缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤

doi:10.12307/2023.168

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (16): 2518-2524.doi: 10.12307/2023.168

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缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤

夏宇1，2，孙佳2，齐争艳1，2，马琳1，2，马文倩2，牛建国1，2，文玉军1，2

宁夏医科大学，1基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，2颅脑疾病重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2022-04-09 接受日期:2022-06-08 出版日期:2023-06-08 发布日期:2022-11-10
通讯作者: 文玉军，教授，硕士生导师，宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，颅脑疾病重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:夏宇，男，1994年生，湖南省邵阳市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事脊髓损伤修复研究。
基金资助:
宁夏自然科学基金项目(2020AAC03182)，项目负责人：文玉军；国家自然科学基金项目(81660216)，项目负责人：文玉军；宁夏重点研发计划项目(2021BEG03096)，项目负责人：文玉军

Repair effect of poly(lactic-co-glycolic acid) nanospheres with sustained-release of neurotrophin-3 and ganglioside GD1a on spinal cord injury in rats

Xia Yu1, 2, Sun Jia2, Qi Zhengyan1, 2, Ma Lin1, 2, Ma Wenqian2, Niu Jianguo1, 2, Wen Yujun1, 2

1Department of Human Anatomy and Histology Embryology, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Ningxia Key Laboratory of Craniocerebral Diseases, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2022-04-09 Accepted:2022-06-08 Online:2023-06-08 Published:2022-11-10
Contact: Wen Yujun, Professor, Master’s supervisor, Department of Human Anatomy and Histology Embryology, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Key Laboratory of Craniocerebral Diseases, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Xia Yu, Master candidate, Department of Human Anatomy and Histology Embryology, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Key Laboratory of Craniocerebral Diseases, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Ningxia Natural Science Foundation Project, No. 2020AAC03182 (to WYJ); National Natural Science Foundation of China, No. 81660216 (to WYJ); Ningxia Key Research & Development Program, No. 2021BEG03096 (to WYJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经营养因子3：是神经营养因子家族的一员，在脊髓内表达，可促进感觉神经轴突的再生、增强再生轴突和备用轴突的轴突延长，具有神经保护作用，还能明显减轻胶质瘢痕形成。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物：是由乳酸和羟基乙酸单体无规共聚而成，是一种可降解的高分子有机化合物，由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特性和安全性，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲医药机构(EMA)已经批准将聚乳酸-羟基乙酸共聚物用于开发人体医疗材料。

背景：非侵入式脊髓损伤治疗方法亟待开发。纳米材料能够递送药物，提高治疗效果，具有明显优势。
目的：制备缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，探究其对大鼠脊髓损伤的修复作用。
方法：采用油水乳液挥发有机溶剂法，制备缓释神经营养因子3的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，检测微球的缓释性能。采用随机数字表法将60只雌性SD成年大鼠分为5组：假手术组打开椎板后直接缝合，脊髓损伤组建立脊髓T9撞击损伤模型，神经营养因子组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球悬液，神经节苷脂组脊髓T9损伤区域注射缓释经节苷脂GD1a的纳米微球悬液，实验组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的纳米微球混合悬液，每组12只。术后每周进行旷场实验及BBB评分，术后4，8周进行脊髓组织形态学观察。
结果与结论：①体外浸泡于PBS 14 d内，缓释纳米微球可持续释放神经营养因子3和神经节苷脂GD1a。②术后7，8周，与脊髓损伤组比较，神经营养因子组、实验组大鼠的BBB评分、旷场总移动距离增加(P < 0.05)。尼氏染色显示，实验组术后4，8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经营养因子组术后8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P < 0.05)。免疫荧光染色显示，与脊髓损伤组比较，神经营养因子组术后8周、实验组术后4，8周的脊髓白质腹侧神经纤维增多(P < 0.05)，神经节苷脂组、实验组术后4，8周的脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达增加(P < 0.05)，神经营养因子组术后8周的髓鞘碱性蛋白表达增加(P < 0.05)，神经营养因子组、实验组术后8周的下行脊髓固有束增加(P < 0.05)。③结果表明，神经营养因子3微球单独应用，或是与神经节苷脂GD1a微球联合应用，能够促进脊髓损伤区周边运动神经元及神经纤维存活，并可改善大鼠后肢运动功能。
https://orcid.org/0000-0002-2120-7786(夏宇)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 神经营养因子3, 神经节苷脂, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物, 组织工程, 神经再生

Abstract: BACKGROUND: Non-invasive treatment of spinal cord injury needs to be developed urgently. Nanomaterials have obvious advantages, which can deliver drugs and improve the therapeutic effect.
OBJECTIVE: To fabricate sustained-release nanospheres containing neurotrophin-3 and ganglioside GD1a by poly(lactic-co-glycolic acid) and investigate their effects on the repair of spinal cord injury in rats.
METHODS: Poly(lactic-co-glycolic acid) nanospheres encapsulated with neurotrophin-3 and ganglioside GD1a were prepared using oil-water emulsion volatile organic solvent method. The sustained release properties of microspheres were tested. Sixty female adult SD rats were randomly divided into five groups with 12 rats in each group. In the sham operation group, the lamina was opened and sutured directly. In the spinal cord injury group, a spinal cord T9 impingement injury model was established. In the neurotrophin group, the nanosphere suspension of slow-release neurotrophin-3 was injected into the injured area of spinal cord T9. In the ganglioside GD1a group, the sustained-release ganglioside GD1a nanosphere suspension was injected into the spinal cord T9 injury area. The experimental group was injected with nanosphere suspension of sustained-release neurotrophin-3 and ganglioside GD1a in the injured area of spinal cord T9. Open field test and BBB scoring were conducted weekly after operation. The sections were taken 4 and 8 weeks after surgery for morphological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After soaking in PBS for 14 days in vitro, the sustained-release nanospheres could continuously release neurotrophin-3 and ganglioside GD1a. (2) At 7 and 8 weeks after surgery, compared with the spinal cord injury group, the BBB score and the total open field distance of the rats increased in the neurotrophin group and the experimental group (P < 0.05). The results of Nissl staining showed that at 4 and 8 weeks after surgery, the number of motor neurons increased in the anterior horn of caudal gray matter in the experimental group compared with the spinal cord injury group (P < 0.05). At 8 weeks after surgery, the number of motor neurons increased in the anterior horn of caudal gray matter in the neurotrophin group compared with the spinal cord injury group (P < 0.05). The results of immunofluorescence staining showed that compared with the spinal cord injury group, the neurotrophin group at 8 weeks and the experimental group at 4 and 8 weeks had increased spinal white matter ventral nerve fibers (P < 0.05); the expression of myelin basic protein on the ventral side of the spinal cord white matter increased at 4 and 8 weeks in the ganglioside GD1a and experimental groups (P < 0.05); the expression of myelin basic protein in the neurotrophin group increased at 8 weeks after operation (P < 0.05); the descending propriospinal tract increased in the neurotrophin group and the experimental group at 8 weeks (P < 0.05). (3) The results showed that neurotrophin-3 microspheres alone or in combination with ganglioside GD1a microspheres could promote the survival of motor neurons and nerve fibers around the spinal cord injury site and improve the motor function of the hind limbs of rats.

Key words: spinal cord injury, neurotrophin-3, gangliosides, poly(lactic-co-glycolic acid), tissue engineering, nerve regeneration

中图分类号:

夏宇, 孙佳, 齐争艳, 马琳, 马文倩, 牛建国, 文玉军. 缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(16): 2518-2524.

Xia Yu, Sun Jia, Qi Zhengyan, Ma Lin, Ma Wenqian, Niu Jianguo, Wen Yujun. Repair effect of poly(lactic-co-glycolic acid) nanospheres with sustained-release of neurotrophin-3 and ganglioside GD1a on spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(16): 2518-2524.

图/表（结果） 6

2.1 纳米微球的形态及体外缓释性能在扫描电镜下可见两种微球均呈圆球形，直径0.1-0.6 μm，大小均一，表面光滑，有少量微球表面有凹陷，见图1A、B。体外14 d内，纳米微球持续释放神经营养因子3与神经节苷脂GD1a，PLGA/NT-3纳米微球释放神经营养因子3的质量浓度维持在30 ng/L左右，PLGA/GD1a纳米微球前10 d释放神经节苷脂GD1a的质量浓度在40-50 ng/L，而后质量浓度缓慢降低，但仍在20 μg/L左右，见图1C、D。

2.2 各组大鼠后肢运动功能恢复情况所有大鼠术前BBB评分均为满分，术后无意外死亡。除假手术组外，其余4组大鼠术后1 d均呈截瘫状态，后肢运动功能丧失，靠前肢爬行，BBB评分为0分；从术后2周开始，大鼠后肢运动功能开始恢复，神经营养因子组、实验组大鼠术后第7，8周的BBB评分高于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经节苷脂组大鼠术后的BBB评分与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2A。
旷场实验结果显示，神经营养因子组、实验组大鼠术后第7，8周的旷场移动总距离大于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经节苷脂组大鼠术后的旷场移动总距离与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2B。

2.3 各组大鼠脊髓损伤区尾侧灰质前角运动神经元变化尼氏染色结果显示，与假手术组相比，其他4组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓灰质前角运动神经元均不同程度地减少；术后4周，实验组大鼠脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经营养因子组、神经节苷脂组脊髓灰质前角运动神经元与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后8周，神经营养因子组、实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓灰质前角运动神经元数量多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经节苷脂组脊髓灰质前角运动神经元数量与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 各组大鼠脊髓损伤区尾侧白质腹侧神经纤维NF表达免疫荧光染色显示，与假手术组相比，其他4组大鼠脊髓损伤区尾侧白质腹侧神经纤维NF表达均不同程度地减少；术后4周，实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经营养因子组、神经节苷脂组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。术后8周，神经营养因子组、实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经节苷脂组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 各组大鼠脊髓损伤区尾侧白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达免疫荧光染色显示，与假手术组相比，其他4组大鼠脊髓损伤区尾侧白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达均不同程度地减少；术后4周，神经节苷脂组、实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经营养因子组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后8周，神经营养因子组、神经节苷脂组和实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达均多于脊髓损伤组(P < 0.05)，见图5。

2.6 各组脊髓损伤区神经示踪情况免疫荧光染色显示，假手术组纵切片观察可见大量的生物素化葡聚糖胺标记的神经纤维，神经营养因子组、实验组大鼠脊髓损伤区尾侧生物素化葡聚糖胺标记的下行脊髓固有束多于脊髓损伤组(P < 0.05)，神经节苷脂组大鼠脊髓损伤区尾侧生物素化葡聚糖胺标记的下行脊髓固有束与与脊髓损伤组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

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引言

脊髓损伤是指脊髓的结构和功能受到创伤、炎症、肿瘤等损害，导致损伤水平以下的运动、感觉和自主神经功能受损[1]。目前脊髓损伤的临床治疗主要包括手术治疗、对症治疗和康复治疗[2]，尽管这些治疗方法有一定效果，但仍缺乏足够的证据支持患者运动功能恢复，患者长期生活在膀胱功能障碍、性功能障碍及尿路感染等并发症之中[3]，给患者及家属造成巨大的身心伤害并造成一系列社会问题[4-6]。因此，脊髓损伤的治疗和康复是一个亟待研究的课题[7]，开发新的干预措施是提高脊髓损伤患者生活质量的迫切需要[8]。
神经营养因子3是神经营养素家族中的一员，有研究表明其对神经系统的发育和成熟必不可少，包括调节神经元存活、轴突生长、突触可塑性和神经传递[9]。神经节苷脂GD1a是一类存在于细胞膜中的化合物，它们在中枢神经系统的细胞膜中含量尤其丰富[10-11]。神经节苷脂GD1a是一种阴离子型脑神经节苷脂，对神经再生有促进作用[12]。有研究表明，神经节苷脂GD1a可作为一种潜在的新的治疗药物用于改善髓鞘再形成的环境[13]，而髓鞘再生对于轴突传导和代谢至关重要[14]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是由乳酸和羟基乙酸单体无规共聚而成，是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、良好的成囊和成膜特性，被广泛应用于制药、医用材料等领域[15-17]。
因此，将具有促神经再生作用的神经营养因子3和具有促髓鞘再生活性的神经节苷脂GD1a联合应用，应该能够有助于神经元、神经纤维的再生和修复，并且以具有不断降解特性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体包封两种因子，形成缓释微球，将其注射于大鼠脊髓损伤部位，希望通过微球的不断缓释，神经营养因子3和神经节苷脂GD1a持续释放并协同发挥作用，能够促进大鼠脊髓损伤后脊髓组织修复和运动功能恢复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备及随机分组动物实验，组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。
1.2 时间及地点实验于2021年5-12月在宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验主要试剂神经营养因子3、神经节苷脂GD1a、牛血清白蛋白、聚乳酸-羟基乙酸共聚物购自于Sigma公司；神经营养因子3 ELISA试剂盒、神经节苷脂GD1a ELISA试剂盒购自于江莱生物公司；兔抗NF-160单克隆抗体、大鼠单克隆髓鞘碱性蛋白抗体、山羊抗兔荧光二抗488购自于Abcam公司；驴抗大鼠荧光二抗647购自于Abbkine公司；BDA-10000试剂盒购自于Molecular Probe公司；BDA荧光二抗购自于Jackson公司；荧光封固剂(含DAPI)购自于中杉金桥公司。
1.3.2 实验动物成年雌性SD大鼠60只，SPF级，体质量230-280 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，质量检测单位为陕西省实验动物质量监督检测中心[许可证号 SCXK(宁)2020-0001]。大鼠在安静环境下饲养，动物房温度控制在(22±2) ℃，保持动物房内昼夜节律，不限制摄食和饮水。动物实验严格遵循3R原则。实验方案经宁夏医科大学伦理委员会批准(宁医大伦理第2020-051号)。
1.4 实验方法
1.4.1 缓释纳米微球的制备参照课题组前期发表的文献进行[18-20]，简要制备过程如下：取0.2 g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Mw=7-17 kD)溶解于2 mL二氯甲烷中，得到10%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；取10 μg 神经营养因子3或者神经节苷脂GD1a，分别加入到1 mL的牛血清白蛋白溶液(50 g/L)中，充分振荡；将上述溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液混合振荡，使其成乳白色悬液；加入1%的聚乙烯醇溶液10 mL，使用超声细胞破碎仪得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物乳液；将上述乳液加入到0.3%的聚乙烯醇溶液80 mL中，使用保鲜膜封口并留孔透气，磁力搅拌12 h，使得有机溶剂二氯甲烷挥发完毕；将产物以10 000 r/min重悬离心3次，每次10 min，最后将重悬的溶液用冷冻干燥机冻干备用，得到缓释神经营养因子3的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(记为PLGA/NT-3)纳米微球与缓释神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(记为PLGA/GD1a)纳米微球，扫描电镜下观察微球形态。
1.4.2 纳米微球的释放检测取1 mg PLGA/NT-3、PLGA/GD1a纳米微球，分别溶于100 μL PBS中，各制备14×6份，密封后置于37 ℃恒温摇床孵育，每天取出其中6份，1 000 r/min离心10 min，取出上清液，密封放置于-20 ℃冰箱内备用。连续14 d取样后，分别用神经营养因子3、神经节苷脂GD1a ELISA试剂盒检测其释放量。
1.4.3 实验分组及造模干预采用完全随机数字表法将60只SD大鼠分为5组：①假手术组，大鼠麻醉后打开T9椎板再逐层缝合；②脊髓损伤组，打开T9椎板，建立脊髓T9撞击模型；③神经营养因子组，建立脊髓T9撞击模型后，于损伤部位脊髓内(注射深度1.5 mm)注射100 μL PLGA/NT-3微球悬液；④神经节苷脂组，建立脊髓T9撞击模型后，于损伤部位脊髓内注射100 μL PLGA/GD1a微球悬液；⑤实验组，建立脊髓T9撞击模型后，于损伤部位脊髓内注射100 μL含PLGA/NT-3微球与PLGA/GD1a微球的混合悬液。每组12只。
大鼠脊髓T9撞击模型的制作[21]：经异氟烷麻醉后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，备皮消毒，以T11椎体棘突作为定位标志，行背正中切口，切开皮肤，依次分离皮下筋膜、肌肉，暴露T8-T11棘突及椎板，用单关节骨剪咬去T8-T11棘突及T9椎板，充分暴露脊髓，使用脊髓打击器(型号：68097，购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，所用撞针直径2.5 mm，撞锤质量为15 g，撞锤下落高度20 cm)对T9节段进行撞击，建立脊髓撞击损伤模型。脊髓撞击损伤后，大鼠出现身体扭曲、双后肢扑动、尾巴抽搐等，提示造模成功。造模后即刻，各组分别于损伤部位注射微球。依次缝合肌肉、筋膜和皮肤，消毒后将大鼠置于恒温台等待苏醒。术后单笼饲养，每天2次腹部按摩辅助排尿，直至建立完整的排尿反射。
生物素化葡聚糖胺示踪：脊髓损伤6周后，经异氟烷麻醉，将大鼠俯卧位固定于手术台上，备皮消毒，以C7椎体棘突作为定位标志，行背正中切口，切开皮肤，依次分离皮下筋膜、肌肉，暴露C5-C7棘突及椎板，用单关节骨剪咬去C5-C7棘突及C6椎板，充分暴露脊髓，于C6脊髓节段正中旁开0.5 mm双侧注射10%生物素化葡聚糖胺示踪剂各500 μL，注射深度1.8 mm(注射至脊髓灰质Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ层)，依次缝合肌肉、筋膜和皮肤，消毒后将大鼠置于恒温台，等待苏醒。
1.4.4 大鼠后肢运动功能评价采用BBB评分和旷场实验对大鼠后肢运动功能进行评价[22]，每周1次。BBB评分前让大鼠在开放环境适应10 min，每次评分至少观察5 min。旷场实验是将大鼠置于100 cm×100 cm的旷场内自由运动5 min，统计其在旷场中的总移动距离[23]。旷场实验在隔音强的屋内进行，保持每次光强、温度、湿度一致。每次实验结束后，用体积分数75%乙醇对旷场底部、侧壁进行清洁，以免此次大鼠遗留的尿便及气味对下次测试结果造成影响。
1.4.5 灌注取材切片及染色术后4，8周，每组每个时间点随机选6只大鼠，麻醉后依次灌入生理盐水及多聚甲醛，将脊髓组织在40 g/L多聚甲醛溶液中后固定4 h；将脊髓组织置于20%蔗糖PBS溶液中进行脱水，冰冻切片，切片厚度30 μm。
尼氏染色：对脊髓损伤区尾侧6-8 mm处的脊髓断面进行尼氏染色，观察脊髓损伤区尾侧灰质前角运动神经元数量。将切片置于孵育盒内，PBS复水10 min；将切片置于尼氏染液A液56 ℃浸染10 min；流水冲洗5 min；将切片置于尼氏染液B液中分化1 min；上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封固，晾干后显微镜下观察拍片。
免疫荧光染色：对脊髓损伤区尾侧6-8 mm处的脊髓断面进行免疫荧光染色，检测脊髓损伤区尾侧白质腹侧神经纤维、尾侧白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达及生物素化葡聚糖胺示踪情况。复水10 min，0.3%PBS-T中通透3 h，PBS洗后抗原修复，冷却后PBS清洗，组化笔画圈后5%牛血清白蛋白封闭30 min；加入一抗神经丝蛋白(1∶100)、髓鞘碱性蛋白(1∶200)4 ℃孵育过夜；PBS洗后，加入二抗(山羊抗兔荧光二抗488，1∶400；驴抗大鼠荧光二抗647，1∶400；BDA荧光二抗，1∶500)避光孵育2 h，PBS洗后染核、封固，避光晾干后显微镜下观察拍片。
1.5 主要观察指标各组大鼠后肢运动功能及脊髓组织形态。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 26.0统计软件分析，计量资料用x±s表示，组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P≤0.05为差异有显著性意义。使用Graphpad Prism 8绘制统计图。该文统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家张瑞审核。

讨论

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤性疾病，会导致患者不同程度的运动和感觉障碍[24-25]，给患者及家庭带来极大的情感、身体和经济负担[26-27]。损伤后的不良微环境(包括炎症、胶质瘢痕、空洞等)、神经元丢失、再生能力降低等严重阻碍脊髓损伤后的功能恢复[28]，因此，改善微环境同时补充受损神经元，以形成新的中继通路至关重要[29]。有研究发现，补充神经营养因子可改善微环境，从而能够促进脊髓损伤后大鼠和非人类灵长类动物的内源性修复[30]。神经营养因子3是神经营养因子家族的一员，具有增强轴突延长和神经保护作用[16，31]。神经节苷脂GD1a能选择性地调节抑制髓鞘再形成的有害环境，促进髓鞘形成[13]。近年来，各种纳米材料的发展为跨越血脊髓屏障治疗脊髓损伤提供了有应用前景的新手段[32]。从生物学和安全性的角度来看，体外和体内研究已确定聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种安全的可生物降解聚合物，其水解副产物乳酸和羟基乙酸在体内很容易代谢[33-34]，而且研究证实将其注射于中枢神经系统后无不良生物学效应[35]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的力学性能和生物特性，是用于制造缓释药物的最佳候选材料[16，36]。
此次实验采用油水乳液挥发有机溶剂法将神经营养因子3和神经节苷脂GD1a包埋在可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中[34]，形成一种可缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的药物递送体系，并探究其对大鼠脊髓损伤的修复作用。
形态观察和释放实验结果显示，此次实验成功构建了能缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的纳米微球载药体系，该缓释纳米微球能够在脊髓损伤部位缓慢、持续地释放神经营养因子3和神经节苷脂GD1a。行为学结果显示，神经营养因子组大鼠术后第7，8周的BBB评分和在旷场移动总距离均高于脊髓损伤组，实验组大鼠术后6-8周的BBB评分和在旷场移动总距离均高于脊髓损伤组。在术后护理中也发现，神经营养因子组和实验组大鼠比脊髓损伤组大鼠恢复自主排尿时间更短，表明PLGA/NT-3和PLGA/NT-3+PLGA/GD1a纳米微球治疗能促进大鼠脊髓损伤后后肢的运动功能恢复以及膀胱排尿反射的及早建立[6，37]，且实验组大鼠运动功能改善情况比神经营养因子组大鼠出现时间要早，提示PLGA/NT-3和PLGA/GD1a联合用药比PLGA/NT-3单独用药效果更好。PLGA/GD1a单独用药作用不明显，但能和PLGA/NT-3协同发挥作用。
术后4，8周，对脊髓损伤区尾侧6-8 mm处的脊髓断面进行尼氏染色，观察脊髓灰质前角运动神经元的变化，结果显示，术后8周神经营养因子组和实验组脊髓尾侧灰质前角运动神经元数量均高于脊髓损伤组，表明PLGA/NT-3和PLGA/GD1a缓释微球能够持续发挥作用，促进损伤区尾侧运动神经元的存活[38]。有研究发现，脊髓撞击伤后动物后肢运动功能的恢复与残存的下行脊髓固有束密切相关，这些下行脊髓固有束与腰髓灰质运动神经元形成突触连接，传导来自损伤区吻侧下行皮质脊髓束、红核脊髓束的神经冲动，从而控制后肢的随意运动[18]。此次实验中，大鼠后肢运动功能的恢复可能与投递到损伤区的神经营养因子3促进运动神经元存活，进而增加了下行脊髓固有束与腰髓灰质运动神经元的突触连接有关。
免疫荧光染色发现，术后8周，神经营养因子组和实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达较脊髓损伤组均增多，而神经节苷脂组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧神经纤维NF表达与脊髓损伤组无统计学差异，表明PLGA/NT-3缓释微球能够促进损伤区周边神经纤维的存活。术后8周，神经营养因子组、神经节苷脂组和实验组大鼠脊髓损伤区尾侧脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达较脊髓损伤组均增多，表明PLGA/NT-3和PLGA/GD1a缓释微球均能够促进损伤区周边髓鞘的再生或修复[10，31，39]，而髓鞘的完整性对于轴突传导速度的恢复和对轴突的代谢支持至关重要[14]。生物素化葡聚糖胺示踪结果显示，术后8周，神经营养因子组和实验组大鼠脊髓损伤区尾侧生物素化葡聚糖胺阳性神经纤维较脊髓损伤组均增多，表明PLGA/NT-3微球对残存的下行脊髓固有束具有保护作用，该纤维能传导来自损伤区吻侧下行的神经冲动，从而有助于脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复。
脊髓损伤不仅会破坏损伤部位的神经通路，还会导致损伤区及周边运动神经元变性，导致运动功能受损[40]。有研究表明，即使在最严重的情况下，脊髓损伤通常也会保留脊髓的某些区域，这些残余纤维与协调运动的腰髓运动神经回路保持连接，因此，残存神经纤维在促进脊髓损伤后运动功能恢复中起着重要作用[18]。投射到腰髓下行通路的萌发和保留对脊髓损伤后的运动恢复是必不可少的。研究表明，神经营养因子3对运动神经元的存活和突触形成至关重要，尤其在发育和出生后早期[41]。大量研究也表明，神经营养因子3的局部、持续表达支持皮质脊髓束的可塑性、脊髓神经元存活和再生[42-44]。在中枢神经系统中，内源性神经节苷脂GD1a在神经元中显著表达[45]。神经节苷脂GD1a参与膜信号微结构域的组成，而膜微结构域的形成在髓鞘形成中起关键作用，因而神经节苷脂GD1a能促进髓鞘形成[13]。此次实验结果表明，联合应用PLGA/NT-3和PLGA/GD1a纳米微球对大鼠脊髓损伤有修复作用。神经营养因子3和神经节苷脂GD1a共同作用，不仅促进了损伤部位周围运动神经元的存活，同时促进了损伤部位周围的髓鞘再生，且对残存的下行神经纤维具有保护作用，这就可能会增加下行脊髓固有束与腰髓灰质运动神经元的突触连接，使得来自损伤部位吻侧的神经信号能够传导至损伤部位尾侧，完成运动指令。
此次实验应用组织工程学技术，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体，包封神经营养因子3和神经节苷脂GD1a，构建了一种可缓释两种生物活性因子的纳米微球，将此纳米微球用于大鼠脊髓损伤模型，发现此药物缓释体系能够持续作用于损伤部位，促进损伤区神经元、神经纤维的存活及残存的脊髓固有束的保留和髓鞘的再生，能够改善大鼠后肢的运动功能。应用无毒无害的聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载具有神经再生功能的神经营养因子3和神经节苷脂GD1a形成的纳米微球，有望进一步向临床应用转化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤

Repair effect of poly(lactic-co-glycolic acid) nanospheres with sustained-release of neurotrophin-3 and ganglioside GD1a on spinal cord injury in rats

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