星形胶质细胞来源细胞外囊泡促进大鼠神经干细胞向神经元的分化

doi:10.12307/2023.672

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3845-3851.doi: 10.12307/2023.672

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星形胶质细胞来源细胞外囊泡促进大鼠神经干细胞向神经元的分化

蔡闯，黄永辉，曹兴兵，孙海涛，贯世豪，黄文康，韩博

江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000

收稿日期:2022-07-20 接受日期:2022-10-11 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 黄永辉，硕士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000
作者简介:蔡闯，男，1997 年生，江苏省南京市人，汉族，江苏大学在读硕士，主要从事脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
镇江市科技项目(SH2020053)，项目负责人：黄永辉

Astrocyte-derived extracellular vesicles promote the differentiation of rat neural stem cells into neurons

Cai Chuang, Huang Yonghui, Cao Xingbing, Sun Haitao, Guan Shihao, Huang Wenkang, Han Bo

Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China

Received:2022-07-20 Accepted:2022-10-11 Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Huang Yonghui, Master, Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
About author:Cai Chuang, Master candidate, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Zhenjiang Science and Technology Project, No. SH2020053 (to HYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外囊泡：指由母细胞释放的膜性细胞外囊泡样物质，简称细胞外囊泡，内含与其来源细胞相关的DNA、RNA、生长因子、蛋白质、脂类等多种物质，参与细胞间通讯、细胞迁移分化、血管新生和免疫调节等多方面功能调控。
细胞分化：指细胞由一种类型逐渐转变为在形态、结构、生理功能等多方面与来源细胞不同的其他类群的过程。这一功能可以使生物体具有更高效的代谢能力、对环境更强的适应性及对于损伤的代偿能力。

背景：神经干细胞具有向神经元分化的潜能，已有报道表示星形胶质细胞与神经元存在密切联系，而有关星形胶质细胞来源细胞外囊泡是否具有促进神经干细胞向神经元高效分化的作用，仍未见相关报道。
目的：探索星形胶质细胞来源细胞外囊泡诱导促进神经干细胞向神经元分化的可能性。
方法：①体外培养大鼠神经干细胞及星形胶质细胞，行细胞形态及免疫荧光鉴定，进一步提取星形胶质细胞来源细胞外囊泡，并通过透射电镜、粒径分析、Western blot等方法进行鉴定；②将第3代神经干细胞分2组，分别加入同体积的PBS、星形胶质细胞来源细胞外囊泡(质量浓度为1 mg/mL )干预6 d；③通过免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测星形胶质细胞来源细胞外囊泡干预后神经元标志物的表达水平。

结果与结论：①显微镜下神经干细胞形态为球形，以细胞团状分布，免疫荧光示特征性标志物CD133、Nestin呈高表达水平；②显微镜下星形胶质细胞形态为不规则星状，且免疫荧光示特征性标志物胶质纤维酸性蛋白呈高表达水平；③星形胶质细胞来源细胞外囊泡形态近似圆形或椭圆形杯状，动态光粒子散射仪显示直径在10-200 nm 之间，Western blot示细胞外囊泡相关标志物CD63及TSG101表达阳性；④相比PBS组，星形胶质细胞来源细胞外囊泡组可见神经干细胞大量贴壁分化，分化细胞胞体饱满，有明显突起，主要呈神经元样，且微管蛋白β3及神经丝蛋白200呈高表达(P < 0.05)；⑤以上结果提示，星形胶质细胞来源细胞外囊泡可促进神经干细胞向神经元分化。

https://orcid.org/0000-0002-2569-8607 (蔡闯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经干细胞, 星形胶质细胞, 细胞外囊泡, 中枢神经系统疾病, 神经元, 分化, 脊髓损伤, 神经修复

Abstract: BACKGROUND: Neural stem cells have the potential to differentiate into neurons. It has been reported that astrocytes are closely related to neurons, but whether astrocyte-derived extracellular vesicles can promote the efficient differentiation of neural stem cells into neurons has not been reported.
OBJECTIVE: To explore the possibility of inducing and promoting neuronal differentiation of neural stem cells from extracellular vesicles derived from astrocytes.
METHODS: (1) Rat neural stem cells and astrocytes were cultured in vitro and identified by cell morphology and immunofluorescence. Astrocyte-derived extracellular vesicles were further extracted and identified by transmission electron microscopy, particle size analysis, western blot assay and other methods. (2) Passage 3 neural stem cells were divided into two groups: Neural stem cells were treated with the same volume of PBS and astrocyte-derived extracellular vesicles (1 mg/mL) for 6 days. (3) The expression levels of neuron markers after astrocyte-derived extracellular vesicle intervention were detected by immunofluorescence, qRT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the microscope, neural stem cells were spherical in shape and distributed in cell clusters. Immunofluorescence showed that the characteristic markers CD133 and Nestin were highly expressed. (2) Astrocyte morphology was irregular stellate under the microscope, and immunofluorescence showed that the characteristic marker glial fibrillary acidic protein was highly expressed. (3) The shape of astrocyte-derived extracellular vesicles was round or oval cup and 10-200 nm in diameter by dynamic light particle scatterer. Western blot assay showed positive expression of CD63 and TSG101, related markers of extracellular vesicles. (4) Compared with PBS group, astrocyte-derived extracellular vesicle group showed a large number of adherent differentiation of neural stem cells, and the differentiated cells were plump and obvious protrusions, which were mainly neuron-like, and the expression of tubulin β3 and neurofilament 200 was high (P < 0.05). (5) These results suggest that astrocyte-derived extracellular vesicles can promote the differentiation of neural stem cells into neurons.

Key words: neural stem cell, astrocyte, extracellular vesicle, central nervous system disease, neuron, differentiation, spinal cord injury, nerve repair

中图分类号:

蔡闯, 黄永辉, 曹兴兵, 孙海涛, 贯世豪, 黄文康, 韩博. 星形胶质细胞来源细胞外囊泡促进大鼠神经干细胞向神经元的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3845-3851.

Cai Chuang, Huang Yonghui, Cao Xingbing, Sun Haitao, Guan Shihao, Huang Wenkang, Han Bo. Astrocyte-derived extracellular vesicles promote the differentiation of rat neural stem cells into neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3845-3851.

图/表（结果） 6

2.1 神经干细胞的形态及鉴定结果刚提取培养的神经干细胞有少量贴壁，大部分悬浮呈单细胞样分布，折光性好。随着培养时间进展，可见悬浮细胞聚集成团，呈桑葚状，且大小不等，细胞纯度增高。然后细胞团直径逐渐增大，部分克隆球中心变暗，经消化换液及传代后形态更加均匀、规整、折光性好且无明显突起，见图1A-C。免疫荧光检测结果显示，提取的细胞高表达神经干细胞标志性蛋白 CD133和Nestin，提示获得较高纯度的神经干细胞，见图1D-I。

2.2 星形胶质细胞形态及鉴定结果提取培养的星形胶质细胞形态呈典型的不规则星状。随着培养时间进展，细胞数量逐渐增多，纯度逐渐增高，见图2A-C。免疫荧光检测结果显示，提取的细胞中星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白呈现高表达，且细胞纯度达到(96.11±1.52)%以上，提示细胞纯度高，符合后续实验需求，见图2D-F。

2.3 AS-EVs的鉴定透射电子显微镜观察 AS-EVs 形态近似圆形或椭圆形杯状，直径在20-200 nm，见图3A；动态光粒子散射仪显示AS-EVs直径分布在10-200 nm之间，见图3B；Western blot结果示AS-EVs中细胞外囊泡特异性标志蛋白TSG101及CD63高表达，见图3C；上述结果显示提取的AS-EVs符合细胞外囊泡标准。

2.4 AS-EVs对神经干细胞存活率的影响 CCK-8结果显示随着AS-EVs质量浓度增加，神经干细胞增殖活性逐渐增强，根据统计学分析1.0 mg/mL与1.5 mg/mL组之间差异无显著性意义，故选用1.0 mg/mL AS-EVs进行后续实验，见图4A。
2.5 神经干细胞经等体积PBS及AS-EVs干预后的形态变化及免疫荧光检测 PBS组神经干细胞少量贴壁分化，贴壁细胞具有细长突起，呈神经元样，见图4B；而AS-EVs组神经干细胞大量贴壁分化，分化细胞胞体饱满，可见明显细长突起，呈神经元样，见图4C。免疫荧光检测结果显示AS-EVs 组较PBS组中神经元特异性标志物神经丝蛋白200、微管蛋白β3呈显著高表达(P < 0.01，n=3)，见图5A-M。
2.6 qRT-PCR及Western blot检测经 AS-EVs 干预后神经元细胞特异性指标的表达水平 AS-EVs 组较 PBS 组显著高表达神经元特异性标志物微管蛋白β3及神经丝蛋白200(P均 < 0.001，n=3)，见图5N-P，经多种方式验证得AS-EVs可以促进大鼠神经干细胞向神经元分化。

2.7 生物相容性图 4A 结果显示，AS-EVs可促进神经干细胞生长分化，且暂未发现随AS-EVs质量浓度增长而出现生物毒性作用从而抑制神经干细胞生长的现象，当前实验结果显示AS-EVs具有优良的生物相容性。

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引言

在中枢神经系统疾病中存在着包括脊髓损伤、脑卒中、脑缺血、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症等在内的一系列疾病，其以脑和(或)脊髓中神经元退行性变或丢失为主要特征，且人体对于这一系列疾病所造成损伤的自我修复能力较差[1]。随着当今社会人口老龄化问题的进展，剧增的中枢神经系统疾病患者也增加了社会的负担，愈发成为不可忽视的问题。而修复神经系统缺损、促进受损脑组织神经元修复再生便成为了治疗中枢神经系统疾病的重点[2-3]。
神经干细胞作为一种具有高度自我更新能力、多方向分化潜能的未成熟前体细胞，可以在特定条件下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等多种细胞谱系[4]。当前对于中枢神经系统损伤的治疗方式主要是外源干细胞移植，但自体的内源神经干细胞仍具有其不可替代的优势[5]。因此如何高效促进神经干细胞分化为神经元成为了如今的研究热点[6]。
星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多、分布范围最广、体型最大的胶质神经细胞[7]，不仅参与神经元信号的传递、营养支持与保护作用，还具有调节神经元突触可塑性等多种作用[8-10]。以往的看法认为中枢神经系统损伤后的微环境会刺激星形胶质细胞，将它转化为反应态，产生胶质瘢痕，分泌多种生长抑制因子，抑制中枢神经系统的自我修复[11]。然而最新的研究表明，反应性星形胶质细胞亦可限制炎症扩散[12]，其还可释放多种因子保护神经系统，避免损伤继发性加重[13]，在中枢神经系中有着不可忽视的地位。此外星形胶质细胞与神经元存在着密切联系，为探究改善神经系统损伤、促进神经元修复提供了新的切入点。
细胞外囊泡是一类内含蛋白质、脂质、DNA、RNA、细胞因子等多种物质的膜性囊泡样小体，内容物水平体现其母细胞的生物学状态[14]，参与细胞间通讯、细胞迁移分化、血管新生和免疫调节等多方面功能，且具有非致瘤性、低免疫原性、高生物相容性、分子质量小、脂溶性强可通过血脑屏障等特点，在治疗中枢神经系统疾病方面倍受关注[15-16]。
目前为止，尚未见相关研究报道星形胶质细胞来源细胞外囊泡(astrocyte extracellular vesicles，AS-EVs)能够诱导促进神经干细胞向神经元分化。此次研究通过AS-EVs体外干预神经干细胞，检测干预后的神经元特征性标记物表达水平，验证AS-EVs是否具有诱导促进神经干细胞分化为神经元的作用，为脊髓损伤等中枢神经系统疾病的治疗提供新策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外培养大鼠神经干细胞、星形胶质细胞；提取AS-EVs；使用AS-EVs干预体外培养的第3代神经干细胞。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2022年7月在江苏大学医学院基础研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物出生1-3 d 的SD大鼠 10 只，雌雄不限，由江苏大学动物实验中心提供，动物合格证编号：NO.202230033。
实验方案经江苏大学动物实验伦理委员会批准，批准号为 UJS-IACUC-AP-2020052902。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器设备 Accutase、胎牛血清、双抗(青霉素-链霉素)购自美国Gibco生物科技有限公司；DMEM/F12培养基、PBS购自美国海克隆有限公司；0.25%胰蛋白酶购自上海生兴生物科技有限公司；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27购自镇江科锐生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁分子科技有限公司；DAPI 染液、BCA测定试剂盒购自中国上海碧云天有限公司；荧光二抗购自美国Abcam有限公司；CD63 抗体、TSG101 抗体、微管蛋白β3抗体、神经丝蛋白200抗体、神经元特异性烯醇化酶抗体、髓鞘碱性蛋白抗体、生长相关蛋白43抗体、胶质纤维酸性蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；TRIzol 试剂购自日本宝生物株式会社；miScript SYBR Green PCR试剂盒购自德国QIAGEN公司；引物购自中国南京金斯瑞生物科技公司；PVDF膜、 0.22 μm无菌过滤器购自美国密理博公司；AllegraTMX-12R Centrifuge高速离心机、OptimaTM L-90K Ultracentrifuge超速离心机、 AvantiTM J-30I Centrifuge 超高速离心机、配套离心管均购自美国Beckman Coulter公司；70 μm细胞筛购自镇江易贝生物科技有限公司；动物实验外科器械购自上海医疗器械股份有限公司；微量可调移液器购自德国艾本德公司；超净工作台购自中国苏州安泰空气科技有限公司；相差倒置显微镜、荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；CO2细胞培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；Tecnai 12透射电镜购自荷兰飞利浦公司；动态光粒子散射仪购自美国怀亚特技术公司；Western blot电泳仪购自美国伯乐公司。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠的神经干细胞分离培养及鉴定
(1)分离培养：出生1-3 d的SD大鼠在体积分数为75%乙醇中浸泡5 min消毒，于无菌环境中取出其大脑组织，仔细剔除脑膜及血管组织，清洗、剪碎，加入含 EDTA的0.125%胰蛋白酶消化，移液器吹打混匀1 min；加入预先配置好的神经干细胞培养基(95% DMEM/F12，2% B27，20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮生长因子，1%双抗)终止消化，再次轻柔吹打混匀；7 μm细胞筛过滤掉较大的组织，4 ℃下以1 000 r/min 速度离心2次，每次5 min；弃上清，培养基重悬沉淀，接种于细胞培养皿中，于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中培养；次日全量换液，此后每2 d半量换液。每日观察细胞生长状况，待神经干细胞聚集成球且较大，球心折光度变暗时进行传代；4 ℃下以 1 000 r/min速度离心细胞悬液5 min，弃去上清，Accutase 37 ℃消化沉淀15 min，终止消化后轻柔吹打重悬；悬浮液1 000 r/min离心30 s，沉淀消化不充分的神经球；上清液1 000 r/min离心5 min，沉淀视情况可再次消化，重悬后接种于细胞培养皿中。选用第3代神经干细胞进行后续实验。

(2)鉴定：将高压灭菌后的圆形盖玻片置于24孔板，在其中接种第3代神经干细胞，每孔5 000-10 000个，细胞培养箱中培养48 h，待细胞球贴壁于盖玻片上，吸去培养液，使用预温的PBST荡洗3次，每次3 min；加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBST 洗3次，每次 3 min；0.5% Triton X-100 冰上透化 15 min，PBST洗3次，每次3 min；3% BSA室温封闭1 h；弃封闭液，加入CD133、Nestin一抗(1∶100稀释)，放在湿盒中4 ℃孵育过夜；PBST洗3次，每次3 min；加入二抗(1∶100稀释)，在温箱中37 ℃避光孵育1 h；PBST洗3次，每次3 min；加入DAPI (1∶100稀释)在温箱中37 ℃避光孵育5 min染核；PBST洗3次，每次3 min；防荧光淬灭剂封固，荧光倒置显微镜下拍照观察。

1.4.2 大鼠的星形胶质细胞分离培养及鉴定
(1)分离培养：出生1-3 d的SD大鼠在体积分数为75%乙醇中浸泡5 min消毒，于无菌环境中取出其大脑组织，仔细剔除脑膜及血管组织，清洗、剪碎，加入含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化，移液器吹打混匀1 min；加入预先配置好的星形胶质细胞培养基(89% DMEM/F12，体积分数为10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素)终止消化，再次轻柔吹打混匀；70 μm细胞筛过滤掉较大的组织，4 ℃下以1 000 r/min速度离心2次，每次5 min；弃上清，培养基重悬沉淀，接种于细胞培养皿中，于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中培养。次日全量换液，此后每2 d半量换液，约7 d后细胞铺满皿底；细胞长满皿底面积约80%时，置于培养箱摇床200 r/min摇晃4 h，去除非目的细胞，纯化星形胶质细胞。待细胞长满皿底面积约85%时进行传代。选用第3代星形胶质细胞进行后续实验。

(2)鉴定：将高压灭菌后的圆形盖玻片置于24孔板，在其中接种第3代星形胶质细胞，每孔5 000-10 000个，细胞培养箱中培养48 h，待细胞球贴壁于盖玻片上，吸去培养液，使用预温的PBST荡洗3次，每次3 min；加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBST洗3次，每次3 min；0.5% Triton X-100 冰上透化15 min，PBS洗3次，每次3 min；3% BSA室温封闭1 h；弃封闭液，加入胶质纤维酸性蛋白一抗(GFAP，1∶100稀释)，放在湿盒中4 ℃孵育过夜；PBST洗3次，每次3 min；加入二抗(1∶100稀释)，在温箱中37 ℃避光孵育1 h；PBST洗3次，每次3 min；加入DAPI (1∶100稀释)在温箱中37 ℃避光孵育5 min染核；PBST洗3次，每次3 min；防荧光淬灭剂封固，荧光倒置显微镜下拍照观察。

1.4.3 AS-EVs的分离及鉴定
(1)分离提取：待培养的星形胶质细胞融合度超过80%，改用含有体积分数为10%无细胞外囊泡血清(普通胎牛血清4 ℃ ，120 000×g 超速离心16 h)的DMEM/F12培养基培养星形胶质细胞36 h，收集细胞上清液；超速离心机4 ℃下超离AS-EVs，分别500×g离心10 min；2 000×g离心15 min；10 000×g离心30 min，去除每次离心所得沉淀；0.22 μm滤器过滤上清液；滤过液100 000×g离心3 h，弃上清；PBS洗涤重悬沉淀，再次100 000×g离心3 h；加入PBS重悬沉淀，用EP管收集重悬后的细胞外囊泡，-80 ℃保存备用。
(2)鉴定：①透射电子显微镜观察记录AS-EVs的形态：取适量AS-EVs悬液滴于透射电镜专用铜网沉淀1 min，滴加2%磷钨酸于铜网上负染5-10 min，常温干燥15 min，处理好的样本于透射电镜下拍照观察；②动态光粒子散射检测AS-EVs粒径：将提取的AS-EVs用PBS稀释20倍，动态光粒子散射仪检测分析；③BCA试剂盒检测AS-EVs质量浓度，Western blot检测AS-EVs特异性标记蛋白TSG101、CD63的表达：BCA测得AS-EVs质量浓度为30 mg/mL；收集星形胶质细胞及 AS-EVs，加入5×loading buffer混匀后加热5 min至蛋白变性，然后进行电泳、转膜、孵育及曝光显影。
1.4.4 CCK-8 法检测细胞存活率将第3代神经干细胞以1×103/孔(每孔加量100 μL)的密度接种于 96 孔板中，设置 0(PBS)，0.1，0.5，1.0，1.5 mg/mL等5个质量浓度梯度，分别添加相应浓度AS-EVs，于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中培养，72 h后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，每孔加入10 μL CCK-8试剂，并设3个空白对照孔，于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中避光孵育，2 h后使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
1.4.5 实验分组及干预选取第3代神经干细胞，以每孔5×104个接种于6孔板，随机分为 PBS 组及AS-EVs组，分别将同体积的PBS、AS-EVs (1 mg/mL)加入到含2 mL无血清培养基(99% DMEM/F12，1%青霉素-链霉素)的6孔板内，于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中培养6 d。
1.4.6 免疫荧光染色检测神经干细胞分化效率将高压灭菌后的圆形盖玻片置于24孔板，将神经干细胞接种于24孔板中干预(PBS、1 mg/mL AS-EVs) 6 d，待细胞球分化贴壁于盖玻片上，吸去培养液，使用预温的PBST荡洗3次，每次3 min；加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBST洗3次，每次3 min；0.5% Triton X-100冰上透化15 min，PBS洗3次，每次3 min；3% BSA室温封闭1 h；弃封闭液，加入一抗神经丝蛋白200及微管蛋白β3 (1∶100稀释)，放在湿盒中4 ℃孵育过夜；PBST洗3次，每次3 min；加入二抗(1∶100稀释)，在温箱中37 ℃避光孵育 1 h；PBST洗3次，每次3 min；加入DAPI (1∶100稀释)在温箱中37 ℃避光孵育5 min染核；PBST洗3次，每次3 min；防荧光淬灭剂封固，荧光倒置显微镜下拍照观察。

1.4.7 qRT-PCR 检测 mRNA 表达水平使用TRIzol 试剂盒从两组干预过(PBS、1 mg/mL AS-EVs)的神经干细胞中提取总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录为 cDNA，使用荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量 PCR反应。使用 2-ΔΔCT 法计算相关 mRNA的相对表达水平，最后通过GraphPad Prism进行分析作图。引物序列见表1。

1.4.8 Western blot 检测蛋白表达水平吸取两组干预过(PBS、1 mg/mL AS-EVs)的神经干细胞悬液，1 000×g离心5 min，沉淀加入含蛋白酶磷酸酶抑制剂、PMSF的蛋白裂解液重悬混匀，冰上裂解10 min，刮取至EP管中，4 ℃下12 000×g 离心15 min；加入5× loading buffer吹打均匀后100 ℃加热10 min；再次12 000×g离心15 min。取适量蛋白质样品行凝胶电泳，80 V电泳至Marker条带开始分离；调至 120 V继续电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部停止电泳，300 mA转膜150 min至PVDF膜；5%牛血清白蛋白封闭1 h之后加入一抗GAPDH抗体、微管蛋白β3抗体、神经丝蛋白200抗体(1∶1 000稀释) 4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜3次，每次8 min；用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min；最后对条带进行曝光显影。
1.5 主要观察指标采用免疫荧光、qRT-PCR、Western blot 等多种方式检测PBS、AS-EVs(1 mg/mL)干预后神经元特异性指标表达水平。
1.6 统计学分析使用 GraphPad Prism进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组数据间采用单因素方差分析，组间采用 SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义，每项实验至少重复3遍。文章统计学方法已经通过江苏大学统计学专家审核。

讨论

中枢神经系统疾病因其高死亡率及致残率日益受到人们的关注[17]，在过去中枢神经系统损伤被认为是一种永久性损伤，它导致的运动和感觉系统障碍是不可逆的，然而随着现代医学的发展，这一陈旧性的观念被打破[18]。现代医学发现，神经系统损伤的修复是个缓慢而复杂的过程，而如何加快这个修复过程则成为了当下研究的热点。星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多、分布范围最广、体型最大的胶质神经细胞，不但参与了神经元的信号传递、营养支持与保护作用，还与神经元突触的重塑有着密切联系[19]。而细胞外囊泡内含来自母体细胞的多种DNA、RNA、蛋白质及细胞因子的物质，高度体现母细胞的生理功能[20]，且存在生物相容性高、免疫原性低、非致瘤性、便于提取及储存、易通过血脑屏障等优点，故AS-EVs是否参与神经元的再生值得进一步探究。此次实验重点探究了AS-EVs 是否能诱导促进神经干细胞向神经元分化。体外培养细胞活力强、状态良好的第3代神经干细胞经AS-EVs干预后，诱导其分化。实验结果显示，经AS-EVs 干预后的细胞中微管蛋白β3和神经丝蛋白 200表达水平较PBS干预组明显增高，表明AS-EVs具有诱导促进神经干细胞向神经元分化的作用。
研究显示星形胶质细胞及其细胞外囊泡在中枢神经系统中的作用具有两面性。生理条件下，AS-EVs具有保护和营养神经的成分；在炎症、应激、营养缺乏等条件刺激下星形胶质细胞可通过调整AS-EVs中的成分以达到抑制神经元凋亡并减轻其损伤[21-22]、促进轴突再生重塑、调节机体免疫反应等作用[23]。而阿尔茨海默病患者星形胶质细胞分泌的AS-EVs具有损伤神经元并降低其存活率的作用[24]，而阿尔茨海默病患者的病理特征性物质淀粉样蛋白和 Tau 蛋白也被发现可能是通过AS-EVs释放到血清中[25]。还有报道显示早期肌萎缩性侧索硬化症患者的AS-EVs中不仅含有超氧化物歧化酶1等致病蛋白及高表达的白细胞介素6[26-27]，还参与到突变型超氧化物歧化酶1在中枢神经系统中的传递转移[28]，从而造成肌萎缩性侧索硬化症患者神经元病理和疾病的进展。此外，ISHII等[29]的研究发现，AS-EVs与帕金森病的发病相关。综上所述，AS-EVs在中枢神经系统生理及病理方面有着不可忽视的地位，其在临床方面的应用也具有相当的潜力。因此，通过AS-EVs诱导促进神经干细胞分化为神经元，以此治疗脊髓损伤等中枢神经系统疾病这一策略具有重要的临床价值。相对于手术移植外源性细胞，自体内源性神经干细胞分化为神经元既满足了治疗的需要，又避免了排斥反应及手术产生的外源性污染及疾病传播等风险。此外通过细胞外囊泡干预诱导自体神经干细胞分化为神经元相比干细胞移植损伤更小，细胞外囊泡因其生物学特性易通过血脑屏障且致瘤风险较低、生物相容性高，为脊髓损伤等中枢神经系统疾病的治疗提供了新方向[30]。
已有研究表明，AS-EVs对于中枢神经系统具有保护作用，能够减轻患者神经元受到的损伤[31]。关于神经干细胞向神经元转化的机制已存在相关报道，如刘宗秀等[32]的研究显示，经Notch通路抑制剂干预的大鼠在神经干细胞移植手术后，相较单纯手术组脑缺血导致的神经元损伤明显缓解。而LI等[33]也发现通过阻断Notch通路可以抑制姜黄素对于神经干细胞增殖以及分化为神经元的能力。WU等[34]的研究也证实低强度脉冲超声是通过刺激上调Notch1和Hes1的表达水平，触发神经干细胞的增殖及神经元的分化。此外还有Hes通路及Wnt通路等[35-36]，近些年来都被发现参与了神经干细胞向神经元的分化。结合相关报道，作者猜想 AS-EVs 可能是通过调控 Notch通路调控神经干细胞向神经元转化，但细胞外囊泡内容物成分复杂，包括DNA、RNA、生长因子、蛋白质在内的多种物质，具体是哪种内容物在诱导神经干细胞向神经元的过程中起作用仍有待探究。作者认为AS-EVs促进神经干细胞向神经元分化的作用可能与细胞外囊泡中包含的miRNA有关。如QIAO等[37]发现miR-153通过抑制Jagged1和Hey2翻译，调控Notch信号通路，促进神经干细胞向神经元分化。此外，miR-124[38]、miR-17-92[39]、miR-615[40]、miR-9[41]、miR-29a等miRNA近些年来都被证实具有促进神经干细胞向神经元分化的功能[42]。但AS-EVs中的主要作用成分是否为这些miRNA以及其具体作用通路机制仍需后续实验探究，且由AS-EVs诱导分化产生的“神经元”是否能够替代原有神经元功能，以及AS-EVs的最佳干预质量浓度与时间还有待验证补充。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

星形胶质细胞来源细胞外囊泡促进大鼠神经干细胞向神经元的分化

Astrocyte-derived extracellular vesicles promote the differentiation of rat neural stem cells into neurons

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