壳聚糖胶原海绵的抗菌止血性能

doi:10.12307/2023.463

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (16): 2525-2533.doi: 10.12307/2023.463

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壳聚糖胶原海绵的抗菌止血性能

朱虹，林子恒，何柔烨，潘锦滨，刘小川，何晓玲，张静莹

广东医科大学，广东医科大学附属东莞第一医院，口腔医学3D打印技术重点实验室，广东省东莞市 523710

收稿日期:2022-06-25 接受日期:2022-07-29 出版日期:2023-06-08 发布日期:2022-11-10
通讯作者: 张静莹，博士，副教授，广东医科大学，广东医科大学附属东莞第一医院，口腔医学3D打印技术重点实验室，广东省东莞市 523710
作者简介:朱虹，女，1996年生，四川省成都市人，汉族，广东医科大学在读硕士，主要从事生物材料应用与软组织、骨组织工程方面的研究。
基金资助:
2021年广东医科大学大学生创新实验项目立项(FCZF002)，项目负责人：朱虹；2021年广东省大学生创新创业训练计划项目立项(GDMU2021106)，项目负责人：何柔烨；广东省基础与应用基础研究基金联合基金(2020B1515120001),项目负责人：张静莹；广东省普通高校重点领域(2020ZDZX2013)，项目负责人：张静莹；广东医科大学学科建设项目(4SG21015G，4SG21019G)，项目负责人：张静莹

Antibacterial and hemostatic properties of chitosan collagen sponge

Zhu Hong, Lin Ziheng, He Rouye, Pan Jinbin, Liu Xiaochuan, He Xiaoling, Zhang Jingying

Guangdong Medical University, First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Key Laboratory of 3D Printing of Stomatology, Dongguan 523710, Guangdong Province, China

Received:2022-06-25 Accepted:2022-07-29 Online:2023-06-08 Published:2022-11-10
Contact: Zhang Jingying, PhD, Associate professor, Guangdong Medical University, First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Key Laboratory of 3D Printing of Stomatology, Dongguan 523710, Guangdong Province, China
About author:Zhu Hong, Master candidate, Guangdong Medical University, First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Key Laboratory of 3D Printing of Stomatology, Dongguan 523710, Guangdong Province, China
Supported by:
the Project of Innovation Experiment for College Students of Guangdong Medical University, No. FCZF002 (to ZH); Project Establishment of Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students in Guangdong Province, No. GDMU2021106 (to HRY); the Basic and Applied Basic Research of Guangdong Province, No. 2020B1515120001 (to ZJY); Key Fields Foundation of Colleges and Universities in Guangdong Province, No. 2020ZDZX2013 (to ZJY); Discipline Construction Project of Guandong Medical University, No. 4SG21015G, No. 4SG21019G (to ZJY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

壳聚糖胶原海绵：以壳聚糖、碳酸氢钠及胶原为基本原料，通过冷冻干燥方法制备复合海绵，使海绵兼具壳聚糖的抗菌止血性能及胶原良好的生物相容性和天然可降解性，碳酸氢钠的微发泡作用强化海绵的止血效果，用于降低伤口感染发生率，并促进组织愈合。
壳聚糖的抗菌机制：带正电荷的壳聚糖分子和带负电荷的细菌细胞膜之间产生静电作用，引起细菌表面膜性质的改变和损坏，干扰DNA的复制与转录，从而抑制细菌的新陈代谢，导致细菌死亡，实验证实壳聚糖对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有抑制作用。

背景：胶原因具有良好的生物相容性和降解性能，常用于促进伤口愈合，但由于其不具备抗菌性能，不能预防伤口感染。
目的：通过冷冻干燥法制备壳聚糖胶原海绵，使其兼具良好的抗菌及止血效果。
方法：壳聚糖溶液与碳酸氢钠溶液在37 ℃下成凝胶态，利用冷冻干燥法制备壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵作为实验组，以壳聚糖海绵及壳聚糖/碳酸氢钠海绵为对照组，扫描电镜观测海绵的微观形貌，测定其pH值、孔隙率、吸水倍数、降解率及对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率；利用CCK-8法和Live/Dead染色检测海绵浸提液的细胞毒性；使用大鼠截尾出血模型检测海绵的止血效果；建立大鼠皮肤创伤模型，通过苏木精-伊红染色及Masson染色观察海绵植入7 d后的组织愈合情况。
结果与结论：①相较于其他两种海绵，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵的绵孔隙更大，外壁更粗糙，吸水性更强、孔隙率及吸水倍数更大；而且壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵孔隙率均大于另外两种海绵(P < 0.01)；平均吸水倍数复合海绵大于壳聚糖海绵(P < 0.000 1)和壳聚糖/碳酸氢钠海绵(P < 0.05)；②抗大肠杆菌率检测结果显示：壳聚糖海绵>壳聚糖/碳酸氢钠海绵(P < 0.001)>壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵(P < 0.000 1)；③抗金黄色葡萄球菌率检测结果显示：壳聚糖海绵>壳聚糖/碳酸氢钠海绵>壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵(P < 0.01)；④壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵无细胞毒性且可促小鼠成纤维细胞(L929)增殖，促细胞增殖效果优于空白组(P < 0.05)、壳聚糖组(P < 0.000 1)与壳聚糖/碳酸氢钠组(P < 0.05)；⑤壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵止血效果良好，优于其他三组；⑥壳聚糖/碳酸氢
钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵植入大鼠背部创口1周，周围皮肤无明显炎症反应，新生毛细血管及胶原含量明显高于其他两种海绵，皮肤组织恢复最佳；⑦上述数据证实，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵生物相容性良好，具有良好的抗菌止血及促进组织愈合效果。
https://orcid.org/0000-0001-8594-6177(朱虹)；https://orcid.org/0000-0002-7971-7180(张静莹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 壳聚糖, Ⅰ型胶原, 碳酸氢钠, 止血材料, 抗菌, 组织修复, 止血海绵, 伤口愈合

Abstract: BACKGROUND: Collagen, which has good biocompatibility and degradability, is commonly used to promote wound healing, but it is not effective in preventing wound infection because of its non-antibacterial properties.
OBJECTIVE: To prepare chitosan collagen sponge by freeze-drying method, which has good antibacterial and hemostatic effects.
METHODS: Chitosan solution and sodium bicarbonate solution became gel at 37 ℃. Chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge was prepared by freeze-drying method as the experimental group, and chitosan sponge and chitosan/sodium bicarbonate sponge were used as the control group. Scanning electron microscopy was used to observe the micro-morphology of the sponge and determine its pH value, porosity, water absorption, degradation rate and antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The cytotoxicity of the sponges was detected by CCK-8 assay and Live/Dead staining. The hemostatic effect of the sponges was detected by the rat model of amputation bleeding. The rat model of skin trauma was established. The tissue healing was observed by hematoxylin-eosin staining and Masson staining 7 days after sponge implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the other sponge groups, the chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge had larger porosity, rougher outer wall, stronger water absorption, greater porosity and water absorption multiple, and the porosity was greater than the other sponge groups (P < 0.01). The average water absorption multiple was greater than chitosan sponge (P < 0.000 1) and chitosan/sodium bicarbonate sponge (P < 0.05). (2) Anti-Escherichia coli test results showed that Escherichia coli resistance rate was chitosan sponge > chitosan/sodium bicarbonate sponge (P < 0.001) > chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge (P < 0.000 1). (3) Anti-Staphylococcus aureus rate test results showed that anti-Staphylococcus aureus rate was chitosan sponge > chitosan/sodium bicarbonate sponge > chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge (P < 0.01). (4) Chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge was non-cytotoxic and could promote the proliferation of mouse fibroblasts (L929), and the pro-proliferation effect was better than that of the blank group (P < 0.05), the chitosan sponge group (P < 0.000 1) and the chitosan/sodium bicarbonate sponge group (P < 0.05). (5) Chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge had a good hemostasis effect, which was better than the other three groups. (6) Chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge was implanted into the wound on the back of rats for one week without obvious inflammation in the surrounding skin, and the contents of capillary and collagen were significantly higher than those of chitosan sponge and chitosan/sodium bicarbonate sponge. The skin tissue recovered best. (7) It is concluded that chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge has excellent biocompatibility, antibacterial hemostasis and tissue healing properties.

Key words: chitosan, type I collagen, sodium bicarbonate, hemostatic material, antibacterial, tissue repair, hemostatic sponge, wound healing

中图分类号:

朱虹, 林子恒, 何柔烨, 潘锦滨, 刘小川, 何晓玲, 张静莹. 壳聚糖胶原海绵的抗菌止血性能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(16): 2525-2533.

Zhu Hong, Lin Ziheng, He Rouye, Pan Jinbin, Liu Xiaochuan, He Xiaoling, Zhang Jingying. Antibacterial and hemostatic properties of chitosan collagen sponge[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(16): 2525-2533.

图/表（结果） 12

2.1 壳聚糖胶原止血海绵pH值变化如表1所示，壳聚糖溶液呈酸性，pH值为5.87，碳酸氢钠溶液为强碱弱酸盐，pH值为9.21，Ⅰ型胶原蛋白溶液呈酸性，pH值为4.66。因此，通过具有缓冲作用的碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至中性(7.35-7.45)，使其符合人体生理环境的pH值。

2.2 复合海绵的成胶效果如图1所示，3种溶液在25 ℃保持澄清可流动状态，见图1A-C。置于37 ℃ 10 min后，壳聚糖溶液未发生任何变化，见图1D，而壳聚糖/碳酸氢钠溶液及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原溶液转变成白色不透明凝胶状，见图1E-F。

2.3 海绵表面形貌图2分别显示各组海绵的俯视图及正面图，随着胶原的加入，海绵疏松度有所增加，蓬松感加强。

图3显示了各组海绵在扫描电镜200倍镜下及500倍镜下的微观形貌，壳聚糖组孔径大小一致、排列有序，见图3A，D；加入碳酸氢钠后，壳聚糖/碳酸氢钠组孔壁变得粗糙，见图3B，E；加入胶原以后，孔径明显增大，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原组内部呈丝网状，见图3C，F。

2.4 海绵降解曲线、孔隙率及吸水倍数图4A显示壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵孔隙率最大，孔隙率平均为99.13%，大于壳聚糖海绵的平均孔隙率91.57% (P < 0.01)及壳聚糖/碳酸氢钠海绵的平均孔隙率98.12% (P < 0.01)。图4B显示了海绵30 min内的吸水倍数，经测量显示，壳聚糖海绵30 min内的平均吸水倍数为25.88倍，而碳酸氢钠加入后的壳聚糖/碳酸氢钠海绵和壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵吸水效果明显增加，平均吸水倍数分别为40.75倍(P < 0.000 1)和46.74倍(P < 0.05)。降解实验表明壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵的降解速率最慢，96 h时仅降解46.15%；壳聚糖/碳酸氢钠海绵降解率次之，96 h时降解52.20%；而壳聚糖海绵降解速率最快，96 h时降解60.86%，见图4C。

2.5 海绵抗菌效果图5A-H表明，壳聚糖海绵的抑菌效果最佳，抗大肠杆菌率平均为80.58%，抗金黄色葡萄球菌率平均为80.14%；碳酸氢钠的加入在改变pH值的同时降低抗菌率，壳聚糖/碳酸氢钠海绵抗大肠杆菌率平均为55.06%，抗金黄色葡萄球菌率平均为59.06%；壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵的抗大肠杆菌率平均为57.56%，抗金黄色葡萄球菌率平均为51.21%，综上所述，抗大肠杆菌率：壳聚糖>壳聚糖/碳酸氢钠海绵>壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵(P < 0.001，P < 0.000 1)，抗金黄色葡萄球菌率：壳聚糖海绵>壳聚糖/碳酸氢钠海绵>壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原蛋白海绵(P < 0.01)，见图5I，J。

2.6 海绵生物相容性 Live/Dead染色结果显示，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原组活细胞数量较其他三组多，壳聚糖组活细胞最少，见图6A-L，图6M为荧光染色下活细胞与死细胞百分比。CCK-8检测结果表明壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵浸提液对细胞无明显毒性，壳聚糖及壳聚糖/碳酸氢钠海绵浸提液对细胞呈现微毒性，见图6N。

2.7 海绵止血效果采用大鼠断尾出血模型评价海绵的止血能力，见图7A-F。选用12只大鼠进行大鼠断尾出血实验，结果显示，空白对照组自然完全凝血时间平均为963.33 s(P < 0.05)，失血量平均为9 153.67 mg；覆盖壳聚糖海绵的鼠尾止血时间平均为718 s(P < 0.01)，失血量平均为3 419.37 mg(P < 0.05)；覆盖壳聚糖/碳酸氢钠海绵的鼠尾止血时间平均为321 s(P < 0.05)，失血量平均为2 270.84 mg(P < 0.001)；而壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵在178 s(P < 0.01)即可使尾部血液凝固，失血量平均为553.83 mg，见图7K-L，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵止血效果优于壳聚糖海绵及壳聚糖/碳酸氢钠海绵。

2.8 海绵促创口愈合效果采用大鼠皮肤创伤模型评价海绵的促组织愈合效果，模型建立流程见图8A-J。选用12只大鼠进行皮肤创伤实验，分别填塞3种不同成分的海绵，见图9。大鼠创口造模7 d后，壳聚糖/碳酸氢钠海绵填塞的大鼠背部伤口仍有结痂，大鼠背部隆起，海绵大部分未降解，而壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵填塞的伤口无结痂，大部分被降解。图10显示将大鼠伤口处的皮肤及皮下组织进行苏木精-伊红染色、Masson三色染色及苏木精-伊红染色显示，术后7 d，空白对照组的皮肤结缔组织出现不同程度的断裂，炎症细胞增多，见图10A，I。壳聚糖海绵组及壳聚糖/碳酸氢钠海绵相较于空白对照组而言，无明显炎症反应且毛细血管生成明显增多，成纤维细胞明显增生且有序，见图10B，C，J，K，壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵覆盖填塞的组织血管及纤维组织增生最多且致密，皮肤角质层明显增厚，皮下组织中可见众多毛囊样结构，皮肤结构完整且有序，见图10D，L。该实验表明：三组海绵均可有效促进皮肤创口的愈合，其中壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵效果最佳，更能恢复皮肤及皮下组织的正常组织结构。

2.9 不良反应分析实验分别将壳聚糖海绵、壳聚糖/碳酸氢钠海绵、壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵植入大鼠背部，观察7 d，海绵在大鼠体内降解较慢，壳聚糖组大鼠背部有海绵未完全吸收而形成的囊状物，壳聚糖/碳酸氢钠海绵、壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵大鼠未出现其他局部及全身不良反应，见表2。

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引言

创口愈合是全球医疗系统中研究的重点之一，创口愈合的4个阶段为急性炎症期、细胞增生期、肉芽组织形成期、组织塑形期。若创口愈合过程中出现感染则会导致愈合缓慢或伤口迁延不愈，由于定植细菌渗入伤口后不断增殖并产生毒素和酶，会引起组织坏死、基质或胶原纤维溶解从而导致局部炎症持久不易消退，不利于组织修复和创伤愈合，甚至出现严重的系统症状。迄今为止，已经开发各种创口敷料，如海绵、敷贴、泡沫和凝胶[1]，但目前很少有兼具预防感染和促进伤口愈合的多功能型敷料。因此开发制备兼具抗菌及止血效果的复合海绵有利于预防伤口感染、促进创伤后愈合。在口腔医学领域中，拔牙创出血是口腔临床上常见的一种并发症，其定义是拔牙后持续超过8-12 h的出血[2]。拔牙后出血的发生率0%-26%[3]。如果无法控制由创伤性拔除导致血管撕裂、感染、颌骨骨折的原发性出血，或由高血压、血小板凝血障碍及药物干扰引起的继发性出血，可能会导致感染、疼痛和软组织血肿等并发症，甚至严重失血会引起失血性休克。同时，临床上常因为伤口愈合过程中并发细菌感染，导致拔牙创迁延不愈[4]，拔牙创与后期牙修复的治疗效果密切相关。因此，开发兼具抗菌及止血效果的复合海绵，将有利于避免拔牙术后并发症的发生，有利于促进伤口恢复和拔牙创口愈合。
壳聚糖是目前临床上使用最广泛的多糖类止血材料[5]，壳聚糖具有类人体氨基葡聚糖结构及纤维素和胶原的生物功能，可被体内的溶菌酶降解[6]，具有良好的生物相容性[7]。壳聚糖由甲壳素转化而来，且来源广泛、价格低廉，是理想的新一代伤口敷料[8-10]。壳聚糖能够通过静电吸引力使带负电的红细胞聚集和变形，从而促进凝血[11]，达到良好的止血效果[12]。已有研究证明其对不同的真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌具有抗菌活性[13]。壳聚糖的抗菌机制是带正电荷的壳聚糖分子和带负电荷的细菌细胞膜之间产生静电作用，引起细菌表面膜性质的改变和损坏，从而抑制细菌的新陈代谢，导致细菌死亡[14]。另一方面，有研究证实壳聚糖及壳聚糖衍生物可与中性粒细胞和巨噬细胞相互作用[15]，调节再上皮化过程和纤维增生，加速伤口愈合及防止伤口感染[16-17]。MALETTE等[18]报道壳聚糖具有促凝血活性，其与细胞膜非特异性结合，能够促进血细胞聚集和血凝块形成，从而凝固血液。因此壳聚糖基材料具有广泛的应用前景，可作为抗菌止血材料应用于皮肤组织工程和口腔医学等领域[19-21]。
胶原蛋白是临床上常用的伤口敷料[22]，其为长短不一的三螺旋结构，多肽链的初级结构有所差异，即氨基酸组成和顺序不同所致各型胶原结构差异，从而导致大分子形态和生物性能差异[23]，其中Ⅰ型胶原是人体中最丰富的胶原蛋白[24]，
Ⅰ型胶原分子结构的特异性使胶原具有良好的生物相容性、生物降解性及促进细胞增殖分化等生物学功能[25-27]，在伤口愈合过程中发挥良好的止血效果及促进组织愈合效果。胶原的止血机制是由于胶原亲水性强，能吸附创面渗血，并紧密黏附于创面而形成血痂，并且胶原纤维网能够吸附聚集血小板和凝血因子，激活内外源性凝血机制，故止血效果佳[28]。胶原促进组织愈合的机制在于胶原纤维及其网络作为细胞外基质重要组成成分，通过交联重塑形成高度组织化的三维支架，可促进成纤维细胞、内皮细胞等黏附、迁移、分化和增殖[29]，并可促进生长因子等细胞因子的产生[30]，在伤口愈合过程中，生成肉芽组织替代原始血凝块从而封闭伤口[31]，促进创面修复[32]，加速组织愈合[33]。
结合壳聚糖的抗菌性和胶原的生物相容性，实验在此基础上创新性添加碳酸氢钠，通过碳酸氢钠调整pH值，以其微孔发泡作用增加海绵的孔隙率、吸水倍数及降解率[34]，从而使得材料止血效果更佳。由于壳聚糖呈现微细胞毒性，通过添加碳酸氢钠，调节三者比例使得材料pH值调节至中性，增加了生物相容性和促进组织愈合效果，并且碳酸氢钠与壳聚糖能够进行交联反应，成胶时间短、效果好，材料制备方法更为简短、制备时间大为缩短，降低了时间成本。采用冷冻干燥法制备兼具降解性、抗菌和止血性能的复合海绵[35-37]，为组织修复和拔牙创伤口的愈合提供复合功能。此次实验通过扫描电镜观察海绵表面形貌，测定材料孔隙率、降解率和吸水倍数；通过抗菌实验鉴定复合海绵的抗菌效果；通过细胞实验检测复合海绵的细胞毒性和生物活性；通过大鼠截尾出血模型及大鼠皮肤创伤模型，检测复合海绵的止血效果及促进组织愈合能力。
实验旨在进一步解决临床术中术后出血过多及术后伤口易感染的问题，更好地促进皮肤创口愈合利于组织修复，促进拔牙创口愈合。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料性能表征、细胞实验和动物实验；单因素方差分析结合LSD-t事后检验。
1.2 时间及地点于2021年6月至2022年5月在广东医科大学第二临床医学院口腔医学3D技术打印重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康3月龄雄性SD大鼠24只，体质量(350±50) g，购自广州市花都区花东信华实验动物养殖场，许可证号：SCXK (粤) 2019-0023。实验经广东医科大学实验动物伦理委员会LAEC批准，批准号：GDY2002051，批准日期：2021-05-13。
1.3.2 细胞实验中采用的细胞为小鼠成纤维细胞。

1.3.3 生物材料该实验中采用的生物材料为壳聚糖、Ⅰ型胶原和碳酸氢钠。

1.4 实验方法
1.4.1 不同海绵的制备实验制备了3种海绵，分别为壳聚糖(chitosan，CS)海绵、壳聚糖/碳酸氢钠(chitosan/sodium bicarbonate，CS/NaHCO3，CN)海绵、壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原(chitosan/sodium bicarbonate/type I collagen composite sponge，CS/NaHCO3/Col-I，CNC)复合海绵，参考以往文献的制备方法进行制备[38]，即室温下，将1.5 g的壳聚糖粉末(相对分子质量：50 000-190 000，脱乙酰度：75%-85%；Sigma公司，美国)溶于体积分数1%的冰乙酸中，磁力搅拌器(JB-3，雷磁，中国)搅拌24 h，以4 000 r/min离心30 min，制备壳聚糖溶液，封口膜密封后4 ℃保存待用。室温下，称取0.84 g的碳酸氢钠粉末(Biosharp，中国合肥)，溶于100 mL的双蒸水中，搅拌至完全溶解，封口膜密封后4 ℃保存待用。冰浴下，将碳酸氢钠溶液加入体积分数3%壳聚糖溶液中，壳聚糖∶碳酸氢钠体积比=1∶2，充分搅拌制成壳聚糖/碳酸氢钠壳聚糖/碳酸氢钠溶液。冰浴条件下，将Ⅰ型胶原溶液(自制胶原)加入壳聚糖/碳酸氢钠溶液中，充分搅拌，配制成壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原溶液，将壳聚糖溶液、壳聚糖/碳酸氢钠溶液及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原溶液放入37 ℃气浴恒温震荡器(THZ-92B，上海博讯实业有限公司医疗设备厂，中国)12 h，制成壳聚糖溶液、壳聚糖/碳酸氢钠凝胶及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原凝胶。以倒瓶法观察成胶时间，制备出的壳聚糖/碳酸氢钠凝胶及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原凝胶在室温下呈透明多气泡液体，在37 ℃发生凝胶化现象，呈乳白色微透明凝胶。将壳聚糖溶液、壳聚糖/碳酸氢钠凝胶及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原凝胶置于-80 ℃冰箱预冻12 h，放入真空冷冻干燥机48 h制成壳聚糖海绵、壳聚糖/碳酸氢钠海绵及壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵。
1.4.2 壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵的性能表征
pH值测定：用pH仪[FE28，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，中国]测量不同溶液的pH值，然后加入碳酸氢钠溶液调整pH值至7.35-7.45。
海绵形貌观察：将海绵置于真空冷冻干燥机(SCIENTZ-
10 N，宁波新芝冻干设备股份有限公司，中国)中冻干48 h，将冻干的海绵样品用手术刀裁剪成5 mm×5 mm，厚2.5 mm，喷金处理后，于15 kV加速电压下在扫描电显镜(SEM，JSM-IT500，JEOL，日本)下观察样品的微观形貌。
孔隙率测定：采用称重法检测复合海绵孔隙率。称取样品质量(mt)，称取装有200 mL双蒸水的烧杯质量(m1)；待水充满样品孔隙后称质量(m2)；将材料从烧杯里取出后剩余水分和烧杯再称质量(m3)，进行孔隙率的计算。各样品均平行测定3次后取平均值，孔隙率=(m2-mt-m3)/(m1-m3)×100%。
吸水倍数测定：将复合海绵在37 ℃烘箱中烘干到恒质量，随后将其冷却至室温后称质量(m0)。随后将各样品放入100 mL 生理盐水中浸泡3 min，再将样品置于37 ℃烘干箱里烘干水分，过程大约2 min，再用滤纸吸收外表多余水分后称质量(m1)。最后进行吸水率的计算，各样品均测3次后取平均值，吸水倍数=(m1-m0)/m0×100%。
降解率测定：采用称重法检测复合海绵降解率。测定样品冻干后的质量(w0)，每组为3个平行样品。将100 μL溶菌酶(2 g/L；Sigma公司，美国)与100 μL的Ⅰ型胶原酶(1 g/L)加入5 mm× 5 mm的冻干凝胶支架中。放入37 ℃气浴恒温震荡器中，以50 r/min震荡相应时间取出，每天更换降解液，以保证酶的活性。将降解后的凝胶表面的降解液吸干，PBS清洗2次，吸干PBS，冻干称质量，记为w1。分别计算12 h，24 h，48 h，72 h，96 h的降解率。各样品均平行测3次后取平均值，降解率=(w1-w0)/w1×100%。
抑菌率测定：采用海绵浸提液来评价复合海绵对革兰阴性菌种大肠杆菌(E.coli)和革兰阳性菌种金黄色葡萄球菌(S.aureus)(广东环凯微生物科技有限公司，中国)的抗菌效果，将菌落在海绵浸提液中培养24 h，涂布在平板上生长24 h后观察抑菌效果，拍照记录。各样品均平行测3次后取平均值，抑菌率=(n实验组-n空白组)/n空白组×100%。
1.4.3 细胞实验
CCK-8检测：将海绵放入50 mL离心管中，加入DMEM培养基10 mL，然后置于37 ℃恒温培养箱中浸泡12 h后得到浸提比为5 g/L的浸提液，用0.22 μm的滤头过滤除菌后备用。将小鼠成纤维细胞(L929；中国科学院细胞库)按5×107 L-1细胞浓度接种于96孔板，预先放置在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养24 h，除去培养基，加入100 μL浸提液，在培养箱内培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂(Biosharp公司，中国)，在培养箱内孵育3 h，用酶标仪(IMark，Bio-Rad，美国)测定450 nm处吸光度值。
Live/Dead染色：将复合海绵置于PBS中，浸提比例为5 g/L，25 ℃浸提48 h。将L929细胞按5×107 L-1细胞浓度接种于96孔板，37 ℃培养箱中培养12 h，每孔加入200 μL浸提液处理24 h，加入Calcein-AM/PI Double Staining Kit(东仁化学科技(上海)有限公司，中国)进行Live/Dead染色，于倒置荧光显微镜( IX73，Olympus，日本)下观察细胞染色形态。
1.4.4 动物实验
大鼠断尾出血模型建立、止血时间及失血量测定：参考以往研究的方法进行大鼠断尾出血模型建立[39]，选用12只3月龄的健康雄性大鼠，选用体质量相近的大鼠随机分为4组，即空白对照组、壳聚糖组、壳聚糖/碳酸氢钠组、壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原组，每组3只。体积分数3%戊巴比妥钠溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。用体积分数75%乙醇消毒大鼠尾巴，用手术剪在尾巴距离根部6 cm处标记后剪掉尾巴，保证正常失血，确保材料未脱落，待切口完全无血液渗出时记录止血时间，标志大鼠断尾出血模型建立成功，用5 mL离心管收集血液并称重。
大鼠皮肤创伤模型建立、苏木精-伊红及Masson三色染色：参考YUAN等[40]的方法进行大鼠皮肤创伤模型建立，选用12只3月龄的健康雄性大鼠，分组及麻醉方法同上所述。每只大鼠背部切开2个2 cm长的手术切口，切开大鼠背部皮肤及皮下组织，钝性分离筋膜。分别填塞相应海绵后原位缝合，术后观察切口无开裂、无渗血、无感染、大鼠背部材料未脱落、大鼠无死亡，认为大鼠皮肤创伤模型建立成功。常规分笼饲养，7 d后处死大鼠并收集创口愈合处3 cm×1 cm的样本，进行苏木精-伊红染色及Masson三色染色，于倒置相差显微镜(Olympus CKX53，日本)观察各组皮下及皮下组织结构。
1.5 主要观察指标壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原复合海绵的表面形貌、孔隙率、吸水倍数、降解率、抗菌率、止血效果及促进组织愈合的效果。
1.6 统计学分析采用Grapgpad Prism 9.0软件进行数据分析，数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD-t法，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广东医科大学生物统计学专家审核。

讨论

拔牙创口在愈合过程中易受到酸性、缺氧及慢性炎症等不利因素的影响，容易出现术后感染及出血等并发症，传统止血海绵由于其功能局限，难以达到令人满意的抗菌、止血效果。因此，亟待开发一种兼具抗菌和止血功能的新型止血海绵。口腔是有菌环境，拔牙创口会导致正常生理屏障破坏、口腔微生态失调，术后感染发生率高达70%。感染扩散会引起面颊部红肿、口腔异味、张口受限及发热等不适症状，给患者带来极大痛苦[41]；而且，拔牙创口愈合不良导致的疼痛、肿胀及干槽症等，延长骨组织愈合时间，对患者咀嚼功能造成较大影响。因此，开发及应用抗菌止血海绵能减少术后出血、降低感染发生率，促进创口愈合。
目前临床促进创口愈合的材料主要包括：明胶海绵、胶原蛋白海绵及壳聚糖海绵等。明胶作为胶原蛋白的水解产物，其微细孔状泡沫结构有利于形成局部血凝块从而止血，可自行吸收，但明胶海绵黏附性不足、容易浮出移动引起血块脱落[42]。壳聚糖海绵抗菌止血效果优良，能够减少创面血液渗出，促进创面组织修复且易于形成凝胶，黏附性好[8]。胶原蛋白海绵不良反应小、止血效果好[43]，但单一成分的胶原海绵强度低、在潮湿环境易受细菌侵蚀而变质。因此，复合海绵更有利于达到更好的抗菌、止血及促进组织愈合效果。
ZHANG等[44]开发的JWCNT/HBC三维止血海绵通过添加羟丁基壳聚糖，提高材料的血液相容性及抗菌活性。FAN等[45]制备了一种多孔亲水壳聚糖海绵，证实其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌特性；GADKARI等[46]通过交联制备壳聚糖-肉桂醛纳米粒子，能显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长。前人多利用壳聚糖的抗菌性能进行材料内部或表面改性制备抗菌海绵，但由于壳聚糖呈现酸性、合成中常引入微毒性的化学交联剂和外源性试剂等原因，存在材料的生物相容性不佳、降解效率有限、促进组织愈合效果不明显等问题。
壳聚糖作为Ⅰ型胶原的天然物理交联剂[47]，其与Ⅰ型胶原混合可有效提高孔隙率和吸水性，提高生物降解率，改善其生物活性诱导能力[48]，促进止血及伤口愈合[49]。胶原蛋白是细胞外基质的主要组成部分，对组织形成和维护内环境平衡起到至关重要的作用，其中体内Ⅰ型胶原最为丰富，其次Ⅰ型胶原则为血管生成提供了良好的微环境，研究表明，Ⅰ型胶原可能通过胶原原纤维的GFPGER序列结合内皮细胞表面整合素α1β1和α2β2来刺激血管生成。内皮细胞能够通过基质金属蛋白酶降解和侵入胶原基质以促进血管网络形成，有利于组织修复[50]。胶原孔壁粗糙能使自身紧密黏附于创口处形成血痂，利于伤口愈合[51]，同时可刺激血小板进一步释放凝血因子，加速机体的内源性凝血机制，止血效果佳[28]。在伤口愈合过程中，壳聚糖解聚逐渐释放出N-乙酰氨基葡萄糖，它是真皮组织的重要组成部分，可促进成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白沉积，并刺激伤口上的透明质酸合成[52]。胶原蛋白在维持细胞外基质的生物和结构完整性方面发挥着主导作用[53]，胶原纤维及其网络是细胞外基质的主要成分，并形成了一个高度组织化的、围绕细胞的三维支架[54]。胶原蛋白与细胞表面蛋白结合，通过诱导成纤维细胞黏附和增殖发挥促进细胞生长的作用[55]；通过诱导成纤维细胞、巨噬细胞的趋化[56]，促进纤维结缔组织的形成，从而促进组织愈合[57]。
ZHANG等[58]将壳聚糖和胶原蛋白混合，证明壳聚糖-胶原海绵具有很好的促成纤维细胞增殖和血管新生的作用并对皮肤伤口愈合有较为显著的效果。为研究兼具抗菌效果的止血海绵，该课题组在此研究基础上，创新性地添加碳酸氢钠，缩短反应时间、提高孔隙率和吸水倍数、提高止血效果、增加了生物相容性和促进组织愈合效果。壳聚糖溶液与碳酸氢钠溶液反应后成胶时间最短、成胶更均匀、效果最佳且操作时间更短，降低了时间成本和经济成本。碳酸氢钠将溶液pH值调节至中性[59]，将壳聚糖溶液的pH值由5.8调整至7.35-7.45，使海绵具有良好的生物相容性且孔隙率及抗菌效果最佳，随着pH值的升高，壳聚糖链间氢键的物理连接会导致链缠结，随着CO2的释放，形成溶胶-凝胶过渡界面，形成孔隙率良好的三维聚合物网络的凝胶结构[60]。扫描电镜结果表明：碳酸氢钠的加入使得海绵孔壁变得粗糙，粗糙的海绵孔壁更有利于细胞黏附与生长，海绵孔径增大，空隙率增加，良好的孔隙率有利于海绵吸收血液膨胀填塞伤口、封闭创口以达到良好止血效果。因碳酸氢钠具有发泡作用，壳聚糖溶液与碳酸氢钠溶液反应后，能够增加材料的孔隙率、吸水倍数及降解率，同时止血实验表明，添加碳酸氢钠后，材料止血效果更好，止血时间及失血量大为减少。CCK-8结果及Live/Dead染色结果证明添加碳酸氢钠和胶原后，海绵能促进细胞生长增殖和黏附。大鼠皮肤组织切片染色结果证实添加碳酸氢钠和胶原后，海绵修复的皮肤组织角质层增厚且更加完整、纤维结缔组织均匀密集、有序排列，可见新生毛细血管及新生毛囊等皮肤附属器，表明壳聚糖/碳酸氢钠/
Ⅰ型胶原海绵能够有效促进组织修复。
目前的研究表明壳聚糖的抗菌机制在于：壳聚糖的多聚阳离子易与真菌细胞表面带负电荷的基团作用，从而改变病原菌细胞膜的流动性和通透性；干扰DNA的复制与转录；阻断病原菌代谢[21]。为更加明确材料的抗菌效果，研究选择革兰阴性菌及革兰阳性菌进行抗菌实验，并对材料进行性能优化，实验的抗菌实验结果显示壳聚糖海绵对照组抗大肠杆菌及抗金黄色葡萄球菌的抗菌率均是最佳，由于壳聚糖分子带有较强的正电荷，因此游离到培养基中的这些壳聚糖分子会与带负电荷的细胞膜之间产生较强的静电相互作用，从而破坏细胞膜的完整性，造成部分细胞死亡。壳聚糖呈酸性，细胞实验证实单纯的壳聚糖具有细胞毒性，因此通过添加碳酸氢钠，使得材料成胶效果最佳、pH值调节至中性以降低细胞毒性、增加海绵的孔隙率和吸水倍数以提高止血效果、缩短止血时间，通过添加胶原，能够抵消这种静电作用，促进细胞增殖，使得壳聚糖/碳酸氢钠/Ⅰ型胶原海绵既对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表现出良好的抗菌效果，又兼具良好的生物相容性、止血性及抗菌性，呈现出海绵的最佳综合效果。课题组在未来的研究中将会进一步负载生物活性因子及药物来修饰海绵，探索其在拔牙创愈合过程中的抗菌机制，使其更广泛应用于皮肤组织创口修复及拔牙术后创口填塞等领域。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

壳聚糖胶原海绵的抗菌止血性能

Antibacterial and hemostatic properties of chitosan collagen sponge

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