各组小鼠脏器平均质量与脏器质量系数，见表3，4。植入后第14天时，实验组一小鼠心脏质量高于假手术组(P < 0.05)，但两组心脏质量系数比较差异无显著性意义(P > 0.05)，可能与小鼠初始体质量偏重有关；对照组小鼠肺脏器质量及肺脏质量系数低于假手术组(P < 0.05)；实验组一小鼠肾脏质量系数高于假手术组(P < 0.05)，可能与羧甲基壳聚糖代谢途径有关。植入后第14，28天时，植入材料组其他部分器官质量及脏器质量系数与假手术组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，表明此剂量下各组止血材料在28 d降解后对其余各脏器无明显影响。







2.3   各组小鼠血清中免疫球蛋白水平    见图1。

植入后第14天时，实验组二IgM水平低于假手术组(P < 0.05)，但无临床意义；植入后第28天时，实验组一IgG水平高于假手术组(P < 0.05)，提示未纯化处理复合大孔聚多糖可吸收止血材料对小鼠出现了免疫刺激反应，小鼠体内产生了较高水平的IgG抗体，纯化处理后复合大孔聚多糖可吸收止血材料则具有较好的生物相容性，经过纯化处理的复合大孔聚多糖可吸收止血材料与市售复合微孔多聚糖止血粉均不会引起明显的细胞与体液免疫反应。
2.4   各组小鼠脾脏B、T细胞比例检测结果   植入后第14，28天时，植入材料组小鼠脾脏B、T细胞比例与假手术组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表5。



2.5   各组小鼠脾脏和胸腺组织形态学观察结果   见图2，3。

多核巨细胞常见于不易被消化的较大异物和代谢产物周围，多见于异物刺激引起的慢性肉芽肿性炎症。脾脏组织苏木精-伊红染色显示，植入后第14，28天时，假手术组脾脏细胞胞核呈均匀蓝色或淡蓝色，胞质均匀，白髓红髓分界明显；与假手术组相比，实验组一、实验组二红髓白髓分界清晰，脾小结形状规则，淋巴细胞数量丰富，局部多核巨细胞数量少量增多(黄色箭头)；对照组红髓白髓分界清晰，脾小结形状规则、淋巴细胞数量丰富，多核巨细胞数量大量增多。

胸腺组织苏木精-伊红染色显示，植入后第14，28天时，假手术组胸腺皮质髓质分界清晰，皮质淋巴细胞数量丰富，排列规则，髓质未见明显异常；其余各组可见皮质髓质分界清晰，皮质中淋巴细胞数量丰富，形态结构正常，局部可见少量静脉血管淤血扩张(黄色箭头)，髓质未见明显异常。实验组一、实验组二、对照组均有炎症反应，但与已上市的对照组相比，实验组一、二炎症反应更轻微。由于复合大孔聚多糖可吸收止血材料由羧甲基壳聚糖和明胶经辐照交联而成，可以在体内的溶菌酶和蛋白酶中降解[21-22]，这可能与各组的体内降解速率不同有关。
2.6   止血材料的组织相容性   由小鼠皮下埋植实验可知，经纯化处理的复合大孔聚多糖可吸收止血材料具有良好的组织相容性。

作为三类医疗器械，体内可吸收止血材料在未上市前进行材料生物体内的免疫毒性反应评价至关重要。近年来，体内可吸收止血材料被广泛应用于甲乳外科、消化外科、普通外科等科室，以应对手术过程中的出血。相较于传统的止血方法如结扎止血、缝合止血而言，体内可吸收止血材料可对小动脉、静脉、毛细血管等进行止血，效果好、吸收快，给临床止血带来了诸多便利[1]。

目前，市面上常用的可吸收止血材料有氧化纤维素、可吸收明胶、胶原类制剂、微孔多聚糖类止血粉等。壳聚糖作为目前已知唯一带正电荷的碱性多糖，具有良好的组织相容性、力学相容性与可降解性。通过改性后的衍生物羧甲基壳聚糖，在保留壳聚糖特性的同时有效提高了其血液相容性[2]，由羧甲基壳聚糖制备的医疗器械已被广泛应用于医疗卫生的各个领域，如止血材料、人工支架、人工骨骼、手术纱布、药物递送、黏膜免疫等[3-6]。许零团队[7]前期以羧甲基壳聚糖与明胶为主要原料，采用辐照交联方法制备了一种新型的可吸收止血材料——复合大孔聚多糖可吸收止血材料，可用于肝脏钝挫伤止血，具有较好的止血效果和体内可吸收性。临床研究表明，复合大孔聚多糖可吸收止血材料用于普外科术中止血具有很好的安全性和有效性，其中甲状腺创面止血的5 min止血成功率达100%[8]。作者所在团队前期股动脉止血研究也表明，该材料在小动脉性出血和创伤急救等方面有很好的应用价值。

然而，鉴于生物材料易引入外来污染物，以及其在体内的降解产物、代谢产物等可能存在的潜在风险，免疫毒性评价逐渐成为阐明其安全性和有效性的关键手段之一[9]。复合大孔聚多糖可吸收止血材料作为动物源性的材料，存在生产工艺复杂、材料易变质、材料有内源性残留物与外源性污染物(如蛋白、微生物、病毒、农药、兽药等)等问题，均会导致免疫毒性反应；另外，细菌内毒素控制也是保障植入材料生物安全性的重要因素[10-12]。因此，在处理材料时会进行乙醇清洗消毒、化学处理、冷冻干燥及辐照灭菌，旨在有效降低残留的抗原成分，将病原微生物杀灭[13]。此次实验中，作为生物来源的羧甲基壳聚糖及明胶是制剂中的主要原料，且有可能引入外源性因子、致病物质或特定污染物等，这些杂质可能会对材料本身的活性、安全性产生影响，还可能会在材料的临床使用中引起不良反应。细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的一种脂多糖与微量蛋白形成的复合物，是细菌死亡或者解体时释放出的具有内毒素生物活性的物质，是医药制品的一大污染源，细菌内毒素检查是医药制品质量控制的重要检测项目之一，因此有必要对生物材料纯化处理前后的免疫毒性进行评价。

此次实验依据标准GB/T 16886.20-2015《医疗器械生物学评价 第20部分医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》[14]，通过脏器系数、免疫球蛋白、流式细胞术、病理切片等方法判断复合大孔聚多糖可吸收止血材料在小鼠体内的免疫毒性，为其他可吸收生物材料的免疫毒性研究提供方法借鉴。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，组间比较采用t检验及非参数检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年11月至2021年1月在厦门大学SPF级实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   止血材料   未纯化与纯化复合大孔聚多糖可吸收止血材料(厦门凝赋生物科技有限公司)；复合微孔多聚糖止血粉(山东赛克赛斯医药有限公司)。复合大孔聚多糖可吸收止血材料及复合微孔多聚糖止血粉的主要性能，见表1。

1.3.2   实验动物   选用SPF级健康雄性BALB/c小鼠48只，6-8周龄，体质量(26±3) g，购自厦门大学实验动物中心，许可证号：SCXK(闽)2018-0003。饲养光照条件：12 h暗室，12 h光照。将48只小鼠按随机数字表法分为假手术组、实验组一、实验组二与对照组，每组12只。实验获得厦门大学生物医学伦理委员会批准(伦理号：XMULAC20190008)。
1.3.3   仪器和试剂   电子天平(EL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；低速离心机(TDZ5-WS，湘仪)；流式细胞仪(Fortessa X-20，BD公司)；病理切片机(RM2016，上海徕卡仪器有限公司)；组织摊片机(KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；染色机(Giotto，DIAPATH)；烤箱(GFL-230，天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；显微数字切片扫描系统(Motic VM1，麦克奥迪)；ELISA试剂盒(购自南京森贝伽生物科技有限公司)；红细胞裂解液(Servicebio)；生理盐水(Procell)；戊巴比妥钠(厦门大学实验动物中心)；CD3-FITC、CD8a-PE、CD45-PerCP-Cy5.5、CD19-APC(BioLegend)。
1.4   实验方法   
1.4.1   材料处理   复合微孔多聚糖止血粉为市售产品，无须处理。

未纯化复合大孔聚多糖可吸收止血材料：将羧甲基壳聚糖、明胶与水按一定比例混合均匀，利用电子加速器进行辐照交联，冷冻干燥和粉碎后获得未纯化处理的复合大孔聚多糖可吸收止血材料。生产环境为十万级洁净厂房。

纯化复合大孔聚多糖可吸收止血材料：利用等电点附近的溶解度差异、羧甲基壳聚糖与杂质在不同溶剂中的溶解度差异，通过多级溶解-沉淀去除杂质，结合低温高速离心与冷冻干燥等技术，将羧甲基壳聚糖进行纯化。其他制备环节与未纯化材料制备相同。
1.4.2   止血材料剂量   按20 g 小鼠与60 kg 人体体质量系数9.01[15]，人体最大使用剂量2 g，实验使用小鼠(平均体质量26 g)的25倍剂量换算，即2 g/60 kg×9.01=0.300 3 mg/g，26×0.300 3×25/1 000≈0.2 g/只剂量背部皮下植入材料。
1.4.3   皮下埋植实验   术前先使用10 g/L戊巴比妥钠生理盐水溶液腹腔注射麻醉小鼠，剂量为50 mg/kg。待小鼠昏迷后，使用动物电推剪对其背部脊柱两侧皮肤进行脱毛处理。经医用碘伏消毒后，使用无菌手术剪剪开，做一个皮肤切口，并钝性分离撑开皮肤，制备一个皮下囊，假手术组仅做切开缝合(不植入材料)，实验组一植入未纯化复合大孔聚多糖可吸收止血材料0.2 g，实验组二植入纯化处理的复合大孔聚多糖可吸收止血材料0.2 g，对照组植入复合微孔多聚糖止血粉0.2 g，植入后缝合，医用碘伏消毒[16]。假手术组与实验组同样条件下饲养及分析。 
1.5   主要观察指标   
1.5.1   脏器质量系数   植入后第14，28天，每组随机取6只小鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，使用体积分数75%乙醇浸泡消毒，用无菌手术剪剪开腹部，摘取各个器官，随即观察并记录各器官的形态、大小及质量[17]，计算脏器质量系数[18]。
1.5.2   免疫球蛋白测试   植入后第14，28天，摘除小鼠眼球取血，用1.5 mL EP管收集，静置2 h后3 500 r/min离心10 min，吸出上清液至1.5 mL EP 管备用。采用酶联免疫吸附检测免疫球蛋白 IgG 和IgM 浓度。检测方法：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔，稀释相应倍数后，在酶标包被板上标准品准确加样50 μL；将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，后按说明书，经温育、洗涤、显色、终止后分析免疫球蛋白[19]。
1.5.3   脾淋巴细胞流式细胞术分析   将脾脏于70 μm筛网上研磨后，用 PBS冲洗收集脾细胞，2 500 r/min 离心 10 min，去除细胞上清液，加入红细胞裂解液5 mL，裂解5 min后2 500 r/min离心10 min，去除细胞上清液。加入适量 PBS重悬细胞，取脾细胞重悬液，采用 CD3-FITC、CD8a-PE、CD45-PerCP-Cy5.5、CD19-APC染色进行 B、T 细胞比例分析。
1.5.4   脾脏和胸腺组织形态学观察   将脾脏及胸腺组织于40 g/L多聚甲醛充分固定后，用体积分数70%，80%，95%和100%乙醇溶液进行梯度洗脱，二甲苯透明，石蜡包埋固定并使用石蜡切片机进行组织切片，切片厚度为4-6 μm。依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5  min-体积分数75%乙醇 5 min，自来水洗。入苏木精染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入体积分数85%，95%的梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min。放入无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-无水乙醇Ⅲ 5 min-二甲Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性树胶封固，对显微镜镜检图像进行采集分析。
1.6   统计学分析   采用SPSS 25.0统计软件进行分析处理，计量资料以x±s表示，各实验组与假手术组组间比较采用t检验及非参数检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经厦门大学生物统计学专家审核。

评价免疫毒性是生物材料研发的主要研究过程之一。由于人体试验存在风险性，现阶段免疫毒性评价多基于动物模型。前期体外研究表明，复合大孔聚多糖可吸收止血材料具有良好的止血效果[21]，但目前关于其免疫毒性未进行深入研究。此次实验系统性评估了复合大孔聚多糖可吸收止血材料的免疫毒性，结果显示在此剂量下植入该止血材料后动物无明显中毒反应，对BALB/c小鼠的影响第14天时主要集中在肾脏器官。体质量、脏器质量、脏器质量系数是毒理实验中常用的指标，正常时各脏器与体质量的比值比较恒定。动物染毒后可能导致摄食量改变、体质量变轻，受损脏器质量可以发生改变，故脏器质量系数也随之而改变。脏器质量系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器质量系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。有文献报道，羧甲基壳聚糖被血液吸收并转移到肝、脾等组织中，被降解为小分子羧甲基壳聚糖后最终通过肾脏代谢排出体外，肾脏中大分子羧甲基壳聚糖含量高于小分子羧甲基壳聚糖含量，即大部分羧甲基壳聚糖腹腔注射后主要通过肾脏经尿液排泄出体外，仅小部分被吸收进入体内参与进一步降解代谢[23]。此次实验结果与文献报道的羧甲基壳聚糖代谢途径相符，其第14天对肾脏的影响考虑与其代谢产物经尿液排泄有关。结合脏器质量系数情况及器官形态来看，各实验组器官与假手术组比较大体形态、质地、颜色等未见明显变化。植入第28天时，使用复合大孔聚多糖可吸收止血材料的实验组一和实验组二各脏器影响消失，结合解剖情况，此材料已在动物体内完全降解，实验结果表明复合大孔聚多糖可吸收止血材料是一种安全可降解的材料[24-25]。

复合大孔聚多糖可吸收止血材料由明胶及羧甲基壳聚糖组成。明胶是胶原变性所得的产物，虽属于蛋白质大分子，但因为它是容易降解的直链氨基酸结构，免疫反应较弱[26]。有报道称猪源性明胶免疫原性弱于牛源性明胶，可减少过敏反应的发生[27]。另外有文献报道，羧甲基壳聚糖在一定剂量内基本无免疫原性[28-29]。因此，材料的免疫毒性考虑与细菌内毒素含量及外来引入的残留物等有关。一般用于植入或与血液接触的医疗器械产品，必须通过细菌内毒素检测达到其内毒素限值[30-31]。IgM主要存在于生物体血液中，是免疫应答中首先分泌的抗体，一经感染快速产生，经过一段时间后IgM抗体量逐渐减少而消失，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。IgG在免疫应答中起着激活补体、中和多种毒素的作用。IgG抗体持续时间长，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的主力军，作为感染和既往感染的指标。作为受抗原刺激后最先产生的免疫球蛋白，IgM 在体内一般可维持数周至数月时间。此次实验通过特殊纯化工艺降低材料的细菌内毒素及外源性杂质，结果显示，植入后第14天时实验组二IgM水平低于假手术组，虽有统计学意义，但无生物学意义，材料并没有产生明显的免疫反应。IgG在体内出现比IgM晚，一般可维持更长时间甚至长期存在。实验组一植入后第28天IgG水平明显高于假手术组，且差异有统计学意义，而实验组二的IgM 和IgG水平与假手术组对比均无统计学差异，说明纯化处理后复合大孔聚多糖可吸收止血材料具有较好的生物相容性。苏木精-伊红染色结果显示复合大孔聚多糖可吸收止血材料组有轻微慢性炎症，炎症较已上市产品的对照组更轻，因此还需继续延长观察周期，判断通过机体调节是否可恢复正常值。

综上所述，复合大孔聚多糖可吸收止血材料具有良好的生物相容性，是一种安全可靠的生物材料，具有较广阔的应用前景，此次实验为今后将其开发成医用止血材料的免疫毒性研究提供了科学依据，也为其他止血材料的免疫毒性研究提供了一种可供参考的方案。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
可吸收止血类医疗器械：指在常规止血技术无效的情况下，在手术过程中放置于人体内可被吸收的医疗器械产品，该类产品可通过加速创面局部血液的凝固过程产生止血作用。目前该类产品大多由以下材质制成：氧化纤维素、再生氧化纤维素、淀粉等植物多糖，以及可吸收性明胶、胶原等。该文的研究对象为以羧甲基壳聚糖和明胶为主要原材料的新型可吸收止血材料。
免疫毒性实验：免疫毒理学实验是观察药物对实验动物免疫系统产生不良影响的机制。免疫毒性研究已经作为药物非临床安全性评价的一项重要内容，在全面评价药物毒性方面发挥着越来越重要的作用。

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复合大孔聚多糖可吸收止血材料可直接作用于手术创面出血部位达到迅速止血的作用，材料可降解吸收，前期实验证实该止血材料在兔股动脉离断伤的有效性和安全性。此次实验建立 BALB/c小鼠背部植入模型，对团队自主研发的复合大孔聚多糖可吸收止血材料的免疫毒性反应进行评价，结果表明该止血材料具有较低的免疫毒性，研究结果为其后续临床应用提供了支持。  

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