羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层敷料的制备及性能评价

doi:10.12307/2023.171

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 3949-3955.doi: 10.12307/2023.171

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羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层敷料的制备及性能评价

潘微，李漱阳，刘晋珲，梁成，段可，陈星陶

西南医科大学临床医学院，西南医科大学附属医院，四川省泸州市 646000

收稿日期:2022-01-26 接受日期:2022-05-14 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 陈星陶，博士，四川省骨科置入器械研发及应用技术工程实验室，西南医科大学临床医学院，西南医科大学附属医院，四川省泸州市 646000
作者简介:潘微，女，1987年生，四川省泸州市人，汉族，护师，主要从事创伤护理研究工作。
基金资助:
西南医科大学附属医院博士科研启动基金(20085)，项目负责人：陈星陶；西南医科大学附属医院博士科研启动基金(20089)，项目负责人：李漱阳

Preparation and performance evaluation of calcium sodium carboxymethyl cellulose/ hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer dressing

Pan Wei, Li Shuyang, Liu Jinhui, Liang Cheng, Duan Ke, Chen Xingtao

Aﬃliated Hospital of Southwest Medical University, School of Clinical Medicine of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2022-01-26 Accepted:2022-05-14 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Chen Xingtao, PhD, Aﬃliated Hospital of Southwest Medical University, School of Clinical Medicine of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Pan Wei, Senior nurse, Aﬃliated Hospital of Southwest Medical University, School of Clinical Medicine of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Doctoral Research Initiation Fund of Affiliated Hospital of Southwest Medical University, No. 20085 (to CXT); Doctoral Research Initiation Fund of Affiliated Hospital of Southwest Medical University, No. 20089 (to LSY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

羧甲基纤维素钠钙：羧甲基纤维素是纤维素中部分羟基被羧甲基取代的一种聚阴离子纤维素衍生物，通常使用的是其钠盐；通过离子交换可将其中部分钠替换为钙得到羧甲基纤维素钠钙，引入钙离子(凝血因子IV)可提高止血活性。
壳聚糖季铵盐：是将一个低分子季铵盐(如羟丙基三甲基氯化铵)连接在壳聚糖的氨基上形成的一类水溶性壳聚糖衍生物，在保留了壳聚糖优异的生物学性能基础上，大幅提升了抗菌性和可吸收性。

背景：湿性敷料已获得广泛认可，但通常缺乏抗菌性，其止血和保湿性也存在提升空间。
目的：构建羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层膜敷料，评价其理化性能及抗菌、止血、促进细胞增殖等功能性。
方法：采用离子交换法制备羧甲基纤维素钠钙，基于聚电解质界面络合制备羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层膜敷料(羧甲基纤维素钠钙∶壳聚糖季铵盐=2∶1、1∶1、1∶2)。检测多层膜的吸水性能及水蒸气透过率，采用傅里叶变换红外光谱仪、扫描电镜和能谱仪表征多层膜的组成、形态及结构，通过体外动态全血凝固实验评价多层膜的促凝血性，采用平板菌落计数法评价多层膜的抗菌性，采用直接接触法评价多层膜的细胞相容性。

结果与结论：①傅里叶变换红外光谱仪、谱仪表征显示，实验成功制备了多层膜敷料，扫描电镜下可见多层膜由羧甲基纤维素钠钙层、壳聚糖季铵盐层和界面络合形成的聚电解质复合物界面层组成；②3种多层膜在最初的10 min内快速吸水，随后吸水速率逐渐减缓并呈稳定趋势，与纯羧甲基纤维素钠钙膜的溶解趋势相比，多层膜在PBS中吸水后可稳定较长时间不溃散；3种多层膜的水蒸气透过率低于纯羧甲基纤维素钠钙膜；③纯羧甲基纤维素钠钙膜无抗菌性，多层膜具有抗菌性，且随着多层膜中壳聚糖季铵盐比例的增加，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗菌率增加；④多层膜(1∶2)的促凝血性能弱于多层膜(2∶1、1∶1)、纯羧甲基纤维素钠钙膜；⑤CCK-8检测显示，多层膜(1∶2)上的成纤维细胞增殖率低于多层膜(2∶1、1∶1)、纯羧甲基纤维素钠钙膜(P < 0.05)，激光共聚焦显微镜下可见各组膜上的成纤维细胞生长良好，呈梭形或多角形；⑥结果显示，羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层膜具有良好的吸水保湿、止血性能及抗菌性能。

https://orcid.org/0000-0001-9885-5362(陈星陶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 羧甲基纤维素, 壳聚糖季铵盐, 多层膜, 湿性敷料, 抗菌, 钙离子, 聚电解质界面络合, 止血, 细胞相容性

Abstract: BACKGROUND: Moist dressings have been widely accepted, but they usually lack antibacterial properties, and their hemostatic activity and moisture-retention can be further improved.
OBJECTIVE: To construct calcium sodium carboxymethyl cellulose/hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer dressing, and to investigate its physical-chemical properties and evaluate antibacterial, hemostatic and biocompatible performances.
METHODS: Calcium sodium carboxymethyl cellulose was prepared by ion exchange method, and calcium sodium carboxymethyl cellulose / hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer dressing (calcium sodium carboxymethyl cellulose:hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan=2:1, 1:1, 1:2) was prepared based on interfacial polyelectrolyte complexation. The water absorption and water vapor transmission of the multilayer films were determined. Fourier transform infrared spectrometry, scanning electron microscopy and energy dispersive spectroscopy were used to characterize the composition, morphology and structure of the multilayer films. The hemostatic performance, antibacterial activity and cytocompatibility of the multilayer films were evaluated by whole blood clotting, plate counting count and co-culture method, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Fourier transform infrared spectrometry and energy dispersive spectroscopy revealed that multilayer film dressing was successfully constructed. Scanning electron microscopy exhibited that the multilayer film was composed of calcium sodium carboxymethyl cellulose layer, hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan layer and polyelectrolyte complex interface layer, which was formed by interfacial complexation. (2) The three multilayer films absorbed water rapidly in the first 10 minutes, and then the water absorption rate gradually slowed down and showed a stable trend. Compared with the dissolution tendency of pure calcium sodium carboxymethyl cellulose film, the multilayer film could be stable for a long time without collapsing after absorbing water in PBS. The water vapor transmission rates of the three multilayer films were lower than those of pure calcium sodium carboxymethyl cellulose films. (3) Pure calcium sodium carboxymethyl cellulose film had no antibacterial properties. The multilayer film had antibacterial properties. With the increase of the proportion of hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan in the multilayer films, the antibacterial rate against Staphylococcus aureus and Escherichia coli increased. (4) The procoagulant property of the multilayer film (1:2) was weaker than that of the multilayer film (2:1, 1:1) and the pure calcium sodium carboxymethyl cellulose film. (5) CCK-8 assay showed that the proliferation rate of fibroblasts on the multilayer film (1:2) was lower than that on the multilayer film (2:1, 1:1) and pure calcium sodium carboxymethyl cellulose film (P < 0.05). Under the laser confocal microscope, the fibroblasts on the membranes of each group grew well and were spindle or polygonal. (6) The results show that the calcium sodium carboxymethyl cellulose/hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer film has good water absorption, moisturizing, hemostatic and antibacterial properties.

Key words: carboxymethyl cellulose, hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan, multilayer film, moist dressing, antibacterial, calcium ion, interfacial polyelectrolyte complexation, hemostasis, cytocompatibility

中图分类号:

潘微, 李漱阳, 刘晋珲, 梁成, 段可, 陈星陶. 羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层敷料的制备及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 3949-3955.

Pan Wei, Li Shuyang, Liu Jinhui, Liang Cheng, Duan Ke, Chen Xingtao. Preparation and performance evaluation of calcium sodium carboxymethyl cellulose/ hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer dressing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 3949-3955.

图/表（结果） 7

2.1 多层膜的组成、结构和形貌羧甲基纤维素钠离子交换前后的能谱仪结果，见图2a所示。羧甲基纤维素钠含有Na元素而不含Ca元素；CMC-Ca含有Na和Ca元素，未检测到Cl元素，考虑到浸泡液中Ca的来源为CaCl2及电荷守恒，可以推测出离子交换过程使得羧甲基纤维素钠中部分Na被Ca替换得到CMC-Ca。羧甲基纤维素钠和CMC-Ca的傅里叶红外光谱几乎相同，见图2b，表明二者的聚合物结构没有变化。

多层膜两面的傅里叶红外光谱见图2b所示。对于CMC-Ca面，3 325 cm-1左右的宽峰为O-H的伸缩振动峰；-COO-基团的不对称拉伸振动峰位于1 582 cm-1，而对称拉伸振动峰位于1 416，1 323 cm-1；与CMC-Ca相比，特征峰几乎不变。对于壳聚糖季铵盐面，3 330 cm-1左右的宽峰为O-H和N-H的拉伸振动峰；1 644，1 477 cm-1的2个峰分别对应于三甲基铵基中C=O的伸缩振动峰和C-H的弯曲振动峰；特征峰也与纯壳聚糖季铵盐几乎相同。结果与多层膜的设计预期相符。
多层膜(MF2)表面和断面的形貌，见图3所示，不同比例多层膜仅界面层位置有差别。两表面均显示均匀光滑的表面形貌，而断面则显示明显的分层结构，中间的界面层清晰可见(图中虚线框内)。对每层的能谱分析结果显示：壳聚糖季铵盐层(顶层)不含Na和Ca元素，富含Cl元素；CMC-Ca层(底层)不含Cl元素，富含Na和Ca元素；界面层(中间层)含有Na、Ca和Cl元素，与聚电解质复合物的特征相符。该结果与图2b中多层膜两面的傅里叶红外光谱结果相符，即多层膜的壳聚糖季铵盐面和CMC-Ca面的红外特征峰及元素组成与设计预期一致，进一步证明多层膜的结构与设计预期相符。

2.2 多层膜的吸水保湿性 CMC-Ca膜、多层膜在PBS中浸泡不同时间后的吸水率，见图4a所示。纯CMC-Ca膜在最初的10 min内迅速吸水溶胀，吸水率最高达967%，而后呈溶解趋势，导致测定的吸水率逐渐降低。3种多层膜在最初的10 min内也快速吸水，吸水速率低于CMC-Ca，随后吸水速率逐渐减缓并呈稳定趋势。与纯CMC-Ca膜的溶解趋势相比，多层膜在PBS中吸水后可稳定较长时间不溃散。CMC-Ca膜、多层膜的水蒸气透过率及厚度，见图4b所示。3种多层膜[约1 150 g/(m2·24 h)]的水蒸气透过率显著低于纯CMC-Ca膜[1 480 g/(m2·24 h)]，且3种多层膜之间没有显著差异。考虑到所有膜的厚度几乎相同(约130 μm，与扫描电镜结果一致)，聚电解质复合物界面层的存在可能是导致多层膜的水蒸气透过率较纯CMC-Ca膜降低(保湿性增加)的原因。

2.3 多层膜的抗菌性多层膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性，见图5所示。纯Ca/Na-CMC膜没有显示抗菌性，而多层膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率随壳聚糖季铵盐层比例的增加而显著增加，当壳聚糖季铵盐的比例从1/3增加到2/3时，多层膜对大肠杆菌的抗菌率从14%增加到99%，而对金黄色葡萄球菌的抗菌率从48%增加到99%。表明引入壳聚糖季铵盐可显著增加抗菌性，且壳聚糖季铵盐含量越高，抗菌性越强。

2.4 多层膜的体外凝血性通过动态全血凝固实验研究了不同膜的促凝血能力，见图6。吸光度值越低代表在该时间点未凝固的红细胞越少，材料的促凝血能力就越强。与空白组相比，所有样品组在每个时间点吸光度值均较低，提示所有样品材料均有促凝血性能。此外，样品组的吸光度均在2 min内迅速降低，此后趋于平稳，说明凝血过程在2 min时基本完成(2 min时典型照片见图6a)。在每个时间点，
CMC-Ca组的吸光度值均显著低于纯羧甲基纤维素钠膜，表明在羧甲基纤维素钠中引入钙离子可以显著提高止血活性。CMC-Ca组、MF1组和MF2组3组之间无显著差异，而MF3组的吸光度值显著高于上述3组。考虑到血液凝固发生在膜表面，这可能是由于MF1和MF2的CMC-Ca表面层厚度足够，故促凝血性能与纯CMC-Ca相近；而MF3较薄的CMC-Ca表面层则不足以支撑凝血(血液可能渗透进入聚电解质复合物界面层和壳聚糖季铵盐层)。

2.5 多层膜的体外细胞相容性 CCK-8细胞增殖实验(L929成纤维细胞)结果，见图7a所示。共培养2 d和4 d后，多层膜与纯CMC-Ca膜的细胞相对增殖率均超过91%，表明细胞相容性良好。此外，纯CMC-Ca组、MF1组和MF2组的细胞相对增殖率在第2天时分别为134%，135%，124%，在第4天时分别略微增加到147%，148%，133%，显著高于MF3组，提示CMC-Ca对细胞增殖有促进作用。共培养4 d后的细胞形态观察进一步证实了细胞增殖实验结果，见图7b。

与所有膜样品共培养的细胞均生长良好，呈典型的梭形或多角形成纤维细胞形态，进一步表明多层膜的细胞相容性良好。CMC-Ca组、MF1组和MF2组观察到的细胞数量明显多于MF3组，这与细胞增殖检测结果一致。

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引言

湿性愈合理论已经过大量临床实践验证并被广泛接受，该理论认为伤口在湿性环境下的愈合速率显著高于干性环境(可高出2-4倍)，因为伤口脱水会扰乱伤口愈合所需的微环境，进而阻碍愈合进程[1]。基于此，湿性敷料应运而生，其中以藻酸盐敷料(如Sorbalgon®和Kaltostat®)和水胶体敷料(如Comfeel®和TegasorbTM)最具代表性，前者的主要成分为交联的海藻酸盐[2]，而后者主要以羧甲基纤维素钠承担吸水保湿功能[3]。海藻酸盐和羧甲基纤维素钠还具有优良的生物相容性、可降解性、止血活性等，而且作为天然生物材料，来源广泛、环境友好、价格低廉[4]。
伤口的快速愈合不仅需要适宜的湿性环境，还需免受细菌感染，而海藻酸盐和羧甲基纤维素钠等材料均不具备抗菌性能[5-6]。目前的策略是在敷料材料中添加抗菌性物质，如无机抗菌剂(银、铜等)[7-8]、抗生素(庆大霉素、万古霉素等)[9-10]、抗菌肽[11]、季铵盐类化合物等[12-13]。银虽抗菌性极强，但对正常细胞有显著毒性，其生物安全性始终存在争议；抗生素则存在滥用及诱导产生耐药菌的风险；抗菌肽类新型抗菌剂成本普遍偏高，难以普及。壳聚糖季铵盐是将一个低分子季铵盐(如羟丙基三甲基氯化铵)连接在壳聚糖的氨基上形成的一类壳聚糖衍生物。与壳聚糖相比，壳聚糖季铵盐在保留了优良的生物相容性、止血性和成膜性的同时，大幅提升了抗菌性，因而作为新型抗菌剂引起广泛关注[14-16]。此外，壳聚糖季铵盐还具有水溶性、优良的保湿性及成膜性，有望用作新型抗菌湿性敷料材料[17-18]。
合理推测将壳聚糖季铵盐引入海藻酸盐、羧甲基纤维素钠等湿性敷料材料中，可以在保证保湿性的同时赋予其抗菌性能。为简化问题，此次实验以壳聚糖季铵盐和羧甲基纤维素钠为例进行实验。值得注意的是羧甲基纤维素钠为聚阴离子，壳聚糖季铵盐为聚阳离子，二者的水溶液混合后，基于静电相互作用会生成不溶的聚电解质复合物凝胶沉淀，导致复合材料的性能发生改变：羧甲基纤维素钠的吸水保湿性和壳聚糖季铵盐的抗菌性均降低[19-21]。因此，此次实验基于聚电解质界面络合制备羧甲基纤维素钠/壳聚糖季铵盐多层敷料[22]，力求在保持羧甲基纤维素钠湿性愈合优势的基础上赋予其抗菌性；此外，采用离子交换法在羧甲基纤维素钠中引入钙离子(凝血因子IV)以进一步提高止血性能[23-24]，获得兼具止血和抗菌双重功能的湿性敷料。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和事后检验。
1.2 时间及地点实验于2020年11月至2021年10月在西南医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料及试剂羧甲基纤维素钠(重均分子质量为2.5×106，取代度为0.9，上海阿拉丁生化科技公司)；壳聚糖季铵盐(重均分子质量为1×106，取代度为0.95，上海麦克林生化科技公司)；无水氯化钙(上海阿拉丁生化科技公司)；平板计数琼脂(美国BD医疗器械有限公司)；L929小鼠成纤维细胞(上海赛百慷生物技术公司)；DMEM细胞培养基(美国赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(美国gibco公司)；CCK-8试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；FITC标记的鬼笔环肽(美国Cytoskeleton公司)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，上海碧云天生物技术公司)。
1.3.2 主要仪器扫描电子显微镜(S-4800，日本日立公司)；傅里叶红外光谱扫描仪(Nicolet6700，美国赛默飞世尔科技公司)；激光共聚焦显微镜(A1R，日本尼康公司)；酶标仪(Epoch，美国伯腾仪器公司)；恒温恒湿箱(LHS-250HC-I，上海一恒科学仪器公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 羧甲基纤维素钠钙的制备和表征参考现有文献[25]，以羧甲基纤维素钠为原料采用离子交换法制备羧甲基纤维素钠钙。将羧甲基纤维素钠粉末分散在含有CaCl2(150 g/L)的乙醇/水(体积比4/1)混合溶液中，搅拌1 h。随后，将混合物3 000 r/min离心8 min，所得沉淀用乙醇/水(体积比4/1)混合溶液清洗2次，再用乙醇清洗一次；最后，在60 ℃下干燥过夜，即得羧甲基纤维素钠钙。采用能谱仪和傅里叶变换红外光谱仪表征羧甲基纤维素钠钙的组成和结构。

1.4.2 羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层膜的制备采用基于聚电解质界面络合的一步法制备多层膜，见图1。首先，将一定量羧甲基纤维素钠钙溶液(30 g/L)置于玻璃培养皿中，然后将壳聚糖季铵盐溶液(30 g/L)小心倾注于羧甲基纤维素钠钙溶液表面。静置30 min，可在两溶液界面处观察到界面络合反应生成的乳白色凝胶膜。随后，将该培养皿置于50 ℃下48 h，使其缓慢干燥成膜；小心揭膜即制得羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层膜。通过改变羧甲基纤维素钠钙与壳聚糖季铵盐的比例(2∶1、1∶1、1∶2)分别得到3种不同膜，依次记为MF1、MF2、MF3；不加入壳聚糖季铵盐溶液，其余步骤相同得到纯羧甲基纤维素钠钙膜，记为CMC-Ca。采用扫描电镜、能谱仪和傅里叶红外光谱扫描仪表征多层膜2个表面(羧甲基纤维素钠钙面和壳聚糖季铵盐面)及断面的组成、结构和形貌；使用螺旋测微器测量膜厚度。

1.4.3 多层膜的吸水保湿性能测试测定多层膜、纯CMC-Ca膜在PBS(pH=7.4)中的吸水溶胀行为。准确称取干燥的膜(直径10 mm，质量记为m0)质量，浸入PBS中，室温下浸泡一定时间(1，5，10，30和60 min)后取出膜，用滤纸轻轻擦拭以除去表面液体并称质量(mt，t为浸泡时间)。吸水率(%)=(mt-m0)/m0×100%。
根据标准方法测量多层膜、纯CMC-Ca膜的水蒸气透过率[24]。将每个膜样品密封(凡士林)在盛水的玻璃瓶口，保证液面与样品距离约5 mm，整个装置称质量(m0)。然后将其置于恒温恒湿箱中(25 ℃，60%相对湿度)，18-24 h后取出记录实验时间T，并立即称质量(m1)。水蒸气透过率[g/(m2·24 h)]=(m0-m1)×24/S，其中S(m2)为管口面积。
1.4.4 多层膜的抗菌实验评价多层膜、纯CMC-Ca膜对大肠杆菌(革兰阴性细菌，ATCC 8739，广东环凯微生物科技有限公司)和金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌，ATCC 6538P，广东环凯微生物科技有限公司)的抗菌性。将经过γ射线灭菌的膜样品(直径6 mm)置于24孔板中，然后将预先制备好的菌悬液(1.0×106 CFU/mL)添加到孔中，并在37 ℃下培养2 h。随后每个孔(包括膜样品)用PBS(pH=7.0)洗脱3次以分离细菌。将洗脱液混合，梯度稀释，用平板计数琼脂均匀接种，并在37 ℃下培养48 h。计数平板上的菌落，计算抗菌率(%)为(N0-N)/N0×100%，其中N和N0分别为有膜和无膜孔中计得的菌落数。
1.4.5 多层膜的体外凝血实验采用动态全血凝固实验评价膜的止血性能[21]。在平底小瓶底部制备具有不同表面层的膜：羧甲基纤维素钠膜、CMC-Ca膜、CMC-Ca层在上的MF1、MF2和MF3多层膜(参考1.4.2，先将壳聚糖季铵盐溶液置于瓶内，再将CMC-Ca溶液倾注于其上，干燥后不揭膜，其余步骤相同)。将450 µL SD大鼠抗凝血(西南医科大学动物实验中心提供，以9∶1的体积比与3.8%的柠檬酸钠混合)加入到每个小瓶的底部，以完全浸没膜表面，同时加入CaCl2溶液(45 µL，0.2 mol/L)以触发凝血。以不加膜的小瓶为空白组。随后将小瓶在37 ℃下震荡(80 r/min)不同时间(1，2，3，4，5 min)。在每个时间点，加入蒸馏水(15 mL)使得未凝固的红细胞溶血。将上层液体转移到试管中，1 000 r/min离心2 min，所得上清液加入到96孔板中，用酶标仪于540 nm处读取吸光度值，即代表未凝固血液的量。
1.4.6 多层膜的体外细胞相容性实验参考GB/T 16886.5-2017，采用直接接触法测定CMC-Ca膜、多层膜对L929成纤维细胞增殖的影响。在24孔板中以每孔1×106的密度接种L929细胞，置于培养箱(37 ℃、体积分数5%CO2)中培养3 d；更换新鲜培养基(含体积分数10%胎牛血清的DMEM)，并将灭菌的膜样品(直径6 mm)小心放置于孔中，继续培养2 d或4 d后，用含有10%CCK-8的新培养基替换原培养基继续培养2 h。可观察到培养基变为橙黄色，取100 μL转移到96孔板中并用酶标仪于450 nm处读取吸光度值。空白组不添加膜样品，其余步骤相同。细胞的相对增殖率=A/A0×100%，其中A和A0分别为添加和不添加膜样品时所得的吸光度值。
为了使用激光共聚焦显微镜观察细胞形态，使用上述相同方法在共聚焦培养皿中培养L929细胞。加入膜样品4 d后，移除培养基和膜样品并用40 g/L多聚甲醛固定细胞。避光条件下使用鬼笔环肽(FITC标记)对细胞骨架染色40 min，然后用DAPI对细胞核染色10 min，采用激光共聚焦显微镜观察经荧光染色的细胞形态。
1.5 主要观察指标多层膜的吸水保湿性能、促凝血能力、抗菌率和体外细胞相容性。
1.6 统计学分析所有实验均有至少3个平行试样，数据点以x±s表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和事后检验进行统计分析；当P < 0.05时认为差异有显著性意义。统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

伤口愈合是一个复杂的动态生物学过程，包括止血、炎症、上皮化和重塑四个阶段；对任意阶段产生影响的伤口敷料都将影响愈合进程[1，26]。因此为了提高促愈合能力，伤口敷料除了提供基本的保护功能外，通常还需具有促凝血、保湿、抗菌及促进细胞增殖等功能[26-28]。
作为伤口愈合的第一阶段，快速有效的止血至关重要。羧甲基纤维素钠的止血机制包括吸收血液中的水分，浓缩凝血因子，带负电的表面激活内源性凝血途径，以及作为纤维蛋白聚合的桥梁[25，29]。在此次实验中，为了提高止血活性，在羧甲基纤维素钠中引入Ca2+(凝血因子Ⅳ，可促进凝血)部分取代Na+得到CMC-Ca，结果表明止血活性显著增强。进一步实验表明，采用CMC-Ca和壳聚糖季铵盐制备多层膜时，止血活性与CMC-Ca层的厚度有关：当CMC-Ca层厚度足够时(MF1和MF2)，止血活性与纯CMC-Ca相当；而CMC-Ca层厚度较薄时(MF3)，止血活性降低。因此，基于聚电解质界面络合构建聚电解质复合物层将CMC-Ca层和壳聚糖季铵盐层分隔开，对于充分发挥CMC-Ca的促凝血作用至关重要。
根据湿性愈合理论，在合适的湿性微环境下，伤口愈合速度比脱水环境下快2-4倍，因而对于湿性微环境的需求贯穿伤口愈合的所有阶段[1]。伤口渗出物对于提供湿性微环境至关重要，但如果过量会产生负面影响[30]。因此，湿性敷料一方面应在整个愈合过程中确保伤口湿润，另一方面需吸收过量渗出物。吸水率实验用于测定多层膜吸收伤口渗液的能力，结果表明：不同于纯CMC-Ca膜先吸水后溶解的趋势，多层膜(MF2)在PBS中先迅速吸水溶胀然后维持稳定，这说明不溶于水的聚电解质复合物界面层对多层膜在过量液体环境中保持稳定至关重要。此外，多层膜的透湿性低于(保湿性高于)纯CMC-Ca膜，这可能是由于聚电解质复合物界面层的凝胶网络对水蒸汽透过形成一定阻碍。因此，作为湿性敷料，多层膜的保湿性优于纯CMC-Ca，且在吸收过量渗液后的稳定性也获得提升。
在上皮化阶段完成之前，感染风险始终是一个主要问题。目前的抗菌策略主要有引入抗菌剂(银、铜、各种抗生素等)或用抗菌结构(季铵盐、季膦等)修饰敷料分子。壳聚糖是一种经批准的伤口敷料材料，而作为壳聚糖季铵化衍生物，壳聚糖季铵盐在水溶性和抗菌性方面均获得大幅提升，可赋予湿性敷料抗菌性[31]。在此次实验中，壳聚糖季铵盐作为独立的一层，用于赋予多层膜抗菌性。抗菌实验结果表明，多层膜的抗菌率随壳聚糖季铵盐层比例的增加而增加。考虑到壳聚糖季铵盐的抗菌机制，即带正电荷的季铵盐基团与带负电荷的细菌细胞膜相互作用而导致膜通透性扭曲，因而正电荷密度对壳聚糖季铵盐的抗菌活性至关重要[15]。然而，带相反电荷的聚电解质(壳聚糖季铵盐和羧甲基纤维素钠)的络合可降低聚阳离子的正电荷密度[19]，从而降低抗菌活性。因此，此次实验以界面络合的方式，将络合作用限制在壳聚糖季铵盐和羧甲基纤维素钠的界面处，从而有效保证了壳聚糖季铵盐的正电荷密度及抗菌活性。
成纤维细胞在上皮化和重塑阶段至关重要，因此此次实验评价了多层膜对L929成纤维细胞增殖的影响。尽管通常认为壳聚糖季铵盐不具有细胞毒性，但仍存在争议，这取决于其取代度及细胞类型等[15，32]。在此次研究中，尽管所有样品均不表现出细胞毒性(细胞相对增殖率高于90%且细胞形态规则)，但相对增殖率及激光共聚焦显微镜观察到的细胞数量均随多层膜中壳聚糖季铵盐含量的增加而减少，提示壳聚糖季铵盐层对细胞增殖有轻微的负面影响。MF1和MF2组对细胞增殖仍表现出显著促进作用，说明CMC-Ca层对细胞增殖的促进作用超过了壳聚糖季铵盐层对细胞增殖的抑制作用。这些结果表明，多层膜中相对独立的CMC-Ca层对成纤维细胞相容性更好，更适合直接接触伤口。虽机制有待进一步探明，但可以明确的是通过聚电解质复合物界面层将CMC-Ca层与壳聚糖季铵盐层分隔开，有利于CMC-Ca发挥其促进细胞增殖的作用。
综上，以基于聚电解质界面络合构建多层结构的方式将壳聚糖季铵盐引入湿性敷料体系(以CMC-Ca为例)，可在保持湿性愈合优势的基础上赋予其抗菌性，且新生成的聚电解质复合物界面层还可提高材料在液体环境下的稳定性和保湿性。这些发现不仅表明CMC-Ca/壳聚糖季铵盐多层膜具有临床应用潜力，而且为开发多功能敷料提供了新策略。后续实验计划将在动物模型层面研究该敷料促愈合效果及组织相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

羧甲基纤维素钠钙/壳聚糖季铵盐多层敷料的制备及性能评价

Preparation and performance evaluation of calcium sodium carboxymethyl cellulose/ hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan multilayer dressing

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