外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

doi:10.12307/2023.386

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2350-2355.doi: 10.12307/2023.386

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

陈頔1，2，薛钰2，汤郁1，费小明3，庄琴4，周雯雯2，吕德民2，史文涛2，张志坚2，郑文娟1，2，蒋宇1，2

江苏大学附属医院，1风湿免疫科，3血液科，4全科，江苏省镇江市 212001；2江苏大学医学院，江苏省镇江市 212000

收稿日期:2022-05-12 接受日期:2022-07-09 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-17
通讯作者: 汤郁，博士，主任医师，江苏大学附属医院风湿免疫科，江苏省镇江市 212001
作者简介:陈頔，女，1997年生，江苏省常州市人，汉族，江苏大学风湿免疫学在读硕士，医师。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81571582)，项目负责人：汤郁；江苏省社会发展重点项目-临床先进技术(BE2020681)，项目负责人：费小明

Ecto-mesenchymal stem cell-conditioned medium lyophilized powder combined with fibrin glue to repair skin injury in rats

Chen Di1, 2, Xue Yu2, Tang Yu1, Fei Xiaoming3, Zhuang Qin4, Zhou Wenwen2, Lyu Demin2, Shi Wentao2, Zhang Zhijian2, Zheng Wenjuan1, 2, Jiang Yu1, 2

1Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; 2Medical School, Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China; 3Department of Hematology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; 4Department of General Practice, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China

Received:2022-05-12 Accepted:2022-07-09 Online:2023-05-28 Published:2022-10-17
Contact: Tang Yu, MD, Chief physician, Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Chen Di, Master candidate, Physician, Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; Medical School, Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81571582 (to TY); Key Social Development Project of Jiangsu Province - Clinical Advanced Technology, No. BE2020681 (to FXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉：体外培养大鼠鼻黏膜来源外胚间充质干细胞，第3代细胞的培养基透析后冷冻干燥，易于保存和使用，尝试用于皮肤的损伤修复。
纤维蛋白：是来源于血液的细胞外基质，主要用于伤口止血，作为细胞移植和生长因子缓释的载体已取得令人满意的效果。

背景：近来多数研究将组织工程材料与干细胞或细胞因子复合来改善动物模型皮肤损伤。鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉可以长期保存，用于修复皮肤损伤具有独特的优势。
目的：观察外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤缺损的效果。
方法：体外培养SD大鼠鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞，第3代细胞的培养基透析后冷冻干燥制成冻干粉。将30只皮肤缺损SD大鼠按治疗方法分为3组(n=10)：损伤对照组，不接受特殊治疗作为对照；纤维蛋白胶组，局部应用纤维蛋白胶；条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组，局部应用含有外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉的纤维蛋白胶。治疗后动态观察创面愈合情况，测量创面面积，对皮肤组织切片进行苏木精-伊红染色和CK8、P63免疫组化染色。
结果与结论：条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面愈合速度高于纤维蛋白胶组和损伤对照组(P < 0.001)。条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面表皮和真皮在21 d全部再生修复；纤维蛋白胶组再生皮肤较薄；单纯创伤组皮肤再生不完全。在大鼠模型中，外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶联合使用可以促进损伤皮肤的伤口愈合。
https://orcid.org/0000-0002-8570-4423 (汤郁) ；https://orcid.org/0000-0002-5011-7050 (陈頔) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 皮肤损伤, 鼻黏膜, 外胚间充质干细胞, 条件培养基, 纤维蛋白胶, 伤口愈合

Abstract: BACKGROUND: Recently, most studies have combined tissue engineering materials with stem cells or factors to improve animal skin injury models. Ecto-mesenchymal stem cells derived from nasal mucosa can be preserved for a long time and has unique advantages in repairing skin damage.
OBJECTIVE: To observe the effect of ecto-mesenchymal stem cells-conditioned medium lyophilized powder combined with fibrin glue on the wound healing of skin defects in rats.
METHODS: Ecto-mesenchymal stem cells derived from Sprague-Dawley rat nasal mucosa were cultured in vitro, and the conditioned medium from passage 3 was collected and lyophilized. The 30 rat models of skin defects were divided into three groups according to treatment (n=10): the injury control group, received no specific treatment as control; the fibrin glue group, received topical application of fibrin glue; the combination group, received topical application of the fibrin glue contained ecto-mesenchymal stem cells-conditioned medium lyophilized powder. After treatments, the wound healing was observed dynamically and the wound area was measured. The tissue sections of the skin were stained with hematoxylin and eosin and subjected to immunohistochemical staining of cytokeratin-8 and protein-63.
RESULTS AND CONCLUSION: The wound healing rate of the combination group was higher than that of the fibrin glue group and the injury control group (P < 0.001). The staining of tissue sections showed that the epidermis and dermis of the combination group were all regenerated and repaired in 21 days; the regenerated skin in the fibrin glue group was thinner and the skin healing in the injury control group was incomplete. Ecto-mesenchymal stem cells-conditioned medium lyophilized powder in combination with fibrin glue can enhance wound healing of the injured skin in rat models.

Key words: skin injury, nasal mucosa, ecto-mesenchymal stem cell, conditioned medium, fibrin glue, wound healing

中图分类号:

陈頔, 薛钰, 汤郁, 费小明, 庄琴, 周雯雯, 吕德民, 史文涛, 张志坚, 郑文娟, 蒋宇. 外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2350-2355.

Chen Di, Xue Yu, Tang Yu, Fei Xiaoming, Zhuang Qin, Zhou Wenwen, Lyu Demin, Shi Wentao, Zhang Zhijian, Zheng Wenjuan, Jiang Yu. Ecto-mesenchymal stem cell-conditioned medium lyophilized powder combined with fibrin glue to repair skin injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2350-2355.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析参与EMSCs取材的SD大鼠约10只，参与皮肤缺损动物模型建立的SD大鼠有30只，中途无脱落。
2.2 创面愈合情况各组动物手术后伤口呈鲜红色，5 min后通常没有活动性出血。损伤对照组的创面呈鲜红色，然后血液凝固形成覆盖创面的血痂，随时间延长血痂逐渐变为深黑色，此组动物创面缩小最为缓慢，至21 d创面仍然未完全愈合。纤维蛋白胶组和EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组在手术后第1天可见创面覆盖有白色的纤维蛋白胶，此后白色的纤维蛋白胶逐渐固化，形成灰白色纤维蛋白膜紧密覆盖在创面上，随后，由于组织再生，各组的伤口面积逐渐减少，7 d以后纤维蛋白膜逐渐降解，膜下可见明显的再生皮肤开始从伤口边缘向创面中央生长，使得创面缩小，并取代纤维蛋白胶。3组创面愈合的速度顺序：EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组>纤维蛋白胶组>损伤对照组，见图1。

2.3 正常皮肤和创面再生皮肤的形态学比较正常皮肤和创面再生皮肤组织切片苏木精-伊红染色观察结果表明，EMSCs-CM
冻干粉与纤维蛋白胶联合使用可促进大鼠皮肤损伤后的愈合和再生。正常皮肤由完整的表皮和真皮组成，真皮内可见大量毛囊和皮脂腺，见图2A。与正常皮肤相比，损伤对照组皮肤再生不完全，再生表皮结构疏松，表面角化层不明显，真皮内可见大量炎性细胞，见图2B。纤维蛋白胶组伤口愈合的皮肤中可检测到表皮和真皮，但再生的皮肤很薄，真皮毛囊和皮脂腺稀疏，见图2C。EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组创面表皮和真皮在21 d内再生修复，新表皮较厚，分层明显，上皮表面有角质化，再生组织包括表皮、真皮、毛囊和皮脂腺，新皮肤与伤口周围的皮肤完全融合，没有明显的瘢痕，见图2D。

2.4 再生皮肤组织表皮角化蛋白CK8免疫组织化学染色结果角化蛋白CK8(棕黄色)主要定位于表皮和毛囊的近表面部分。正常皮肤表皮表面呈现波浪状，很多毛囊开口，表面有角质层；真皮内毛囊和皮脂腺密集分布，见图3A。损伤对照组再生的表皮(角化蛋白CK8阳性染色)薄，基底光滑，表面没有明显的角化层，见图3B。纤维蛋白胶组再生的表皮比损伤对照组厚，真皮中有少量浅表毛囊或皮脂腺，见图3C。EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组创面新生表皮较厚，其表面有角质层，真皮内有不同发育阶段毛囊和皮脂腺，见图3D。

2.5 再生皮肤组织P63免疫组织化学染色结果 P63主要通过免疫组化在表皮基底层以及毛囊和皮脂腺的干细胞核(棕黄色)中检测到。正常皮肤的表皮中较少检测到P63阳性细胞，见图4A，表明表皮已高度分化和成熟。P63阳性细胞主要位于毛囊和皮脂腺，毛囊内可见毛干深部的P63阳性细胞密集排列，此处为毛干的生长点。损伤对照组创面的再生表皮薄，基底部平整，P63阳性细少，表面无明显角化层。在再生皮肤与周边正常皮肤交界处真皮内可见少量残留的毛囊和皮脂腺，再生表皮下真皮内可见空洞(脓肿)和炎症细胞，见图4B。纤维蛋白胶组创面的再生表皮较薄，表皮的基底层P63阳性细较少。真皮内有少量新生的未发育成熟的毛囊，其深部有P63阳性细胞，见图4C。EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组创面新生表皮较厚，其表面有角质层。表皮的基底层可见密集分布的P63阳性细胞，说明此处表皮为未分化成熟的新生上皮组织。真皮内有成簇分布的毛囊和皮脂腺，此处可见P63阳性细胞，毛囊内未见毛干，表明毛囊和皮脂腺为再生组织，见图4D。
2.6 生物相容性术后没有发生与材料有关的不良反应。

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引言

皮肤是人体面积最大的器官，是机体抵御外界环境刺激和预防细菌感染的第一道防线。当出现大面积皮肤缺损时，不仅会导致局部渗出和液体流失，还会增加感染的风险。因此，立刻保护创面和促进创面修复，恢复皮肤的屏障功能，是治疗皮肤缺损的主要目的。传统型开放性皮肤创伤的常规治疗是皮肤移植，包括自体皮移植、同种异体皮移植和异种皮移植，其中异体皮移植可能会发生排斥反应，现已很少应用。尽管自体皮肤移植不存在排斥反应，但它会在供体区域造成新的伤口，这限制了其临床应用，尤其是对于有较大开放性皮肤伤口的个体。人造皮肤(不含细胞的生物材料类敷料)和组织工程化皮肤(含干细胞的生物材料敷料)移植虽然是一种很有优势的治疗方法，但由于前者往往只能临时覆盖保护创面，促进皮肤再生能力比较弱；后者仍处于开发阶段，尚未广泛用于临床治疗[1]。一种可能的解决方法是干细胞移植治疗。间充质干细胞能够通过有丝分裂进行自我更新，并分化成不同范围的特殊细胞类型[2]，能在体外有效扩增[3]，用于修复皮肤损伤具有很好的应用前景。但是供移植用的干细胞长期保存比较困难，限制了干细胞移植的推广应用。相对于活细胞，含有多种生物活性物质的干细胞条件培养基冻干粉可以长期保存，用于修复皮肤损伤具有独特的优势，干细胞分泌的多种蛋白质、肽、RNA和脂质介质，可以浓缩、冷冻甚至冻干而不会失去活性，这使它们比需要液氮储存和基础设施来解冻的细胞产品具有一定的优势[4]。
外胚层间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，
EMSCs)是一种来源于颅神经嵴的多能干细胞[5-6]，是间充质干细胞的一种特殊类型，可以从口腔、牙髓、呼吸道和嗅黏膜中获取。相比于间充质干细胞，黏膜中的EMSCs获取操作方便，对供体伤害较低[7]。EMSCs具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，能分化为表皮角质细胞、皮脂腺细胞和皮脂腺等类型[8-10]。
该研究基于前期已经取得的关于纤维蛋白胶的组织相容性和鼻黏膜来源的EMSCs生物学特性研究结果[11-12]。作者假设，由纤维蛋白原和EMSCs条件培养基(ecto-mesenchymal stem cells-conditioned medium，EMSCs-CM)冻干粉制成的复合水凝胶可能比单独使用纤维蛋白胶或EMSCs-CM更好地促进受伤皮肤的愈合。该实验采用大鼠皮肤缺损模型，评估了EMSCs-CM冻干粉与纤维蛋白胶复合水凝胶对大鼠皮肤缺损伤口愈合的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年6月在江苏大学医学院基础医学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雌性SD 大鼠40只，5周龄，体质量(100±10) g，由江苏大学实验动物中心提供，机构许可证号：SCXK(苏)2018-0012。所有动物实验方案均经江苏大学实验动物使用伦理委员会批准(审查编号：UJS-IACUC-AP-2020032539)并符合《实验动物护理和使用指南》。
1.3.2 主要试剂胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司；兔抗 CK8和P63抗体、小鼠抗β-actin抗体、羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP、免疫组织化学染色DAB显色染液、PVDF膜和ECL-Plus 发光剂均购自武汉博士德生物工程公司；胰蛋白酶、大鼠纤维蛋白原、凝血酶、谷氨酰胺转氨酶购自Sigma公司；抑肽酶购自上海生物工程公司。
1.4 实验方法

1.4.1 EMSCs培养按照实验室报道的方法培养EMSCs[13]。培养过程简述如下：通过腹腔注射戊巴比妥钠(200 mg/kg)深度麻醉SD大鼠(5周龄雌性SD大鼠10只，体质量120 g)，在无菌条件下沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤，暴露鼻中隔黏膜，取出鼻中隔置 PBS 中，剥离全层鼻黏膜，弃去鼻中隔软骨。鼻黏膜取出后用4 ℃无血清 DMEM/F12培养基漂洗3次后充分剪碎，置于37 ℃培养箱中胰酶消化15 min，1 000 r/min离心弃上清，将碎组织块接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基的密闭培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。待大部分组织块贴壁后将悬浮的组织块弃去，吸出培养基并补充新的培养基，每3 d换液1次，当细胞铺满瓶底80%时进行传代。

1.4.2 EMSCs-CM冻干粉的制备将第3代EMSCs种植于培养瓶，当细胞铺满瓶底80%时更换为无胎牛血清的DMEM/F12培养基培养24 h，收集EMSCs-CM，2 000 r/min离心去除细胞碎片，将培养基上清灌装入透析袋(孔径5 kD)，置超净台内，用4 ℃灭菌去离子水透析24 h，每8 h换水1次。透析袋内的培养基用真空冷冻干燥机-80 ℃冷冻干燥，冻干粉-20 ℃保存备用。
1.4.3 SD大鼠皮肤缺损动物模型的建立和术后处理用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉30只体质量约100 g的SD大鼠；备皮后，将动物放在超级清洁平台上，用碘伏对动物背部进行3次常规消毒，在消毒后的位置剪下1个直径为1 cm的圆形区域。将皮肤缺损大鼠随机分为3组：①损伤对照组，皮肤缺损创面未经处理。②纤维蛋白胶组，皮肤缺损创面用1 mL纤维蛋白凝胶(100 mg/mL)和200 μL凝血酶溶液(50 IU/mL)混合凝固纤维蛋白胶覆盖，然后用10 μL谷氨酰胺转氨酶(0.1 U/mL)局部交联凝胶中的蛋白质分子，最后局部使用10 μL抑肽酶(100 mg/mL)来延缓纤维蛋白降解。③EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组，皮肤缺损创面用含EMSCs-CM冻干粉(100∶1)的纤维蛋白凝胶(100 mg/mL)1 mL和200 μL凝血酶溶液(50 IU/mL)混合包埋，其余步骤与纤维蛋白胶组相同。每天拍照，记录伤口感染、红肿和愈合情况，详细记录动物的生理状况(饮食和活动等)。
1.5 主要观察指标
1.5.1 动物创面的面积在损伤后3，7，10，14 d用软尺测量伤口面积并计算伤口愈合率=(原始缺损面积-残余创口面积)/原始缺损面积×100%。
1.5.2 创面再生皮肤的组织学观察损伤21 d后通过腹腔注射戊巴比妥钠(200 mg/kg)对动物进行深度麻醉。从原始伤口中心取出直径为1.5 cm的圆形伤口皮肤及其周围正常皮肤，放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定。
(1)苏木精-伊红染色：将固定于40 g/L多聚甲醛溶液中的皮肤组织取出，进行石蜡包埋，将皮肤组织蜡块用切片机沿其直径面(包括表皮和真皮)平行切片(厚5 μm)，用载玻片贴片后进行苏木精-伊红染色，二甲苯脱蜡(直径面向下直立放置)。经梯度乙醇脱水，苏木精复染，PBS冲洗，盐酸乙醇分化，50 ℃水浴5 min．放置于伊红液中，染色切片经脱水、透明、封固后用显微镜观察皮肤缺损创面的修复情况。
(2)免疫组织化学染色：上述石蜡切片按照以下步骤进行免疫组织化学染色：用二甲苯对上述组织切片脱蜡，梯度乙醇脱水；用体积分数3% H2O2封闭液37 ℃孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶；PBS漂洗5 min×3次；将切片浸入枸橼酸抗原修复液(pH 6.0)内，放置在微波炉中，先后以80%和40%的火力各加热5 min，进行抗原修复；在室温下等其自然冷却，取出切片平放在湿盒中，滴加复合消化酶完全覆盖组织，37 ℃孵育15 min，PBS漂洗5 min×3次；用体积分数20%正常羊血清封闭液室温孵育15 min，用滤纸吸去多余封闭液(勿漂洗)；分别滴加兔抗CK8和P63抗体，置于冰箱内，4 ℃孵育过夜；切片浸入PBS中放在摇床上轻轻振荡漂洗15 min×3次；擦干组织周围液体，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温下孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，轻轻振荡切片；擦干组织周围液体，用DAB/ H2O2显色染液显色，显微镜下控制显色时间(4-10 min)，显色后用自来水充分漂洗；苏木素复染，常规递升梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；用显微镜观察皮肤缺损创面再生皮肤内CK8和P63的表达强度和分布情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(Oneway Anova)，组间两两比较用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经江苏大学生物统计学专家审核。

讨论

皮肤是人体最大的器官，它提供了一个与外部环境隔绝的保护屏障，防止脱水。当大面积皮肤缺损时，机体不能保持正常的自稳状态，可能会导致毁灭性的并发症，甚至死亡，因此需要尽早覆盖创面，恢复皮肤的屏障功能。组织工程皮肤替代品是传统伤口愈合策略和组织再生的一种有前景的替代品[14]。目前，商业皮肤替代品存在一些限制，如血管化减少、机械完整性差、整合失败、瘢痕形成和免疫排斥[15]。因此，寻找一种更好的皮肤替代物来修复皮肤缺损，如烧伤、外科创伤、糖尿病皮肤溃疡，是非常有意义的。
间充质干细胞已成为各种再生和治疗应用有前景的候选细胞。研究表明，在狗皮肤创伤模型中，应用同种异体间充质干细胞可以促进旁分泌介导的细胞增殖和皮肤血管生成[16]。
然而异体细胞的应用仍会引起机体免疫。规避同种异体间充质干细胞免疫原性的解决方案之一是使用无细胞条件培养基代替间充质干细胞。为了研究间充质干细胞条件培养基的可行性和有效性，JOSEPH等[17]在豚鼠模型中研究了骨髓来源间充质干细胞条件培养基在切除伤口愈合中的作用，发现它既可以用于异体，也可以用于异种，用于高质量的伤口愈合。这种治疗策略被认为是骨髓间充质干细胞发挥的旁分泌效应[18]，这些旁分泌蛋白在条件培养基中包括生长因子、趋化因子和细胞外基质[19]。此外，包括外泌体在内的囊泡是条件培养基中的生物活性成分。然而，获取骨髓样本并不容易，而且不能重复获取。除了骨髓，间充质干细胞也可以从其他组织中分离培养。据报道，EMSCs广泛分布于鼻腔上、下鼻甲固有层，并能在培养中迅速扩增[20]。在该研究中，大鼠鼻固有层来源EMSCs用于条件培养基的获取。为了改善EMSCs-CM对大鼠皮肤缺损创面愈合的影响，将EMSCs-CM冻干粉与纤维蛋白胶混合，然后通过谷氨酰胺转氨酶将条件培养基冻干粉中的生物活性蛋白交联到复合水凝胶中的纤维蛋白上。实验结果表明，EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组再生的皮肤在形态学和组织学上更接近于正常皮肤，未发现排斥反应的迹象，提示用EMSCS-CM冻干粉和纤维蛋白胶构建的复合水凝胶能有效促进大鼠皮肤损伤创面愈合。在该研究中，EMSCS-CM冻干粉是由液体介质通过透析和冷冻干燥制成的。冻干粉比液体条件培养基更易于保存和使用，因此在治疗皮肤损伤方面更具前景。
间充质干细胞促进皮肤再生的机制是多方面的。首先，它可以以旁分泌的方式发挥作用，据报道这些可溶性因子包括血管内皮生长因子、转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子1等[17]；其次，EMSCs对炎症损伤的抑制作用强于骨髓间充质干细胞[21]。条件培养基还含有间充质干细胞衍生的外泌体，据报道可刺激成纤维细胞和角质形成细胞的增殖、迁移和分化，从而促进受损皮肤的再生和功能恢复[22]。在这些细胞外小泡中可以检测到具有生物活性的脂质、蛋白质和核酸，它们可能在组织再生中发挥多种作用[23]。
纤维蛋白胶是一种从血浆中提取的复合生物黏合剂，现已批准用于临床用途的商业产品，主要用于伤口止血[24]。已有研究数据表明，纤维蛋白除了具有止血作用外，由于其属于细胞外基质的一种，含有RGD序列，可促进细胞黏附、增殖、迁移和分化[25]。该研究在纤维蛋白凝胶制作时，将EMSCs-CM冻干粉与纤维蛋白原冻干粉按一定比例混合并溶解，然后加入凝血酶将纤维蛋白原溶液转化为纤维蛋白凝胶。在凝胶形成过程中加入谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺转氨酶是一种用于偶联两类包含赖氨酸或谷氨酰胺的蛋白质聚合物，具有用于酶交联的识别底物，沿着蛋白质骨架均匀分布，具有交联作用[26]。将凝胶中的蛋白质分子与条件培养基冻干粉中的旁分泌因子交联，以实现缓慢和持续的释放效果。该研究中，在纤维蛋白凝胶中加入谷氨酰胺转氨酶可能有助于提高复合凝胶的功效。除了谷氨酰胺转氨酶，还添加了抑肽酶延缓纤维蛋白的降解。由于纤维蛋白具有多孔网络结构，并含有大量水分，因此有利于局部生长因子释放和物质交换。水凝胶敷料还可以有效防止细菌感染，这比商业膜更有利于促进烧伤创面愈合[27]。
皮肤创伤愈合包括表皮愈合和真皮组织再生2个方面。以前人们认为皮肤的组织结构和功能相对简单，因此很少关注皮肤组织的完全再生和功能的恢复[28]。在该研究中，皮肤组织学观察结果显示，EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组形成的新表皮较厚，具有明显的角化复层鳞状上皮，再生组织包括表皮、真皮、毛囊和皮脂腺，提示此组动物再生的皮肤更接近正常皮肤的结构。
角化蛋白CK8是一种简单上皮细胞的初级角蛋白，是体内单层片状组织细胞内细胞骨架的组成部分，主要定位于表皮和毛囊表面附近[29-30]，作为中间丝蛋白家族的成员，在外屏障组织的多层鳞状上皮中，角蛋白的结构细胞增强功能是无可争辩的，可以保护内部上皮细胞免受更广泛的应力，包括渗透压力和化学毒性[31]。表皮干细胞标志蛋白P63是P53蛋白家族的成员，主要位于表皮基底层和毛囊及皮脂腺的基底部干细胞的细胞核内，对于维持上皮发育和形态发生至关重要，p63缺陷小鼠的皮肤没有经过早期发育阶段：缺乏分层，不表达分化标记[32-33]。在该研究中，采用免疫组织化学染色检测P63和CK8在再生组织及其周围皮肤组织中的分布，结果显示，EMSCs-CM冻干粉复合纤维蛋白胶组伤口修复也显著优于其他2组，这表明含有EMSCs-CM冻干粉的纤维蛋白胶可能通过促进表皮干细胞的增殖和分化来促进皮肤修复。
综上所述，局部应用EMSCs-CM冻干粉和纤维蛋白复合水凝胶可以有效促进表皮干细胞的增殖和分化，加速表皮的再生，新再生的皮肤在组织学上也与正常皮肤结构相似。此外，EMSCs-CM冻干粉不含任何细胞成分，且易于收集、保存，无排斥反应。该生物活性复合水凝胶在烧伤、外科创伤、糖尿病性皮肤溃疡等皮肤缺损修复中具有良好的开发和应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

Ecto-mesenchymal stem cell-conditioned medium lyophilized powder combined with fibrin glue to repair skin injury in rats

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