2.1   实验动物数量分析   取大鼠48只，分为4组，实验过程中未见脱失，全部进入结果分析。
2.2   大鼠空腹血糖和骨密度   与正常组大鼠相比较，模型组大鼠的股骨骨密度、胫骨骨密度和全身骨密度均明显下降
(P < 0.05)，血糖值明显上升(P < 0.05)；与模型组大鼠相比较，仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组大鼠的股骨密度、胫骨密度和全身骨密度均显著增加(P < 0.05)；仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组大鼠的股骨、胫骨骨密度差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。




2.3   大鼠骨组织病理学观察结果    正常组大鼠骨质完整、规则，有多个小梁，厚度适中，小梁裂缝狭窄，髓腔宽度小；模型组大鼠骨小梁的完整性受到损害，导致骨小梁的排列欠规则，骨小梁的数量明显减少，相较于正常组，骨小梁的厚度明显减少，髓腔的宽度较大并且大部分被脂肪细胞填充；仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组的大鼠组织病理学变化明显改善，骨小梁局部缺失，布列较不规整，骨小梁的数目明显多于模型组，骨小梁的厚度较适中。
2.4   免疫组织化学法检测骨组织中的成骨标志物因子  Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2的蛋白表达   骨组织中Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2免疫组化阳性表达细胞呈棕黄色。模型组阳性表达最低；仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组阳性表达高于模型组，但低于正常组，见图1，表3。







2.5   RT-PCR法检测骨组织中的成骨标志物因子Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2的mRNA表达   模型组大鼠骨组织中Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2 mRNA表达量均显著下降(P < 0.05)；与模型组比较，仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组大鼠骨组织中Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2 mRNA的表达量均显著增加(P < 0.05)，仙灵骨葆组与阿仑膦酸钠组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

[1] ISHTAYA GA, ANABTAWI YM, ZYOUD SH, et al. Osteoporosis knowledge and beliefs in diabetic patients: a cross sectional study from Palestine. BMC Musculoskelet Disord. 2018;19(1):43. [2] KURRA S, FINK DA, SIRIS ES. Osteoporosis-associated fracture and diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 2014;43(1):233-243. [3] CHANDRAN M, TAY D, HUANG XF, et al. The burden of inpatient care for diabetic and non-diabetic patients with osteoporotic hip fractures—does it differ? An analysis of patients recruited into a fracture liaison service in Southeast Asia. Arch Osteoporos. 2018;13(1):27.  [4] WU J, LI W, YE B, et al. The efficacy and safety of Xianling Gubao capsules in the treatment of knee osteoarthritis: A protocol for a randomized, double-blind, controlled trial. Medicine (Baltimore). 2021; 100(36):e27086. [5] INDRAN IR, LIANG RLZ, MIN TE, et al. Preclinical studies and clinical evaluation of compounds from the genus Epimedium for osteoporosis and bone health. Pharmacol Ther. 2016;162:188-205. [6] LI WD, YAN CP, WU Y, et al. Osteoblasts proliferation and differentiation stimulating activities of the main components of Fructus Psoraleae corylifoliae. Phytomedicine.2014;21(4):400-405. [7] NIU YB, LI YH, KONG XH, et al. The beneficial effect of Radix Dipsaci total saponins on bone metabolism in vitro and in vivo and the possible mechanisms of action. Osteoporos Int. 2012;23(11):2649-2660. [8] XING Y, BI HY, ZHANG QN. Introduction of common Chinese patent medicines for the treatment of osteoporosis. Chin J Osteoporos. 2013; 19(1):83-85. [9] ZHU HM, QIN L, GARNERO P, et al. The first multicenter and randomized clinical trial of herbal Fufang for treatment of postmenopausal osteoporosis. Osteoporos Int. 2012;23(4):1317-1327. [10] RAWADI G, ROMAN-ROMAN S. Wnt signalling pathway: a new target for the treatment of osteoporosis. Expert Opin Ther Targets. 2005;9(5): 1063-1077. [11] MANOLAGAS SC, ALMEIDA M. Gone with the Wnts: β-catenin, T-cell factor, forkhead box O, and oxidative stress in age-dependent diseases of bone, lipid, and glucose metabolism. Mol Endocrinol. 2007;21(11): 2605-2614. [12] NIE X, WEI X, MA H, et al. The complex role of Wnt ligands in type 2 diabetes mellitus and related complications. J Cell Mol Med. 2021; 25(14):6479-6495.  [13] LI X, LIU D, LI J, et al. Wnt3a involved in the mechanical loading on improvement of bone remodeling and angiogenesis in a postmenopausal osteoporosis mouse model.FASEB J. 2019;33(8):8913-8924.  [14] WANG BW, FANG WJ, SHYU KG. Micro RNA‐145 regulates disabled‐2 and Wnt3a expression in cardiomyocytes under hyperglycaemia. Eur J Clin Invest. 2018;48(1). doi: 10.1111/eci.12867. [15] CHEN G, DENG C, LI YP. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int J Biol Sci. 2012;8(2):272-288. [16] ZHANG JM, YU RQ, WU FZ, et al. BMP‑2 alleviates heart failure with type 2 diabetes mellitus and doxorubicin‑induced AC16 cell injury by inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis. Exp Ther Med. 2021;22(2):897.  [17] ISLAM MS. Experimental rodent models of type 2 diabetes: a review. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 2009;31(4):249-261.  [18] INABA M, TERADA M, KOYAMA H, et al. Influence of high glucose on 1, 25‐dihydroxyvitamin D3‐induced effect on human osteoblast‐like MG‐63 cells.J Bone Miner Res. 1995;10(7):1050-1056. [19] MACDONALD BT, TAMAI K, HE X. Wnt/β-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell. 2009;17(1):9-26.  [20] KRISHNAN V, BRYANT HU, MACDOUGALD OA.Regulation of bone mass by Wnt signaling.J Clin Invest. 2006;116(5):1202-1209. [21] BARON R, KNEISSEL M. WNT signaling in bone homeostasis and disease: from human mutations to treatments. Nat Med. 2013;19(2):179-192. [22] KOBAYASHI Y, UEHARA S, UDAGAWA N, et al. Regulation of bone metabolism by Wnt signals. J Biochem. 2016;159(4):387-392. [23] INOUE J, IHARA Y, TSUKAMOTO D, et al. Identification of BCL11B as a regulator of adipogenesis. Sci Rep. 2016;6:32750.  [24] FIORENZANO A, PASCALE E, D’ANIELLO C, et al. Cripto is essential to capture mouse epiblast stem cell and human embryonic stem cell pluripotency. Nat Commun. 2016;7:12589.  [25] MALEKI DANA P, SADOUGHI F, MANSOURNIA MA, et al. Targeting Wnt signaling pathway by polyphenols: implication for aging and age-related diseases. Biogerontology. 2021;22(5):479-494. [26] DAY TF, YANG Y. Wnt and hedgehog signaling pathways in bone development.J Bone Joint Surg Am. 2008;90 Suppl 1:19-24.  [27] KURRA S, FINK DA, SIRIS ES. Osteoporosis-associated fracture and diabetes.Endocrinol Metab Clin North Am. 2014;43(1):233-243. [28] GARCÍA-MARTÍN A, ROZAS-MORENO P, REYES-GARCÍA R, et al. Circulating levels of sclerostin are increased in patients with type 2 diabetes mellitus.J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(1):234-241. [29] MA R, WANG L, ZHAO B, et al. Diabetes perturbs bone microarchitecture and bone strength through regulation of Sema3A/IGF-1/β-catenin in rats. Cell Physiol Biochem. 2017;41(1):55-66.  [30] XIONG Y, ZHANG Y, XIN N, et al. 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3 promotes osteogenesis by promoting Wnt signaling pathway. J Steroid Biochem Mol Biol. 2017;174:153-160. [31] Willert K, Brown JD, Danenberg E, et al. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature. 2003; 423(6938):448-452.  [32] Shimizu H, Julius MA, Giarre M, et al. Transformation by Wnt family proteins correlates with regulation of beta-catenin. Cell Growth Differ. 1997;8(12):1349-1358. [33] RAWADI G, VAYSSIÈRE B, DUNN F, et al. BMP‐2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop. J Bone Miner Res. 2003;18(10):1842-1853. [34] CHEN Y, WANG G, MA Z, et al. Adverse effects of high glucose levels on somite and limb development in avian embryos.Food Chem Toxicol. 2014;71:1-9. [35] MA XY, FENG YF, MA ZS, et al. The promotion of osteointegration under diabetic conditions using chitosan/hydroxyapatite composite coating on porous titanium surfaces. Biomaterials. 2014;35(26):7259-7270. [36] SHAO X, YANG Y, TAN Z, et al. Amelioration of bone fragility by pulsed electromagnetic fields in type 2 diabetic KK-Ay mice involving Wnt/β-catenin signaling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2021;320(5): E951-E966.   [37] SCHMITT B, RINGE J, HÄUPL T, et al. BMP2 initiates chondrogenic lineage development of adult human mesenchymal stem cells in high-density culture. Differentiation. 2003;71(9-10):567-577. [38] INTINI G, NYMAN JS. Dkk1 haploinsufficiency requires expression of Bmp2 for bone anabolic activity. Bone. 2015;75:151-160.  [39] RUAN W, XUE Y, ZONG Y, et al. Effect of BMPs and Wnt3a co-expression on the osteogenetic capacity of osteoblasts. Mol Med Rep. 2016;14(5): 4328-4334.   [40] DUMIC-CULE I, PERIC M, KUCKO L, et al. Bone morphogenetic proteins in fracture repair. Int Orthop. 2018;42(11):2619-2626. [41] LEE EJ, NA W, KANG MK, et al. Hydroxycoumarin scopoletin inhibits bone loss through enhancing induction of bone turnover markers in a mouse model of type 2 diabetes. Biomedicines. 2021;9(6):648.   [42] KARIM K, GIRIBABU N, SALLEH N. Marantodes pumilum Var Alata (Kacip Fatimah) ameliorates derangement in RANK/RANKL/OPG pathway and reduces inflammation and oxidative stress in the bone of estrogen-deficient female rats with type-2 diabetes. Phytomedicine. 2021;91:153677.  [43] SHAO H, WU R, CAO L, et al. Trelagliptin stimulates osteoblastic differentiation by increasing runt-related transcription factor 2 (RUNX2): a therapeutic implication in osteoporosis. Bioengineered. 2021;12(1): 960-968. [44] DONG C, YANG H, WANG Y, et al. Anagliptin stimulates osteoblastic cell differentiation and mineralization. Biomed Pharmacother. 2020; 129:109796. [45] XUE S, GAO P, TAN X, et al. Effect of Down-Regulating AK045490 on Osteogenic Differentiation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells (BMSCs) Under High Glucose Environment by Targeting Fat Mass and Obesity-Associated (FTO). Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 2020;10(10):1541-1547. [46] FATCHIYAH F, SETIAWAN B, SASASE T, et al. The amelioration of T2DM rat femoral bone achieved by anti-osteoporosis of caprine CSN1S2 protein through bone morphogenetic protein signaling pathway. Acta Biochim Pol. 2021;68(2):265-275.

[1]	党 祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹 金, 熊 山, 张顶梅, 王 信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	王 继, 张 敏, 杨中亚, 张 龙. 体力活动干预2型糖尿病肌少症的研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1272-1277.
[3]	宋荷花, 魏在荣. 糖尿病的周围神经病变：研究与治疗[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1278-1285.
[4]	孙佳佳, 朱海迪, 卢 赟, 张 凯. 髋部骨折合并2型糖尿病和非2型糖尿病患者骨代谢标志物的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1156-1160.
[5]	李梦菲, 仉 红, 赵少剑, 殷广浩, 王其宝. 叉头样转录因子3在粪肠球菌感染模型大鼠难治性根尖周炎病变中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1187-1192.
[6]	张永强, 潘 凤, 孙 鹏, 谭明辉, 轩留明, 王勤章. Gja1基因重组慢病毒对糖尿病豚鼠膀胱病变模型中缝隙连接蛋白43蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1161-1165.
[7]	赵 璐, 赵逸菲, 高 达, 刘艳芳, 付婷婷, 徐江雁. Zeste基因抑制子基因12在糖尿病肾脏病模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1179-1186.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐 亮, 李 江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[10]	袁 维, 刘静东, 徐广辉, 康 健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[11]	廖益东, 明 江, 宋文学, 王梓力, 张 宇, 廖一飞, 徐卡娅, 杨 华. 一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 897-902.
[12]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋 震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[13]	袁 博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[14]	许其静, 杨伊春, 雷 微, 杨 莹, 余 江, 夏婷婷, 张 萌, 章 涛, 张 潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[15]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘 静, 孙光华, 廖 阳, 周 君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.

经国际糖尿病联合会调查后的数据结果提示当前全球约4.25亿18-99岁的糖尿病患者，并且该数字将在未来几年内继续增长，预计到2045年增加到6.29亿[1]。糖尿病可导致骨强度及骨密度降低，增加骨脆性及发生骨折风险的概率，严重影响患者的生活质量，并带给患者沉重的经济负担。近年来，骨折风险的增加已经成为糖尿病并发骨质疏松症的主要问题之一[2]。而骨质疏松症作为糖尿病的一种常见并发症具有发病率高的特点，研究显示糖尿病患者中骨质疏松症的发生率高达60%[3]。目前临床应用的抗骨质疏松药物包括双膦酸盐、钙剂、维生素D、雌激素及雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、前列腺素E2等，其中阿仑膦酸钠(双膦酸盐类药物)通过诱导破骨细胞的凋亡和抑制骨组织的吸收在临床上已被广泛用于治疗骨质疏松症，但是该药长期应用也会出现如胃肠道反应、癌症风险增加、关节或肌肉酸痛等不良反应，因此中药治疗该病也成为了近年来研究的热点。

仙灵骨葆胶囊作为目前骨科和创伤科常用的中成药，其功效具有滋补肝肾、强筋健骨、活血通络的作用[4]。现代药理学研究其成分淫羊藿具有促进成骨细胞增殖、抑制骨吸收的作用[5]；补骨脂能促进成骨细胞的增殖或分化，增加骨矿物质密度，促进骨质疏松症患者的正常骨骼发育和钙化[6]；川续断能够改善骨质疏松性骨折骨痂的生物力学性能，从而促进骨折愈合[7]。仙灵骨葆胶囊具有增加骨密度与骨强度、缓解骨流失、促进成骨细胞增殖的功效，已被广泛用于治疗骨质疏松症、骨折、骨关节炎、股骨头无菌性坏死等骨科疾病[8]。除此之外，仙灵骨葆胶囊的安全性也已经得到有效验证，ZHU等[9]研究证实，使用常规剂量的仙灵骨葆胶囊治疗绝经后骨质疏松症1年以上是安全的，并能显著增加绝经后妇女6个月内的腰椎骨密度水平。

Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的作用涉及成骨细胞分化在内的许多重要细胞的功能调节[10]，近期研究发现Wnt/β-catenin信号在葡萄糖代谢中也起着非常重要的作用[11]。Wnt3a既参与了成骨细胞和破骨细胞的调控，又可以从多个途径调节糖尿病的发病机制，并且在高糖状态下其表达会受到抑制[12-14]。骨形态发生蛋白2除具有促进骨形成、诱导成骨细胞分化及增强骨骼结构重塑等作用外，其在高糖状态下的表达也会受限[15-16]。然而截止到目前，仙灵骨葆胶囊在体内高糖状态下促进骨形成过程的作用机制以及对上述因子的影响尚未完全明确，因此该研究通过观察仙灵骨葆胶囊对糖尿病大鼠的3种成骨标志物因子Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2表达的影响，探讨其防治糖尿病引起骨质疏松症的可能作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。组间比较采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2018年6月至2019年6月在华北理工大学附属医院骨科实验室、华北理工大学中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   健康8周龄SPF级的48只雄性SD大鼠，体质量200-220 g/只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2009-0015。所有的动物处理程序都已通过华北理工大学实验动物伦理委员会批准。
1.3.2   药品   仙灵骨葆胶囊组成成分为川续断、淫羊藿、补骨脂、丹参、知母及熟地黄，其中成药由贵州同济堂医药公司生产，生产批号为20130815。
1.3.3   实验用主要试剂及仪器   阿仑膦酸钠(杭州默沙东制药有限公司)；链脲佐菌素(Sigma公司，美国)；戊巴比妥钠(北京索莱宝科技有限公司，中国)；兔抗大鼠Wnt3α抗体(Santa  Cruz 公司，美国)；兔抗大鼠β-catenin抗体、兔抗大鼠骨形态发生蛋白2抗体(Abcam 公司，美国)；DAB 显色试剂盒、二抗 PV-6001试剂盒(中杉金桥公司，中国)；血糖仪(罗氏德国)；双能X射线骨密度测量仪(Norland公司，美国)；PCR仪(Applied biosystems，美国)；Olympus DP80 CCD 图像采集系统(OLYMPUS，日本)；Image pro plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   分组、建模及干预   根据参考文献[17]采用链脲佐菌素注射建立糖尿病大鼠模型。将48只SD大鼠随机取36只，共禁食禁水12 h后，于大鼠的左下腹腔分别单剂量注射60 mg/kg链脲佐菌素，剩余12只大鼠左下腹腔注射同等分的柠檬酸钠缓冲液，注射后3 d从每只大鼠的尾尖取血测量空腹血糖值。36只注射链脲佐菌素的大鼠血糖均>16.7 mmol/L，为糖尿病造模成功。将36只成模大鼠按照随机原则分为模型组、仙灵骨葆组和阿仑膦酸钠组(每组12只)。测得注射同等分的柠檬酸钠缓冲液的12只大鼠其血糖值均在正常范围内(正常血糖值：4.7-8.3 mmol/L)，此12只大鼠作为正常组。

将仙灵骨葆胶囊及阿仑膦酸钠分别溶解成悬浊液，仙灵骨葆组大鼠给予仙灵骨葆胶囊，按250 mg/(kg·d)灌胃，阿仑膦酸钠组大鼠给予阿仑膦酸钠1 mg/(kg·d)灌胃，正常组和模型组大鼠分别给予等量双蒸水10 mL/(kg·d)灌胃，连续灌胃12周。为保证实验准确性，此期间每周测1次糖尿病成模大鼠的血糖值以确保其血糖水平>16.7 mmol/L。 

1.4.2   取材   连续灌胃12周后，在大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(35 mg/kg)进行麻醉，行骨密度检测，留取血标本后处死大鼠并取其左右侧股骨、胫骨组织行苏木精-伊红染色等。
1.4.3   骨密度值测量   连续灌胃12周后，将麻醉后的大鼠用双能X射线骨密度仪测量股骨、胫骨及全身骨密度。测量参数：双能电压41 kVp和100 kVp；扫描窗宽：18 cm；扫描速率：4.8 s/cm。
1.4.4   骨组织形态苏木精-伊红染色   取出右侧股骨置于40 g/L的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中固定，经脱水、澄清、浸蜡等处理后切取蜡片(厚度约5 μm)。经苏木精-伊红染色后，中性树胶封载玻片，在显微镜下查看骨组织形态学变化。
1.4.5   免疫组化检测骨组织Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2的蛋白表达   将石蜡组织切片(5 μm)，经脱蜡、脱水、灭酶等处理，施行抗原修缮，加入大鼠抗Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2抗体(1∶100)，于37 ℃孵育90 min后，加生物素化兔抗大鼠二抗工作液，PBS洗3次后加SABC置于37 ℃温箱中30 min，DAB显色，苏木精复染、二甲苯透明、脱水和封固。用PBS代替一抗作空白对比，显微镜观测阳性细胞(呈棕黄色)的表达。在200倍显微镜下拍摄其中5个视野图片并确保每张切片的视野相互不重叠，用Imagepro plus 6.0软件测取吸光度值(均值表示)。
1.4.6   RT-PCR检测骨组织Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2 mRNA 表达   大鼠处死后取左侧胫骨，按PCR试剂盒的操作说明及采用Trizol技术将总RNA后反转录后得到的cDNA进行PCR反应，PCR反应条件：首次经变性5 min(95 ℃)；其次变性10 s(95 ℃)、30 s(60 ℃)、10 s(72 ℃)；第2步循环40次。测定目标基因的表达量(2-ΔΔCt法)。PCR引物序列见表1。
1.5   主要观察指标   ①大鼠血糖、股骨密度、胫骨密度、全身骨密度；②股骨组织形态学观察；③成骨标志物因子Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2的蛋白和mRNA表达。
1.6   统计学分析   数据整理与分析统一使用SPSS 22.0统计软件。符合正态分布的定量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验，α以0.05为检验标准。以上统计学方法已通过华北理工大学卫生统计学专家审核。

目前已经证实高浓度的葡萄糖会影响成骨细胞(与骨骼形成有关的细胞)合成骨钙素的能力，而骨钙素是一种对骨形成不可或缺的蛋白质[18]。由于缺乏有效的医疗手段来逆转糖尿病并发的骨质疏松症，这势必成为患者健康和生活的主要负担。Wnt/β-catenin信号通路是在全数wnt相关通路中最经典且被大量研究的通路途径，其功能是调节转录辅助因子β-catenin的数量[19]。KRISHNAN等[20]研究发现Wnt/β-catenin信号的起始发生在Wnt相关蛋白与卷曲蛋白(frizzled)受体和低密度脂蛋白受体5和6(LRP5和LRP6)的结合上。BARON等[21]研究证明β-catenin会在此信号通路启动之后在细胞质中堆集并迁移到细胞核中与转录因子连结以控制目标基因的转录从而作用于整个成骨细胞系。Wnt /β-catenin信号通路在调节成骨及破骨细胞之间的相互平衡，成骨细胞的生长、增殖和分化中有至关重要的效用[22-24]，而成骨细胞的形成、数量以及分化能力的强弱则在糖尿病骨质疏松的发病过程中起着关键效用[25]。DAY等[26]研究证明β-catenin 表达功能缺陷的大鼠，成骨细胞的增殖、分化与成熟也会受到抑制。虽然对糖尿病背景下骨质流失的确切机制存在争议[27]，但最近有研究结果提示Wnt信号通路可能揭示了二者之间的联系[28]，MA等[29]发现患有糖尿病的大鼠模型中β-catenin的表达显著降低；XIONG等[30]研究证实1，25(OH)(2)D-3可通过增强Wnt/β-catenin信号通路来改善长期高血糖引起的骨质疏松。以上研究为干预该通路预防和治疗糖尿病并发骨质疏松症提供了新的思路。

Wnt蛋白可分β-catenin依赖型蛋白和非β-catenin依赖型蛋白[31-32]，Wnt3a为β-catenin依赖型蛋白参与经典Wnt通路从而促进成骨细胞增殖[33]。CHEN等[34]以小鸡胚胎为模型，在研究高糖对发育中的体细胞及其衍生物影响的实验中证明，高糖状态下Wnt3a的表达会被明显抑制。MA等[35]研究证明Wnt3a/β-catenin途径被激动后可以改善糖尿病条件下受损的骨整合。SHAO等[36]研究发现脉冲电磁场疗法可上调典型Wnt配体(包括Wnt3a在内)的基因表达以及提高成骨细胞和骨细胞的生物活性并且改善骨的微结构和质量，从而改善糖尿病并发的骨质疏松症。因此以上研究证明通过一定的方法干预此途径来上调或激活Wnt3a表达也同样为治疗糖尿病并发骨质疏松症提供了全新的治疗思路。

骨形态发生蛋白2作为骨形态发生蛋白家族中具有巨大成骨及软骨再生潜能的因子之一，被世界各地的学者及专家广泛探究[37]。骨形态发生蛋白2作为调节Wnt/β-catenin通路的下游因子可强化及参与Wnt/β-catenin通路的信号传导和通路的激活[38]，并诱导了Wnt3a的表达[39]。目前，临床前和临床研究已经证明骨形态发生蛋白2可用于各种治疗及干预包括骨质疏松在内的多种疾病[40]，其中对骨形态发生蛋白2治疗糖尿病并发骨质疏松症的研究更是成为热点研究对象。LEE等[41]发现应用羟基香豆素东莨菪内酯能刺激和诱导糖尿病成骨细胞骨形态发生蛋白2的转录。KARIM等[42]发现卡琪花玛蒂(一种东南亚热带雨林中的常见草药)能够增加卵巢切除术后雌激素缺乏以及患有糖尿病的大鼠骨骼中骨形态发生蛋白2的表达和分布。SHAO和DONG等[43-44]发现曲拉格列汀、阿那格列以上两种用于2型糖尿病患者控制血糖的新型DPP-4的长效抑制剂，能够升高包括骨形态发生蛋白2在内的多种成骨标志物因子的表达，以及显著增加成骨细胞的基质沉积和矿化。XUE等[45]研究发现患有糖尿病的大鼠中骨形态发生蛋白2的表达极度降低，这种现象与高糖环境下骨形态发生蛋白2骨髓间质干细胞分化受到抑制有关[46]，因此可以推断通过一定途径促进骨形态发生蛋白2的表达或补充外源性骨形态发生蛋白2可以逆转高糖对成骨分化的抑制作用。

通过此次仙灵骨葆胶囊治疗糖尿病并发的骨质疏松症大鼠的研究，结果表明仙灵骨葆组大鼠的空腹血糖水平较模型组有所下降，明确证实仙灵骨葆胶囊对糖尿病并发骨质疏松症的大鼠具有降糖作用，因而从根本上改善了大鼠机体内环境，因此实验证明了仙灵骨葆胶囊对糖尿病并发的骨质疏松症具有缓解作用。此次实验发现，在糖尿病并发骨质疏松症的大鼠骨组织中骨形态发生蛋白2表达下降，Wnt3a、β-catenin表达水平也降低；仙灵骨葆胶囊治疗后骨密度改善，Wnt3a、β-catenin、骨形态发生蛋白2表达水平升高，提示仙灵骨葆胶囊作用机制可能为刺激骨形态发生蛋白2表达，作为Wnt通路的配体和关键信号分子的β-catenin在受到骨形态发生蛋白2的刺激后其磷酸化水平、在细胞核内的积累量以及在细胞核内的转导能力提升引起下游靶基因的表达，从而促进糖尿病骨髓间充质干细胞的骨再生，达到治疗糖尿病并发骨质疏松症的作用。

研究仅观察了仙灵骨葆胶囊对Wnt经典信号通路(Wnt/β-catenin 信号通路)的影响，而目前的最新研究显示，Wnt非经典信号通路也对骨代谢有着至关重要的作用，因此未来可以此通路为研究重心，进一步探索仙灵骨葆胶囊对糖尿病骨代谢的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
仙灵骨葆胶囊：为骨伤科中常用中成药，川续断、淫羊藿、补骨脂、丹参、知母及熟地黄为其药物组份，中医临床当中主用于治疗肝肾不足、筋骨萎软及气血经络阻滞等证型，西医临床当中主用于医治骨质疏松症、骨关节炎、骨无菌性坏死以及骨折等疾病。
糖尿病与骨代谢紊乱：是由于机体内部胰岛素分泌缺陷或作用障碍引起的糖、蛋白质、脂肪及矿物质代谢紊乱等而致的骨组织代谢异常，临床当中患者常伴有周身骨骼疼痛且易发生骨折。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Wnt /β-catenin信号通路在调节成骨及破骨细胞之间的相互平衡，成骨细胞的生长、增殖和分化中有至关重要的效用，而成骨细胞的形成、数量以及分化能力的强弱则在糖尿病骨质疏松的发病过程中起着关键效用。目前尚缺乏公认、特效的防治糖尿病骨质疏松的药物，而目前中医药对预防和治疗糖尿病并发的骨质疏松症占有一定优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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