双喷头静电纺丝法制备载软骨脱细胞基质的复合纳米纤维支架

doi:10.12307/2023.839

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5448-5454.doi: 10.12307/2023.839

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

双喷头静电纺丝法制备载软骨脱细胞基质的复合纳米纤维支架

滕建祥1，朱骥生1，袁代柱2，王桢1，周玉虎2，田晓滨1，2

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550001；2贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-11-02 接受日期:2022-12-15 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-20
通讯作者: 田晓滨，主任医师，贵州医科大学，贵州省贵阳市 550001；贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:滕建祥，男，1993年生，重庆市人，土家族，贵州医科大学在读硕士，医师，主要从事组织工程、生物材料研究。
基金资助:
贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2021]一般072)，项目负责人：田晓滨

Preparation of cartilage decellularized extracellular matrix-loaded composite nanofiber scaffolds based on two-nozzle electrospinning

Teng Jianxiang1, Zhu Jisheng1, Yuan Daizhu2, Wang Zhen1, Zhou Yuhu2, Tian Xiaobin1, 2

1Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-11-02 Accepted:2022-12-15 Online:2023-12-08 Published:2023-04-20
Contact: Tian Xiaobin, Chief physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Teng Jianxiang, Master candidate, Physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
Supported by:
Guizhou Science and Technology Plan Project, No. [2021]072 (to TXB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

双喷头静电纺丝：使用2个推注喷头对两种不同种类或不同特性的物质在同一高压电场下进行共同静电纺丝在同一接收器上，从而构建出具有多样化功能的纳米纤维。
脱细胞基质：通过物理、化学或酶等方法对组织进行脱细胞处理，保留具有生物活性的细胞外基质，可作为组织工程支架的构建材料，用于组织或器官的修复。

背景：软骨脱细胞基质是一种理想的用于构建软骨组织工程支架的生物材料，可以用于软骨缺损的修复。
目的：以聚乙烯醇为脱细胞基质的负载材料，3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯共聚物为框架材料，通过双喷头静电纺丝构建复合纳米纤维支架，并初步探索其体外生物活性。
方法：通过酶、化学与超声振荡清洗结合的方法去除软骨组织中的细胞成分，制成软骨脱细胞基质。用双喷头静电纺丝的方法分别制备3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯共聚物(记为P34HB)、3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯共聚物-聚乙烯醇(记为P34HB-PVA)、3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯共聚物-聚乙烯醇-脱细胞基质(记为P34HB-PVA-dECM)纳米纤维支架，表征支架的纤维形貌、组成成分、亲水性能和力学性能。将人骨髓间充质干细胞与3种支架共培养，通过Live/Dead染色来检测细胞在支架的活力，扫描电镜观察细胞在支架上的黏附形态，阿尔玛蓝试剂盒检测细胞在支架上的增殖性能，Ⅱ型胶原免疫荧光评估细胞在支架上的成软骨分化。

结果与结论：①扫描电镜下可见，各组支架纤维呈随机分布，纤维之间互相连接呈现多孔结构，其中P34HB-PVA-dECM支架的纤维直径最小；P34HB-PVA-dECM支架的水接触角小于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)，吸水率高于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)；P34HB-PVA-dECM支架的弹性模量高于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)；②Live/Dead染色结果显示，大多数骨髓间充质干细胞在3组支架上均能够存活；扫描电镜观察显示，骨髓间充质干细胞在P34HB-PVA-dECM支架上的伪足伸展更充分，与支架的融合更好；阿尔玛蓝染色显示，P34HB-PVA-dECM支架上的骨髓间充质干细胞增殖速度快于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)；免疫荧光染色显示，P34HB-PVA-dECM支架上骨髓间充质干细胞生成的Ⅱ型胶原量多于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)；③结果表明，P34HB-PVA-dECM支架具有更细的纤维结构、更好亲水性和力学性能，更适合细胞黏附、增殖，有利于骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化。

https://orcid.org/0000-0002-9942-9354(滕建祥)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 双喷头静电纺丝, 脱细胞基质, 聚乙烯醇, 软骨, 组织工程, 生物材料, 纳米纤维支架

Abstract: BACKGROUND: Cartilage decellularized extracellular matrix (dECM) is an ideal biomaterial for the preparation of cartilage tissue engineering scaffolds, which can be used to repair cartilage defects.
OBJECTIVE: To use polyvinyl alcohol (PVA) as the loading material of dECM and poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate (P34HB) as the frame material to prepare P34HB-PVA-dECM composite nanofiber scaffolds by two-needle electrospinning, and preliminarily explore the bioactivity of the scaffolds in vitro.
METHODS: The cellular components in the cartilage tissue were removed by a combination of enzyme, chemical, and ultrasonic concussion cleaning methods to prepare cartilage dECM. P34HB, P34HB-PVA, and P34HB-PVA-dECM scaffolds were prepared by two-neezle electrospinning. The fiber morphology, composition, hydrophilicity, and mechanical properties of the scaffolds were characterized. Human bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the three kinds of scaffolds. The viability of cells on scaffolds was evaluated by the Live/Dead staining. The adhesion morphology of the cells on the scaffolds was observed by scanning electron microscopy. The proliferation performance of the cells on the scaffolds was detected by the alamar blue kit. The chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells on the scaffolds was evaluated by type II collagen immunofluorescence.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy results showed that the scaffold fibers in each group were randomly distributed and the interconnections between the fibers showed a porous structure. The fiber diameter of P34HB-PVA-dECM scaffolds was the smallest. The P34HB-PVA-dECM scaffolds had the smallest water contact angle (P < 0.05) and the highest water absorption rate compared with the P34HB and P34HB-PVA scaffolds (P < 0.05). The elastic modulus of the P34HB-PVA-dECM scaffolds was higher than that of the P34HB and P34HB-PVA scaffolds (P < 0.05). (2) Live/Dead staining showed that most cells survived well on the three groups of scaffolds. The scanning electron microscope observation showed that the bone marrow mesenchymal stem cells on P34HB-PVA-dECM scaffolds extended pseudopod more fully and fused better with the scaffolds. Alamar blue staining exhibited that the proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells on the P34HB-PVA-dECM scaffolds was faster than that on the P34HB and P34HB-PVA scaffolds (P < 0.05). The immunofluorescence staining results showed that more type II collagen produced after chondrogenic induction on the P34HB-PVA-dECM scaffolds was more than that on the P34HB and P34HB-PVA scaffolds (P < 0.05). (3) To sum up, the P34HB-PVA-dECM composite nanofiber scaffolds have smaller fiber structure, more optimized hydrophilicity and mechanical properties, which is more favorable for the adhesion, proliferation, and differentiation into chondrocytes of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: two-nozzle electrospinning, decellularized extracellular matrix, polyvinyl alcohol, cartilage, tissue engineering, biomaterial, nanofiber scaffold

中图分类号:

滕建祥, 朱骥生, 袁代柱, 王桢, 周玉虎, 田晓滨. 双喷头静电纺丝法制备载软骨脱细胞基质的复合纳米纤维支架[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5448-5454.

Teng Jianxiang, Zhu Jisheng, Yuan Daizhu, Wang Zhen, Zhou Yuhu, Tian Xiaobin. Preparation of cartilage decellularized extracellular matrix-loaded composite nanofiber scaffolds based on two-nozzle electrospinning[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5448-5454.

图/表（结果） 11

2.1 软骨dECM各组分的含量见图1。

经过酶、化学及超声振荡洗涤处理后，所制备的软骨dECM中残余的DNA含量为(25.53±2.06) ng/mg，较正常软骨组织DNA含量(595.83±6.35) ng/mg明显减少(P < 0.05 )，去除DNA含量约95%。dECM中的胶原含量(179.53±7.20) μg/mg，较软骨组织中的胶原含量(200.43±7.78) μg/mg降低(P < 0.05)，保留了胶原约90%；dECM中的糖胺聚糖含量为(6.48±1.23) μg/mg，较正常软骨组织的糖胺聚糖含量(10.69±0.74) μg/mg降低(P < 0.05)，保留了糖胺聚糖约60%。
2.2 各组支架物理性能表征结果
2.2.1 各组支架形态学观察各组支架扫描电镜观察结果如图2所示，各组支架纤维呈随机分布，纤维之间互相连接呈现多孔结构。通过测量各组支架的纤维直径，P34HB支架的纤维直径为(435.00±68.60) nm，P34HB-PVA支架纤维直径为(401.00±54.90) nm，P34HB-PVA-dECM支架的纤维直径为(314.00±58.80) nm。

2.2.2 支架成分检测结果通过傅里叶红外光谱检测显示，所构建的P34HB-PVA-dECM支架在波数为3 352 cm-1处出现宽峰，这归属于dECM与PVA中-OH伸缩振动共同形成的宽峰，2 975，2 940 cm-1处的波峰分别归属于P34HB与PVA中烃基C-H键反对称伸缩振动与对称伸缩振动峰，1 715 cm-1处出现的强峰为C=O键伸缩振动峰，为P34HB的特征峰，见图3。综上，上述3种材料的特征峰均有出现在此红外光谱图中，说明采用双喷头静电纺丝的方法成功地将软骨dECM负载于支架上。

2.2.3 各组支架亲水性能检测结果 P34HB、P34HB-PVA、P34HB-PVA-dECM支架的接触角分别为(102.91±2.21)°，(85.44±2.96)°，(71.42±4.01)°；与其他组相比，P34HB-PVA-dECM支架的水接触角最小(P < 0.05)，见图4A。各组支架的吸水率结果如图4B所示，P34HB、P34HB-PVA、P34HB-PVA-dEC支架的吸水率分别为(121.04±15.49)%，(160.38±15.20)%，(203.75±17.99)%，P34HB-PVA-dECM支架的吸水率最高(P < 0.05)，说明P34HB-PVA-dECM支架的亲水性最好。

2.2.4 各组支架的力学性能检测结果各组支架的力-位移曲线如图5A所示，P34HB、P34HB-PVA、P34HB-PVA-dECM支架的弹性模量分别为(13.75±1.65)，(8.68±0.78)，(28.12±2.81) MPa。 P34HB-PVA-dECM支架的弹性模量大于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)，见图5B。说明经过交联剂处理后，P34HB-PVA-dECM支架具有更好的力学性能。

2.3 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定经过传代、纯化，第3代的骨髓间充质干细胞形态如图6A所示，细胞呈纺锤形；经过14 d的成骨诱导后行茜素红染色，光镜下可见明显的钙结节，如图6B所示；经过14 d的成脂诱导后行油红O染色，可见“葡萄样”脂滴形成，如图6C所示。综上所述，所提取的细胞具有多向分化潜能，鉴定为骨髓间充质干细胞。

2.4.1 骨髓间充质干细胞在各组支架上的Live/Dead 染色骨髓间充质干细胞在3组支架上培养3 d以后的Live/Dead 染色结果，如图7A-C所示，可见少量的红色细胞(死细胞)，大多数为绿色细胞(活细胞)；各组支架上细胞存活率如图7D所示，3组支架上的细胞存活率均超过了95%，说明大多数细胞在3组支架上能存活，3组支架无明显细胞毒性。

2.4.2 骨髓间充质干细胞在各组支架上的黏附形态骨髓间充质干细胞在各组支架上培养48 h后的扫描电镜图，如图8所示。扫描电镜观察可见，P34HB支架上的细胞铺展呈球形，伪足伸出不明显；在P34HB-PVA支架上，细胞形态舒展，细胞伪足与纤维丝融合，但伪足数量较少；在P34HB-PVA-dECM支架上，细胞形态舒展更为舒展，伪足伸出明显，伪足沿纤维丝分布，说明细胞与P34HB-PVA-dECM支架结合得更好。

2.4.3 细胞在各组支架上的增殖实验结果各组支架上骨髓间充质干细胞阿尔玛蓝结果，如图9所示。培养 1 d时，3 组支架上的细胞增殖吸光度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养4，7 d时，P34HB-PVA-dECM支架的的细胞增殖吸光度明显高于P34HB、P34HB-PVA支架(P < 0.05)，说明随着培养时间的延长，细胞在P34HB-PVA-dECM支架中的增殖速度最快，dECM的加入促进了细胞的增殖。

2.4.4 各组支架体外成软骨诱导活性检测结果骨髓间充质干细胞在各组支架上进行成软骨诱导培养14 d后，Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果如图10A所示，各组细胞均出现染色阳性区域，说明骨髓间充质干细胞成功分化为软骨细胞。Image J定量分析结果如图10B所示，P34HB-PVA-dECM支架较其他两支架的荧光强度更强，即分泌的Ⅱ型胶原量更多(P < 0.05)，表明P34HB-PVA-dECM支架具有更强的成软骨诱导活性。

2.5 纳米纤维支架的生物相容性由支架生物活性表征结果可知，P34HB-PVA-dECM支架具有良好的生物相容性。

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引言

软骨缺损是临床常见的关节病变，可由多种原因引起，如创伤、退行性改变、炎症等[1]，未经治疗的关节软骨缺损通常会导致关节疼痛、功能受限，最终会发展为骨关节炎[2-3]。临床上针对软骨缺损已经提出了多种治疗方法，如微骨折、自体干细胞移植、马赛克植骨等[4]，受损的透明软骨常修复为纤维软骨，而纤维软骨不能代替透明软骨的功能[5]。过去几十年来，组织工程在软骨缺损的治疗中显示出巨大的潜力。理想的组织工程支架既能提供适宜细胞生长的生物微环境，又能提供稳定的物理支撑[6]。
静电纺丝可以制作具有三维结构的纳米纤维支架[7]，能够模拟天然细胞外基质的结构，促进细胞的黏附、增殖和分化等[8-9]。聚羟基烷酸酯具有良好的可纺性，因其良好的生物相容性、生物降解性和力学性能而被广泛用于构建组织工程支架[10-11]。团队前期研究用聚羟基烷酸酯家族成员中的聚 3-羟基丁酸酯与聚3-羟基丁酸脂3-羟基己酸酯构建软骨支架，验证了聚羟基烷酸酯在成软骨方面的作用[12]。3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯共聚物(poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate，P34HB)是聚羟基烷酸酯家族的第4代产品，在组织工程中有广泛的应用，但存在亲水性较差的不足[13-14]。
软骨脱细胞基质(decellularized extracellular matrix，dECM)具有丰富的活性成分，包括胶原蛋白、糖胺聚糖及生长因子等[15]。有研究表明，软骨dECM可以提供一个类软骨环境促进干细胞向软骨方向分化[16]。然而，软骨dECM不具备可纺性。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)具有良好的亲水性及生物相容性[17]，其优异的可纺性使其可以作为水溶性物质的电纺载体，但PVA的力学性能较差[18]。
此次实验将软骨dECM溶于去离子水中，添加到PVA的水溶液中，将P34HB溶于二氯甲烷中，在同一高压电场下进行双喷头静电纺丝，构建出P34HB-PVA-dECM支架，并通过材料表征和细胞生物相容性来评估支架的性能，为组织工程治疗软骨缺损提供了一种新的参考。

材料方法

1.1 设计基于双喷头静电纺织技术构建载软骨dECM组织工程支架，进行支架的表征、体外生物活性验证，对结果进行单因素方差分析或t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年 2-8月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。
1.3 材料 P34HB(MW=350 000，珠海麦得发)；PVA(MW=186 000，醇解度85%-89%，清华大学高分子研究所友情提供)；关节软骨(取自家猪股骨，购自当地农贸市场)。
主要试剂及仪器：TritonX-100、阿尔玛蓝试剂盒、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(北京索莱宝)；Live/Dead 染色试剂盒(江苏凯基)；组织DNA提取试剂盒(北京天根)；组织糖胺多糖含量检测试剂盒(GENMED，美国)；羟脯氨酸测试盒(南京建成)；DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Biological Industries，以色列)；Ⅱ型胶原IgG抗体、FITC标记的二抗(武汉三鹰)；DAPI 染色液(北京索莱宝)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，德国)；扫描电子显微镜 (Hitachi，日本)；静电纺丝机(SS-2534H，北京永康乐业)；力学测试仪(上海倾计)；FTIR分析仪(Nicolet 670，美国)；超微量分光光度计(ND-Lite，美国)；多功能酶荧光标仪(SYNERGY H1 Bio Tek，美国)；超声震荡清洗仪(CQ-500A-DST，上海跃进)。其他仪器分析级化学试剂均来自细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室(贵州医科大学，贵阳，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 软骨dECM的制备软骨dECM的制备参考了文献报道的方法[19]，稍作修改：从猪股骨髁收集关节软骨，清洗干净去除表面杂质及血水，浸入足量去离子水中，经过10次冷冻(-80 ℃冷冻3 h)和解冻(37 ℃水浴30 min)循环，每次更换去离子水；将软骨片置于0.25%胰蛋白酶-EDTA PBS溶液中，整体置于37 ℃恒温摇床内24 h，取出软骨基质，用去离子水冲洗；再将软骨基质置于0.05% TritonX-100中室温搅拌处理24 h；最后，使用超声振荡清洗软骨基质1 h，用去离子水清洗基质去除残留试剂，振荡、清洗过程至少重复10次。将脱细胞完成后的软骨基质制成匀浆，经过冷冻干燥称质量后溶于去离子水中，制成30 g/L软骨dECM溶液[5]，保存于4 ℃内备用。
1.4.2 软骨dECM的成分鉴定称取一定量所制备的软骨dECM，分别采用组织基因DNA提取试剂盒、羟脯氨酸测试盒及糖胺多糖含量检测试剂盒，按照说明书标注的方法分别测定DNA、胶原以及糖胺多糖含量。以同样的方法测量未经脱细胞处理的软骨成分作为对照(n=3)。
1.4.3 静电纺丝前驱液及支架的制备
静电纺丝前驱液的制备：①P34HB前驱液的制备：称量0.6 g的P34HB加入10 mL二氯甲烷中，搅拌均匀2 h使其充分溶解，制成P34HB溶液；②PVA前驱液的制备：称取0.6 g的PVA，加入10 mL去离子水中，加热至90 ℃搅拌1 h至充分溶解，制成PVA溶液；③PVA-dECM前驱液的制备：称取1.2 g的PVA，加入10 mL去离子水中，加热至90 ℃搅拌1 h至充分溶解，待整体冷却至37 ℃以下后，与所制备软骨dECM溶液以体积比1∶1混合，搅拌混匀制成PVA-dECM溶液。
纳米纤维支架的制备：使用5 mL注射器抽取5 mL P34HB前驱液连接至静电纺丝机推注通道A，推注速度为0.1 mm/min；另取5 mL注射器抽取5 mL PVA-dECM前驱液，连接至静电纺丝机推注通道B，推注速度为0.1 mm/min；设置正极电压为10 kV，负极电压为-2.5 kV，接收装置为金属滚轴，转速设置为80 r/min，接收距离为15 cm，制备P34HB-PVA-dECM支架。以同样的方法，将通道B中的前驱液分别换成PVA前驱液，制备P34HB-PVA支架；将通道B中的前驱液更换为P34HB前驱液，制备P34HB支架。所有制备的支架置于真空冷冻干燥机中干燥过夜以去除表面残余的有机溶剂。使用前将所制备的支架用交联剂EDC·HCl进行交联[20]，将3组支架分别浸入5 mmol/L EDC·HCl无水乙醇溶液中，在4 ℃环境中进行交联处理24 h，然后用PBS浸泡清洗24 h去除交联剂。
1.4.4 纳米纤维支架的物理性能表征
支架表面形态学表征：将制备的各组支架冷冻干燥去除表面水分，表面进行喷金处理后，利用扫描电镜对支架进行表面形态扫描观察，采集图像后，用Nano measuer 1.2软件测量、分析各组支架的纤维直径(n=100)。
支架成分检测：利用傅里叶红外光谱测定所制备支架的各个组成成分化学结构，采用KBr压片法制样，在衰减全反射模式下进行测试，傅里叶红外光谱在 4 000-500 cm-1的能量范围内获得，分辨率为4 cm-1。
支架亲水性能检测：将去离子水滴于所制备的各组支架(2 cm×2 cm)上，并捕获沉降在支架上的水滴的图像，测量水滴与支架间的接触角并记录图像，根据5 s时水滴与支架成像的夹角评估其亲水性(n=3)。将各组干燥的支架分别裁成 5 cm×3 cm大小，浸入37 ℃的PBS中4 h，用吸水纸吸干表面多余水分后称质量，评估支架的吸水率。吸水率(%)=[(m1-m0)/m0] ×100%[21]，m0为支架的原始质量，m1浸泡PBS后的质量。
支架力学性能检测：将各组支架分别裁成20 mm×10 mm×0.2 mm大小，用力学测试仪行拉伸实验，有效拉伸长度为 10 mm；采用100 N 传感器，拉伸速度为 1 mm/min，记录得数据并绘制成力-位移关系图，并计算各组支架的弹性模量(n=5)。
1.4.5 人骨髓间充质干细胞的提取、培养与鉴定
骨髓间充质干细胞的提取及培养：在患者知情同意的情况下，从接受关节置换手术患者中收集骨髓液。研究获得了贵州医科大学附属医院伦理委员会的批准，伦理批号：2020伦审第013号。将抽取的骨髓液以1 500 r/min离心5 min，去除上清液，以含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEM培养基重悬细胞，并置于T25培养瓶中，置于含体积分数5%CO2培养箱中37 ℃培养，每两三天更换培养基，当细胞汇合度达到 80%进行传代，选取第3代细胞用于后续实验。
骨髓间充质干细胞的鉴定：将骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基(含有DMEM、胎牛血清，青霉素、链霉素、β-甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C)中诱导14 d，行茜素红染色；在成脂诱导培养基(含有DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛)中诱导14 d，行油红O染色，显微镜下观察。
1.4.6 纳米纤维支架的生物活性表征
Live/Dead 染色观察细胞在支架上的活力：将P34HB、P34HB-PVA、P34HB-PVA-dECM支架裁剪成5 mm×5 mm大小，经紫外线双面各照射4 h消毒，放置于24孔板内，DMEM培养基提前润湿支架1 h(除非特殊说明，以下与细胞共培养的支架均按此方式处理)。将骨髓间充质干细胞以1×105/孔的密度接种于支架上，培养3 d，使用Live/Dead染色试剂盒对支架上的细胞进行染色，倒置荧光显微镜下观察，使用Image J软件分析细胞存活率(n=3)。
扫描电镜观察细胞在支架上的黏附形态：将各组支架裁剪成5 mm×5 mm大小，经消毒、预润处理后置于24孔板内；将骨髓间充质干细胞以1×105/孔的密度接种于支架上，培养24 h，吸出培养基，用PBS轻柔地清洗2遍，加入电镜固定液于4 ℃下固定4 h，吸出固定液，置于通风橱过夜干燥，扫描电镜下观察细胞在支架上的黏附形态。
阿尔玛蓝染色检测细胞在支架上的增殖速度：使用环切刀将各组支架裁剪为直径为5 mm的圆形，至于96孔板内；将骨髓间充质干细胞以5×103/孔的密度接种于支架上，另设无支架孔细胞培养作为空白对照。接种第1，4，7天后，将200 µL稀释后阿尔玛蓝染色液(培养基与染色液体积比为10∶1)加入各个孔内，培养4 h后吸出培养基，加入新的96孔板后，使用酶标仪(激发波长为545 nm，接收波长为590 nm)检测各个孔的荧光吸光度值(n=3)。
Ⅱ型胶原免疫荧光评估支架上细胞的成软骨诱导活性：将各组支架裁剪成10 mm×10 mm大小，经消毒、预润处理后置于12孔板内；将骨髓间充质干细胞以2×105/孔的密度接种于支架上，另设无支架的空白孔作为对照。培养24 h后更换为成软骨诱导培养基(含有DMEM、胎牛血清、地塞米松、抗坏血酸、胰岛素-转铁蛋白-硒预混物、丙酮酸钠、L-脯氨酸、转化生长因子β3、青霉素和链霉素)培养，每3 d更换培养基。培养14 d后进行Ⅱ型胶原免疫荧光染色：将孔板中的培养基吸出，PBS清洗2次，用40 g/L多聚甲醛室温下固定支架上的细胞15 min，PBS清洗3次，再用1%的BSA溶液室温孵育30 min，接着加入Ⅱ型胶原一抗(稀释比例1∶250)4 ℃孵育过夜；吸出一抗，PBS清洗3次；用FITC标记的二抗(稀释比例1∶250)在37 ℃下避光反应1 h；吸出二抗，PBS清洗3次；DAPI染色5 min，PBS清洗3次，抗荧光淬灭剂封固，激光共聚焦显微镜下观察，用Image J软件分析荧光强度。
1.5 主要观察指标各组支架的物理性与生物活性。
1.6 统计学分析实验数据均使用SPSS 22.0软件进行统计分析，定量数据结果均以x±s表示，各平行组间差异采用单因素方差分析或t检验来比较，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

组织工程技术的兴起为软骨缺损的治疗提供了一种充满希望的方案。支架是组织工程的重要组成部分[22-23]，能够模拟天然细胞外基质的支架，对于实现所需的细胞功能和组织再生具有重要意义[24]。电纺纳米纤维由于能模拟细胞外基质的物理环境而作为组织工程支架使用[25]。软骨dECM含有调节细胞行为的特异性基质成分，被认为是构建软骨组织工程支架的理想材料[26-27]。在此次实验中，将软骨静电纺丝与dECM与结合[28]，使用双喷头静电纺丝的方法成功构建了P34HB-PVA-dECM纳米纤维支架。
实验证实，采用酶、化学与超声振荡清洗结合方法制备的软骨dECM中，DNA含量低于50 ng/mg，符合脱细胞基质的标准[29]；总的胶原和糖胺聚糖含量有不同程度降低，这是由于胰蛋白酶、Triton-X100与超声振荡对其造成了破坏[30]，但由于其中主要免疫源物质DNA的去除超过了95%，作者认为这样的损失是可以接受的。支架的结构在调节细胞活动过程中起着重要的作用[31]。就支架的纤维直径而言，P34HB-PVA-dECM支架直径更小，也就意味着具有更高的比表面积，这是由于dECM的加入增加了电纺前驱液溶液的电导率，射流受到的电场力增加[32]。P34HB与P34HB-PVA-dECM支架直径分布不均匀，这是由于双喷头射流之间的电场力互相排斥，影响了纳米纤维的直径分布[33]。软骨dECM上含有氨基、羧基等，PVA上含有羟基，这些基团上存在大量的亲水键，因此，P34HB-PVA-dECM支架的亲水性能最好。亲水性的增加有利于细胞的黏附[34]。力学测试结果表明，P34HB-PVA-dECM支架具有更高的弹性模量，这是由于dECM中的氨基与羧基在交联剂EDC·HCl的作用下形成了酰胺键，增加了弹性模量[21]。
但P34HB与PVA不含有氨基和羧基，在EDC·HCl的作用下不能形成酰胺键，故交联剂对P34HB与P34HB-PVA力学性能改善的作用不明显。此次实验所构建的P34HB-PVA-dECM支架，一定程度上弥补了P34HB亲水性和PVA力学性能方面的不足。
Live/Dead结果显示，人骨髓间充质干细胞在3组支架上的存活率均超过了95%，说明所构建的支架无明显细胞毒性。通过扫描电镜观察可见，细胞与P34HB-PVA-dECM支架结合最好，P34HB-PVA-dECM支架亲水性的改善和比表面积的增加共同作用产生了这样效果[35-36]。细胞增殖实验结果显示，在第4天与第7天，P34HB-PVA-dECM支架上的细胞增殖速度最快，这是由于dECM中的生长因子促进了细胞的增殖[37]。Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果显示，P34HB-PVA-dECM支架上的荧光强度更强，说明人骨髓间充质干细胞在该支架上分泌了更多的Ⅱ型胶原。除了上述原因以外，dECM还为人骨髓间充质干细胞提供了软骨仿生微环境，促进了人骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化[38]。
实验首次采用双喷头静电纺丝法构建了载有软骨dECM的复合纳米纤维支架。双喷头静电纺丝技术可用于溶解性能不同的物质进行静电纺丝，以一种简单、高效的方式构建多功能电纺纳米纤维[39]。有研究将聚(ε-己内酯)、玉米蛋白和阿拉伯树胶进行双喷头静电纺丝，用于皮肤组织工程[40]。此次实验作为对双喷头静电纺丝构建载dECM复合纳米纤维支架的初步探索，具有一定的局限性：①双喷头静电纺丝由于射流之间的电场力互相影响，可能会影响纤维的直径，这也是导致实验中部分支架纤维直径不均匀的原因，在后续的研究中，作者将会开展进一步实验，探究喷头之间的距离对于纤维支架表面形貌的影响，改进电纺参数；②实验对支架的生物活性仅仅是在体外进行了细胞实验的验证，缺乏体内成软骨效果研究，这在后续研究将会开展动物实验进行进一步验证。尽管存在以上的不足，仍然不影响实验的主要结论，基于双喷头静电纺丝技术构建的P34HB-PVA-dECM支架，为载软骨dECM纳米纤维支架的构建提供了一种新思路，有望成为组织工程治疗软骨缺损的一种新路径。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

双喷头静电纺丝法制备载软骨脱细胞基质的复合纳米纤维支架

Preparation of cartilage decellularized extracellular matrix-loaded composite nanofiber scaffolds based on two-nozzle electrospinning

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