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白在SD大鼠椎间盘标本中的蛋白表达水平。
1.6 统计学分析应用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，Tukey法进行各组之间两两比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变在慢性腰痛的发生、发展中扮演着首当其冲的角色，各种致病因素引起椎间盘稳态破坏，细胞外基质合成、分解代谢失衡是椎间盘退变的主要原因，而伴随其失衡的各种病理表现，如炎症、异常血管、神经的形成与患者疼痛等症状的产生密切相关[12-13]。近年来，学者致力于挖掘椎间盘退变过程中的差异性蛋白并探讨其具体作用机制，在椎间盘退变性疾病的防治中也取得了显著成效。既往研究发现，Gal-1是一种典型胞浆蛋白，表达于内皮细胞、巨噬细胞等，在胸腺、肾脏、骨骼肌、平滑肌等含量丰富[14]。随着器官及脏器结构的退化、功能的丧失，Gal-1也呈现显著性变化，提示Gal-1可能参与机体多种器官、脏器的生长发育以及退变、老化等过程[15-16]。目前尚缺乏其在椎间盘退变疾病中的研究，因而，此次研究首先明确Gal-1在退变椎间盘中的差异性表达，其次通过动物实验证实其对椎间盘退变的影响。
既往文献报道在胚胎期小鼠椎间盘间叶原基中发现Gal-1高表达，相比于成熟小鼠髓核组织，在未成熟小鼠髓核组中Gal-1的转录表达谱显示更高的水平[9]，提示Gal-1在椎间盘形成、生长以及退变过程中发挥着至关重要的作用。此次研究通过检测Gal-1在不同退变程度髓核组织中的表达，明确Gal-1与椎间盘退变的关系，并进一步通过体内实验验证Gal-1在防治椎间盘退变中的作用。此次研究椎间盘标本来源于课题组前期建立的人椎间盘标本库，从中选取15例椎间盘，其中无退变组来自脊柱骨折及脊柱侧凸行椎间融合的患者，退变组来自颈腰椎间盘突出或椎管狭窄者椎间融合者。此次研究首先分析了Gal-1基因在不同退变程度椎间盘中的基因表达水平，研究结果提示随着椎间盘退变的加重Gal-1基因水平减少。免疫组织化学及Western blot结果在蛋白水平表明Gal-1的表达随着椎间盘退变的加重逐渐降低。上述研究结果表明Gal-1随着椎间盘退变的加重，其基因和蛋白表达水平逐渐降低。
此次研究建立SD大鼠腰椎针刺退变模型，使用Gal-1干预进一步观察Gal-1在椎间盘退变防治中的作用。术后8周SD大鼠腰椎MRI结果显示针刺模型组椎间盘T2加权像信号明显降低，表明呈高度水化状态的髓核组织减少，间接反映了髓核组织中蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的丢失[17]，Gal-1干预明显减轻了针刺导致的椎间盘T2加权像信号降低。在椎间盘早期退变阶段，细胞产生胶原蛋白和蛋白聚糖尝试自修复，但随着致病机制的进一步影响，合成变缓导致椎间盘组成发生损害。蛋白聚糖合成减少进一步导致髓核组织水分丢失、高度减少以及渗透压降低，随之而来的是椎间盘弹性强度下降及椎间盘高度的丢失[18]。在自然产生的糖复合物中，层粘连蛋白是被公认的 Gal-1 的天然配体，此外Gal-1 还与富含聚乳糖胺的溶酶体相关膜蛋白、纤维连接蛋白(Fibronectin)、嗅神经元上的含有乳糖胺的糖脂以及含糖复合物的细胞外基质结合[19-20]。最近的研究发现，一般来说，所有半乳凝素发挥其生物效应需要通过绑定到特定碳水化合物结构，表明Gal-1与许多细胞表面受体整合素β1(CD29)、CD107a、CD90、CD45有关；此外，最近的研究表明，通过 MEK1/2-ERK1/2信号通路Gal-1刺激大鼠肝星状细胞影响蛋白质磷酸化水平细胞吸附，以及在壳聚糖膜上增殖、扩散，几个物种中Gal-1在髓核组织的表达水平随年龄增长而下降的模式类似于椎间盘组织中的 LM-511[21]。这些结果表明，Gal-1调解细胞基质交互在椎间盘发育过程和老龄化带来的退化中可能发挥重要作用。
髓核组织中蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的丢失与椎间盘退变病理结构的改变密切相关，此次研究中椎间盘苏木精-伊红病理染色结果提示细针穿刺导致椎间盘结构破坏，软骨终板变薄，破骨细胞数目增多；而Gal-1蛋白干预后，骨痂结构更致密，破骨细胞数目减少。其次，此次研究通过免疫组织化学染色进一步明确Gal-1的有效干预可以增加其在椎间盘中的表达，并减缓椎间盘退变的进展。此次研究在蛋白水平对各组大鼠腰椎椎间盘髓核组织中Gal-1以及细胞外基质代谢相关蛋白聚糖和Ⅱ型胶原进行检测分析，结果提示细针穿刺可降低大鼠椎间盘髓核组织中Gal-1的表达，同时伴有蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的分解代谢，而Gal-1干预可以部分逆转这一现象，表现为Gal-1干预组中Gal-1、蛋白聚糖以及Ⅱ型胶原的增多。
总而言之，Gal-1作为Galectins家族中的一员，在椎间盘退变进程中扮演着重要角色，Gal-1有效干预可以减缓椎间盘退变的进展。然而，此次研究尚存在一定的不足之处，首先尚缺乏体外细胞实验验证Gal-1在髓核细胞退变中的具体作用机制；其次，此次研究尚处于临床前实验水平，向临床的转化还需完成更多的研究和探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

半乳糖凝集素1在退变椎间盘中的差异表达

Differentially expressed galectin-1 during intervertebral disc degeneration

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