2.1   各组复合膜形貌观察及孔隙率   各组复合膜试样在金相显微镜和扫描电镜下的情况分别如图1，2所示。







从金相显微镜照片中可以看到，湿润状态下，各组样品都具有水凝胶典型多孔结构。扫描电镜中，干燥后的各组复合膜相比较于湿润状态下多孔结构有一定塌陷，0BG样品具有相对明显的多孔结构。从金相图像和扫描电镜图像中均可以明确观察到58S生物玻璃粉末渗入到了各组复合膜的多孔结构中。
考虑到复合膜本身是具有不规则的三维多孔结构，实验对柱状形态复合材料整体的孔隙率进行了分析，可以观察到，随着生物玻璃含量的增加，复合膜的孔隙率在逐渐降低，说明生物玻璃渗入到了孔隙中。因为此次使用的生物玻璃并非是完全纳米级别，存在微米级别的颗粒，较大颗粒的生物玻璃渗入后会比较明显地导致孔隙的减少，但即使是平均孔隙率最低的1BG组，其孔隙率也是大于90%，见表1。



2.2   各组复合膜傅里叶变换红外光谱检测   图3展示了各组试样的傅里叶变换红外光谱检测结果。海藻酸钠光谱在1 610 cm-1处显示特征峰，对应于羧酸基团(C=O)；此外，在3 423 cm-1处观察到一个强烈的强峰，对应于-OH基团；在1 419 cm-1处观察到羧基的对称伸缩频率，而1 072-1 031 cm-1显示不对称伸缩频率。壳聚糖光谱在3 436 cm-1(-OH和N-H伸缩振动)、2 875 cm-1(C-H伸缩)、1 600 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 382 cm-1 (N-H弯曲)和1 081 cm-1 (C-O伸缩频率的骨架振动)处均表现出振动。58S生物玻璃在3 490 cm-1左右的峰与水的存在有关，在482 cm-1和1 238 cm-1处的肩部应当是Si-O-Si弯曲模式；此外，798 cm-1处的小肩部显示了Si-O-Ca振动模式[17]，在1 116-933 cm-1的峰值与P-O或Si-O有关。0.5BG、0.75BG和1BG在图谱中箭头标记位置中均可以发现新的特征峰，对应于生物玻璃的Si-O-Si弯曲模式。



2.3   各组复合膜的溶胀比、pH值稳定性、失重比及蛋白质吸附能力    图4A展示了各组样品的溶胀比，表1中展示了各组样品在第24小时的溶胀比。在整个观察时间段内，各组复合膜之间的溶胀行为存在差异，复合膜的溶胀比大小关系为：0BG>0.5BG>0.75BG>1BG。图4B展示了各组样品在24 h内的pH值变化，0BG的pH值小于初始值，其他组pH值都大于初始值，1BG样本有着最显著的pH值变化(最高可达pH=7.43)。图4C展示了各组复合膜在不同时间点的失重比，表1中展示了各组样品在第21天的失重比。体外降解的第21天，0BG组的失重率最高，高达62.10%，随着58S生物玻璃含量的增加，失重率依次为48.14%(0.5BG)，43.59%(0.75BG)和36.10%(1BG)。图4D展示了各组复合膜的蛋白质吸附能力，随着58S生物玻璃含量的增加，各组复合膜表现出的蛋白质吸附能力也是逐步提升的，并且各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。



2.4   各组复合膜表面的细胞黏附   图5展示了各组复合膜接种6 h后的细胞黏附情况。由染色图片可以看出，0.75BG和1BG组的细胞黏附情况是明显优于0BG和0.5BG组。从计数结果来看，随着58S生物玻璃含量的增加，各组复合膜表现出的细胞黏附能力也是逐步提升的，其中，0.75BG的细胞黏附数目约是0BG组的2倍，1BG的细胞黏附数目约是0BG组的3倍。



2.5   各组复合膜上的细胞增殖和碱性磷酸酶活力检测   图6A展示了各组复合膜在不同时间的细胞增殖情况。第1天，与0BG相比，0.5BG组的细胞增殖情况略好，但差异无显著性意义(P > 0.05)，0.75BG组、1BG组与0BG组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，且0.5BG、0.75BG和1BG组之间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。第3天，各组与第1天相比细胞均有明显增长；与0BG相比，0.5BG组的细胞增殖情况依然相对较好，但差异无显著性意义(P > 0.05)，而0.75BG组和1BG组依然优于0BG组和0.5BG组，与0BG组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，且0.5BG、0.75BG和1BG组之间两两比较差异有统显著性意义(P < 0.05)。第5天，各组与第3天相比细胞依然有增长，各组细胞增殖情况均优于0BG组，两两之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
图6B展示了各组复合膜上的细胞碱性磷酸酶活力检测结果。



第4天，0BG组和0.5BG组碱性磷酸酶活力并未表现出明显差别，而0.75BG和1BG组则表现出了较为明显的增长，1BG增长最多，且0.5BG、0.75BG和1BG组各组之间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。第14天，各组碱性磷酸酶活力值达到了3个时间点中的最高值，各组的碱性磷酸酶活力值均优于0BG组，具体的碱性磷酸酶活力大小顺序为：1BG>0.75BG>0.5BG，两两之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。第21天，各组碱性磷酸酶活力降低，但各组依然保持了一个较高水平，接近于第4天，其中0.75BG组和1BG组表现比较优异，依然高于第4天0BG组和0.5BG组的碱性磷酸酶活力水平。
2.6   复合膜的生物相容性   由细胞黏附与细胞增殖实验可知，海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃复合膜具有良好的生物相容性。

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口腔种植成功的先决条件是种植体植入到足够的骨中，而由炎症、拔牙等导致的骨量不足造成了相当棘手的问题[1]。对此，引导骨再生这一概念被提出，即通过在缺损区使用屏障膜阻止结缔组织出现，为骨再生留出必要的时间和空间[2]。引导骨再生膜可以分为可吸收膜和不可吸收膜[3]。可吸收膜能避免二次手术，减少患者痛苦，越来越多地成为治疗的首选，可吸收膜领域的研究越来越多地受到关注。天然生物聚合物具有优异的生物降解能力，含有类似于天然细胞外基质的结构，有利于组织修复。因而，将天然生物聚合物应用于探索新的可吸收膜是有着巨大潜力的。
海藻酸纳是天然阴离子聚合物 [4]，可以快速与二价(多价)阳离子或其他聚阳离子发生离子交联，最常见的是与钙离子交联形成水凝胶。此类海藻酸钠水凝胶的生物活性差，制备的膜对成骨细胞的黏附性较差[5]。另外，由于钙离子容易在体内被置换出来，海藻酸钠水凝胶无法在体内长期稳定存在，不能有效发挥空间维持和骨引导的作用[6]。壳聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性、免疫原性、抗菌性和伤口愈合活性，能够支持正常人类成骨细胞存活，可以应用为一种有效的骨缺损修复材料载体[7-9]。由于海藻酸钠是聚阴离子，壳聚糖是聚阳离子，所以壳聚糖与海藻酸钠可以通过聚电解质相互作用形成复合物。此外，壳聚糖对成骨细胞比成纤维细胞具有更好的细胞附着和增殖能力[10]。因此，壳聚糖应用于引导骨再生膜是具有潜力的。海藻酸钠/壳聚糖复合物在中性环境中具有较高的稳定性，不会导致明显的pH值改变，这在体内应用中十分重要[11]。海藻酸钠/壳聚糖复合物也具有优异的机械强度[12]。然而，壳聚糖不是理想的骨再生材料，因为生物活性和骨传导性较差，单纯壳聚糖支架的表面是没有磷灰石形成的[13]；另外，壳聚糖同样也存在细胞黏附性较差的问题[14]。因而，尽管海藻酸钠/壳聚糖相比较于单纯的壳聚糖或海藻酸钠表现得更加稳定，依然需要改善其成骨活性。生物玻璃表现出优异的生物活性和生物相容性，当植入骨缺损区时，它们可以通过化学连接直接与周围组织结合，促进细胞的黏附与增殖。在复合材料的研究中，生物玻璃作为无机成分已被证明能激活细胞水平上的生物反应[15]。此外，溶胶-凝胶获得的生物玻璃颗粒被证明能显著提高聚合物底物的生物活性[16]。聚合物/生物玻璃结合了聚合物的柔韧性和生物玻璃的生物活性特性，因而，在海藻酸钠/壳聚糖膜中引入生物玻璃理论上是有益于引导骨再生的。另一方面，从临床角度来看，在种植手术实施过程中需要简单快捷制备出所需样品。基于此，实验提出将海藻酸钠/壳聚糖与58S生物玻璃联合应用制备出新的可吸收膜，初步研究其理化性能和体外生物活性，为引导骨再生膜的研发与设计提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料表面特性实验，细胞形态学实验，对所得实验数据应用one-way ANOVA进行不同组之间的比较。
1.2   时间及地点   实验于2021年5月至2022年1月在大连大学附属中山医院骨科植入材料开发国家地方联合工程实验室和常州大学材料科学与工程学院完成。
1.3   材料   小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1(上海中国科学院细胞库，中国)；海藻酸钠(A0682，Sigma，美国)；壳聚糖(419419，Sigma，美国)；58S生物玻璃(昆山华侨科技新材料有限公司，中国)；氯化钙(国药集团，中国)；PBS(HyClone，美国)；FBS(GIBICO，美国)；青霉素-链霉素(100×)(C125C5，新赛美生物科技有限公司，中国)；MEM-α培养基(GIBICO，美国)；碱性磷酸酶试剂盒(WLA064，万类生物，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004，万类生物，中国)；胰酶0.25%(1×)(SH30042.01，HyClone，美国)；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WLA074b，万类生物，中国)；TritonX-100(Sigma，美国)；高效RIPA裂解液(R0010，碧云天，中国)；DAPI 染色液( 碧云天，中国)；恒温磁力搅拌器(上海一恒，中国)；离心机(BECKMAN COULTER，美国)；倒置金相显微镜(LEICA，德国)；荧光显微镜(LEICA，德国)；酶标仪(ELX-800，BIOTEK，美国)；傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700，Thermo Scientific，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃复合膜的制备   称取一定量的壳聚糖干粉溶于1.0%醋酸水溶液中，用恒温磁力搅拌器充分搅拌，形成质量浓度为10 g/L的均匀溶液。称取一定量的海藻酸钠溶于去离子水中，用恒温磁力搅拌器充分搅拌，形成20 g/L的均匀溶液。并分别对两种溶液进行过滤，去除任何未溶解的固体和杂质，保存于4 ℃环境中备用。58S生物玻璃主要构成为36%CaO、58%SiO2、6%P2O5，其粒径区间为0-80 μm。
按照0，5，7.5和10 g/L的质量浓度梯度，称取一定量的生物玻璃粉末，将其与配置好的海藻酸钠溶液混合，用恒温磁力搅拌器充分搅拌，形成均匀溶液。然后将海藻酸钠/生物玻璃溶液注入特定的聚四氟乙烯模具中，浸泡于CaCl2溶液中初步交联成型，然后再浸泡于配置好的壳聚糖溶液中。浸泡一定时间后，去除表面多余壳聚糖，在37 ℃下干燥6 h，然后控制厚度，修整为1 mm厚的膜，平均膜厚偏差控制在10%以内(±0.1 mm)，最终得到海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃复合膜。为了便于记录和分组，根据浓度梯度各组分别记为0BG、0.5BG、0.75BG和1BG复合膜。各组样品根据相应研究的需要，制备出不同的几何形状。
1.4.2   复合膜材料的理化性能检测
形貌观察：将按前述方法制备的各组复合膜置于金相显微镜下，观察其湿润状态下的微观形貌。将冷冻干燥后的膜材料修整成直径10 mm的圆片，采用扫描电镜观察膜材料在干燥状态下的微观形貌。
孔隙率检测：采用乙醇置换法从柱状整体角度来测定样品平均的孔隙率。首先，按前述方法制备复合材料，但是不修整厚度为1 mm，直接冷冻干燥，修整成直径2 cm的柱状体。将各组样品置入一个有刻度的圆杯中，其中含有已知体积(V1)的无水乙醇。接着，超声处理至少5 min，迫使乙醇进入支架的孔隙直到观察到没有气泡从样品中出现，此时总体积被记录为V2。然后将支架从圆杯中取出，剩余乙醇体积记为V3。用以下公式计算支架的孔隙率和密度：孔隙率(%)=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。每组至少选用3个平行试样进行测试，根据结果给出平均值。
傅里叶变换红外光谱检测：用傅里叶变换红外光谱分光光度计对复合膜的化学结构进行表征，每组复合膜至少选用3个平行试样进行测试。
溶胀比：将复合膜在80 ℃下先真空干燥，修整为直径2 cm，称质量(mo)。然后，将其浸泡在PBS中，并放置在37 ℃的培养箱中。经过几个具体的时间点后(10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，5 h，7 h，24 h)取出，用滤纸去除表面多余的水，再次称质量，记为(ms)。按照公式计算溶胀比，溶胀比(%) =(ms-mo)/mo×100。每组复合膜至少选用3个平行试样进行测试。
pH值稳定性：研究复合膜浸泡在PBS中48 h内的pH值变化。制备直径约2 cm的复合膜，将其在37 ℃下浸泡于10 mL PBS中。在0，0.5，1，2，3，5，7，12和24 h测定pH值。每组至少选用3个平行试样进行测试，根据结果给出平均值。
体外降解：将各组复合膜测试样品浸泡在PBS中，检测各组的体外降解情况。在测试前，记录下每个样品的初始质量(mi)。将各组复合膜修整为边长2 cm的正方形片，在5 mL溶液中37 ℃环境下浸泡3，7，14和21 d。样品在特定时间点提取，用PBS洗涤，干燥，观察浸泡后样品的最终质量(mt)。用公式计算失重比，失重比(%)= (mi–mt)/mi×100%。每组复合膜至少选用3个平行试样进行测试。
蛋白质吸附能力：在BCA法蛋白质测定原理的基础上进行了蛋白质吸附能力测试。将MEM-α培养基配制成包含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的完全培养基。将复合膜切成边长1 cm的正方形片，每组复合膜样品分别放入24孔板中。向每孔加入配置好的完全培养基，使复合膜完全浸没，然后在37 ℃、体积分数5%CO2和95%湿度下浸泡。2 h后，取出复合膜，用PBS冲洗3次。将经蛋白吸附后的复合膜分别浸泡在RIPA buffer中，以提取蛋白质。根据产品制造商的说明，吸取提取液20 µL转移到96孔板上，再向每孔加入200 µL BCA工作液，在37 ℃下反应30 min，用酶标仪在562 nm处测定吸光度值。最终以吸光度值结果来反映不同复合膜的蛋白质吸附能力。每组复合膜至少选用5个平行试样进行测试。
1.4.3   复合膜材料的细胞相容性和体外成骨分化
细胞培养：在完全培养基中培养MC3T3-E1细胞，培养条件维持在37 ℃、体积分数5%CO2和95%湿度下。按1∶3传代比进行正常传代，至第3代，细胞达到约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃下消化。将分离的细胞重新悬浮在完全培养基中，1 000×g离心5 min，弃掉上清液，加入完全培养基，吹打后进行细胞计数。调整细胞浓度备用。
细胞黏附：将制备好的海藻酸钠和壳聚糖溶液置于超净台中，紫外照射备用。将58S生物玻璃和CaCl2溶液进行高温高压灭菌。将恒温磁力搅拌器表面消毒擦拭后，置于种植手术室进行紫外照射，随后按照标准流程进行环境灭菌，遵循无菌操作原则制备海藻酸钠/58S生物玻璃溶液，将其保存于经灭菌处理的试管中，再次进行紫外线照射。将处理后的海藻酸钠/58S生物玻璃溶液与CaCl2溶液置于超净台中，在载玻片上制备复合膜，并保证复合膜能黏附在载玻片上。在24孔板底部用琼脂铺平，把负载有复合膜的载玻片放置于24孔板中，随后以5×108 L-1的细胞浓度向每孔接种MC3T3-E1细胞，每孔500 µL，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养6 h后，取出载玻片，按照厂商推荐指导用DAPI浸泡后，在荧光显微镜下观察细胞黏附情况。每组复合膜至少选用3个平行试样进行测试。使用Image J(National Institutes of Health，美国)处理所得照片，计算单位面积复合膜上所黏附的细胞数量。
细胞增殖：将测试样品切成边长1 cm的正方形片，用体积分数75%乙醇浸泡2 h，然后用PBS反复冲洗5次，再用紫外光照射1 h，完成样品消毒灭菌。在完全培养基中将测试样品预湿30 min，在接种细胞前取出。将每组复合膜样品分别放入24孔板中，以1×108 L-1的细胞浓度将MC3T3-E1细胞接种到复合膜表面，每孔500 µL。然后，细胞在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养2 h，随后补充3 mL完全培养基进一步培养到特定时间点。在特定的时间点，复合膜被转移到新的6孔板上，用PBS冲洗2次，以去除未附着的细胞或碎片，采用CCK-8检测盒评价成骨细胞增殖情况。每组复合膜至少选用5个平行试样进行测试。
碱性磷酸酶活力：在24孔板中，先以1×108 L-1的细胞浓度将MC3T3-E1细胞接种到复合膜表面，每孔500 µL。加入完全培养基，每2 d换液一次。在第4，14和21天时，向每孔添加0.2%Triton X-100完全浸泡5 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液备用。根据产品制造商的说明书，用微量移液器吸取30 μL上清液添加到96孔板中，加入相应反应液，充分混匀后在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养30 min。加入150 μL显色剂，并使用酶标仪在520 nm处记录吸光度值。利用BCA蛋白测定试剂盒按照产品制造商说明书测定并计算出总蛋白的含量。最后根据说明书中的指导公式计算出碱性磷酸酶活力，碱性磷酸酶(U/g)=(测定孔吸光度值-空白孔吸光度值)÷(标准孔吸光度值-空白孔吸光度值)×酚标准品质量浓度(0.02 mg/mL)÷待测样本蛋白质量浓度(g/mL)。每组复合膜至少选用3个平行试样进行测试。
1.5   主要观察指标   各组复合膜材料的溶胀比、pH值稳定性、失重比、细胞相容性以及体外成骨分化能力。
1.6   统计学分析   实验所得的数据结果全部通过SPSS (SPSS 20.0；SPSS Inc.，美国)软件进行数据分析，均以x±s表示。采用one-way ANOVA进行不同组之间的比较。检验标准设为 α=0.05，P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经大连大学统计学专家审核。

相较于引导骨再生概念刚刚提出时，目前的骨充填材料研究取得了巨大的进步，临床医生在制定引导骨再生治疗策略时有了越来越灵活的选择，可以根据需求将不同的骨充填材料与屏障膜联合应用，取得较好的临床效果。尽管骨充填材料性能越来越好，屏障膜依然占据着目前引导骨再生治疗策略中最为重要的地位。为了提高引导骨再生的成功率和拓宽引导骨再生治疗策略的选择范围，已经有大量研究者尝试通过不同方法制备屏障膜以进一步提高骨再生能力 [18-20]。天然生物聚合物因其优异的生物降解能力和良好的生物学性能越来越受到关注。
海藻酸钠是一种阴离子聚合物，具有与阳离子聚合物相互作用形成强静电的能力。在这种情况下，壳聚糖单元的阳离子电荷胺基与带负电荷的海藻酸钠静电相互作用，形成聚电解质混合物。在海藻酸钠/壳聚糖中加入58S生物玻璃可能使更复杂的离子相互作用成为可能。目前的组织工程学观点认为，适宜的孔隙率对于成骨细胞长入和必须的物质交换是有益的[21]，从孔隙率结果来看，各组复合膜对于成骨细胞的长入是十分有益的。一些研究表明，组分之间的氢键或离子-离子对相互作用通常会利于分散均匀[22]。
此次实验应用红外光谱研究了海藻酸钠/壳聚糖与海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃之间的分子化学相互作用，在海藻酸钠/壳聚糖存在的情况下，在1 600 cm−1处观察到一个强烈的峰值对应海藻酸钠的羧基和壳聚糖的胺基，这表明海藻酸钠的羧基与壳聚糖的胺基之间由于静电作用形成聚电解质复合物，这个结果与HO等[23]的研究是一致的；而在3 436 cm−1到
3 426 cm−1间观察到较低的–OH伸缩频率，这表明海藻酸钠/壳聚糖体系中存在着分子间的氢键[22]。相比较于0BG，0.5BG、0.75BG和1BG在图谱中箭头标记位置中均可以发现新的特征峰，对应于58S生物玻璃的Si-O-Si弯曲模式，可以说明58S生物玻璃是存在于除0BG复合膜外其他各组膜中的。
此次实验通过观察各组复合膜在PBS中的溶胀行为来评估复合膜的吸水能力。有文献报道认为海藻酸钠吸收水的速度很快，吸水量可以达到其自身质量的200-300倍[24]，这与此次实验中的结果相似，0BG组表现出了极高的溶胀比。随着58S生物玻璃含量的升高，溶胀比显著降低，这可能是由于58S生物玻璃与海藻酸钠网络之间的强相互作用所致，海藻酸钠的亲水基团可能与58S生物玻璃结合，从而导致亲水基团总数的减少。在体外细胞培养过程中，溶胀可以促进细胞以三维方式渗透到支架中。孔径的增加允许细胞利用材料的最大内表面。较高溶胀水平的样品将具有较大的表面积/体积，从而使样品能够最大可能地使细胞在三维水平上生长。溶胀的增加也使样品能更有效地利用培养基的营养，然而，溶胀过度的增加也会使支架内部结构崩塌，降低支架的力学性能，加速降解，还会对早期黏附于表面的细胞产生“冲刷”作用，造成脱落[25]；同时，由此带来的体积改变可能出现额外的负面效应，如增加了软组织缝合处的张力，从而不能满足实际应用需求。因此，在组织工程应用中较为理想的是根据需求合理地控制溶胀性能。
所有样本浸泡在PBS中后，除0BG组外，其他组的pH值出现变化主要表现在前几小时，然后pH值都达到了较为稳定的状态，结果显示pH值升高情况与58S生物玻璃含量呈正相关。pH值的改变很可能是由于生物玻璃颗粒与水接触时的部分水解，将化合物释放到环境中。生物玻璃中包含有几种碱性化合物，如氧化钙或五氧化二磷，对水的亲和力高、水解率高。生物玻璃的大部分水解产物是碱性的，因此会导致pH值升高。根据KAYSINGER等[26]的研究显示，当体液环境pH值处于7.0-7.6之间时，是十分适宜于人成骨细胞生长的，而在此次实验中，几组复合膜的pH值与此范围是接近的。
理想的膜材料降解速率应与骨再生速率相匹配，从而能给予骨修复材料充足的时间和空间进行骨再生[27]。一般来讲，体外降解速率与体内具有良好的相关性，通过体外降解实验可以间接了解植入材料在体内的降解趋势。此次实验为了解4种复合膜的降解情况，借助PBS在体外进行了降解测试，从结果中可以看出，58S生物玻璃的加入可以在很大程度上降低复合膜的降解速率，并且58S生物玻璃的含量越高复合膜的降解速率越慢，这可能是由于58S生物玻璃的加入限制了过量水分子的进入，随着58S生物玻璃含量的增加这种效果就更加明显，进而逐步延缓了复合膜的降解速率。
蛋白质吸附是生物材料表面在与含有蛋白质的体液接触后发生的早期事件之一。生物材料表面在蛋白质吸附后可以影响随后发生的一连串生物反应，如免疫反应、细胞黏附和细菌定植等。已知材料表面的蛋白质吸附是通过吸附纤维连接蛋白或玻璃连接蛋白等关键黏附分子来最终影响材料的细胞黏附性能[28]，因而，蛋白质吸附能力可以反映出材料对细胞的黏附能力。为了对复合膜的蛋白吸附能力进行大体评价，此次实验在BCA法蛋白质测定原理的基础上进行了蛋白质吸附能力测试。BCA蛋白定量方法是一种比较常见的蛋白浓度测定方法，其原理主要是：蛋白质会在碱性溶液中将Cu2+还原成Cu+，还原Cu+的量与蛋白质的量是呈正相关的，从而能够通过检测Cu+的量来推导出体系中对应的蛋白质的量。考虑到后续体外实验的连续性，选择将复合膜样品浸泡于与细胞实验胎牛血清含量一致的完全培养基中，因而，此次实验包含有胎牛血清的完全培养基被应用来检测蛋白质吸附能力。由结果可以看到，随着58S生物玻璃含量的增加，各组复合膜表现出的蛋白质吸附能力也是逐步提升的。蛋白质在海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃复合膜上吸附的增加可能是由于膜表面暴露的58S生物玻璃。58S生物玻璃与生物液体接触时可以在其表面形成羟基磷灰石层，而羟基磷灰石层可以和胶原纤维形成化学键键合。KILPADI等[29]认为羟基磷灰石可以从血清中吸附细胞黏附蛋白，如纤维连接蛋白和玻璃连接蛋白，随后成骨细胞前体可以通过整合素介导的机制黏附这些蛋白质。理论上来说，生物玻璃自身的相容性在复合膜中并未改变，生物玻璃可能增加了蛋白质在材料表面的结合位点，或促进了蛋白质与材料表面的静电相互作用，增强了蛋白质的吸附。目前有报道认为吸附的蛋白质可促进细胞反应，如增强碱性磷酸酶活性、促进细胞增殖及细胞矿化外基质的产生。在水凝胶体系中，溶胀比是个重要概念，溶胀比越大就意味着吸水能力越强，长入材料中的细胞也就更能从周围环境中吸取营养成分，更好地生长。在前述研究中，随着越来越高含量58S生物玻璃的加入，复合膜溶胀比表现出明显的降低趋势。从溶胀比角度来讲，58S生物玻璃含量越高的复合膜应该表现出更低的细胞相容性，但高含量的58S生物玻璃导致蛋白质吸附能力提高，进一步使细胞黏附能力得到提升，在后续的细胞增殖和碱性磷酸酶活力检测结果中，58S生物玻璃含量较高的复合膜反而表现出更好的细胞相容性。由此可以认为，蛋白质吸附能力的提升是可以抵消掉溶胀比降低所带来的负面效应。
MC3T3-E1细胞是目前被广泛使用的应用于体外成骨相关研究的细胞系之一。此次实验通过MC3T3-E1细胞来评价复合膜的生物学特性。首先，通过在复合膜表面接种细胞，大体观察了各组复合膜的细胞黏附情况，由染色图片和计数结果可以看出，0.75BG和1BG组的细胞黏附情况明显优于0BG和0.5BG组，这与前述蛋白质吸附的结果是一致的。随后，应用CCK-8试剂盒评价共培养下的细胞增殖情况，从结果中可以看见，随着时间的推移，各组复合膜的细胞增殖情况都表现出了增长，没有表现出明显的细胞毒性，在所有时间点中，细胞增殖与58S生物玻璃含量呈正相关。由此可以认为，58S生物玻璃的引入对细胞增殖起着十分明显的促进作用，在目前研究的比例范围内，58S生物玻璃含量越高细胞相容性越好，越有利于成骨细胞的增殖。作为成骨分化的早期标志，碱性磷酸酶在早期的骨形成中起着重要作用，在矿化过程中表现出较高的表达水平。此次实验对共培养下的细胞在第4，14和21天的碱性磷酸酶活力进行了测试，以评估各组复合膜早期诱导成骨的性能，可以看到各组碱性磷酸酶活力值在第14天达到了最高值，第21天降低，这与大多数研究中的结果类似。但值得注意的是，第21天，各组依然保持了一个较高水平，接近于第4天，而0.75BG组和1BG组表现比较优异，依然高于第4天0BG组和0.5BG组的碱性磷酸酶水平。该结果表明，引入58S生物玻璃后，成骨细胞在复合膜上可以在早期表现出一个较高水平的成骨分化，如果引入较高含量的58S生物玻璃甚至可以持续到第3周。结合前述研究结果可以认为，引入58S生物玻璃后对细胞行为有显著影响，复合膜上较高水平的成骨细胞附着可能是细胞增殖和早期成骨分化增强的原因，这对成骨分化和进一步的骨组织再生具有十分积极的影响。
此次实验成功制备了含有不同质量浓度的海藻酸钠/壳聚糖/58S生物玻璃复合生物膜。58S生物玻璃加入后的复合膜在溶胀比、体外降解和生物活性等方面均展现一定的优势，且该优势随着58S生物玻璃含量的升高而更加明显。0.75BG和1BG复合膜可以在较长时间上表现出较高水平的成骨分化，这对于骨再生是十分有利的。在目前研究范围内，当58S生物玻璃的质量浓度为7.5，10 g/L时，以海藻酸钠/壳聚糖/生物玻璃为基础构建出的复合膜可以实现较为优异的生物活性，将其应用于引导骨再生研究中是具有潜力的。考虑到此次实验是探索性研究，主要目的是为后续研究的设计和实施提供科学依据，因而在实验设计上没有针对实验结果进行更加深入的探讨，但实验数据可以为后续研究的展开提供参考和指导。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：

天然生物聚合物：衍生自生物体细胞或细胞外物质的聚合生物分子，包含共价键形成较大结构的单体单元，可以分为3大类：多核苷酸、多肽和多糖。
溶胀比：交联高聚物因吸收一定量溶剂而发生溶胀，当达到溶胀平衡时，其体积与溶胀前体积之比为溶胀比。
引导骨再生策略：一般来说，拟种植区骨缺损愈合和新骨形成的主要问题是结缔组织迅速出现并占据了缺损区。通常，骨缺损区结缔组织的存在会阻止成骨。最终，不完全的愈合经常导致薄壁骨缺损的出现。现代引导骨再生技术就是利用生物隔膜在骨面封闭骨缺损区或预期成骨的空间，根据实际需要联合多种类的骨充填物以达到完全成骨的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

天然生物聚合物具有优异的生物降解能力，含有类似于天然细胞外基质的结构，有利于组织修复，因而，将天然生物聚合物应用于探索新的口腔种植可吸收膜是有着巨大潜力的。海藻酸纳是天然阴离子聚合物，可以快速与二价(多价)阳离子或其他聚阳离子发生离子交联。壳聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性、免疫原性、抗菌性和伤口愈合活性，能够支持正常人类成骨细胞存活，可以应用为一种有效的骨缺损修复材料载体。由于海藻酸纳是聚阴离子，壳聚糖是聚阳离子，所以壳聚糖与海藻酸纳可以通过聚电解质相互作用形成复合物。在复合材料的研究中，生物玻璃作为无机成分已被证明能激活细胞水平上的生物反应。此外，溶胶-凝胶获得的生物玻璃颗粒被证明能显著提高聚合物底物的生物活性。聚合物/生物玻璃结合了聚合物的柔韧性和生物玻璃的生物活性特性，因而，在海藻酸纳/壳聚糖膜中引入生物玻璃理论上是有益于引导骨再生的。另一方面，从临床角度来看，在种植手术实施过程中需要简单快捷制备出所需样品。基于此，此次实验提出将海藻酸纳/壳聚糖与58S生物玻璃联合应用制备出新的可吸收膜，初步研究其理化性能和体外生物活性，为引导骨再生膜的研发与设计提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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