2.1   共培养体系的组成
2.1.1   细胞主体   目前用于构建牙髓再生组织工程共培养体系的细胞主体为口腔来源的间充质干细胞，如牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞和根尖牙乳头干细胞等。牙源性间充质干细胞在体内和体外均具有牙髓组织再生能力，而且具有易获取、易培养的优点，无论是牙髓组织再生领域还是口腔外组织再生均有广泛运用，但由于单一细胞的生成组织的结构与功能与天然组织有差异，因此，引入其他细胞共同培养能提供更好的细胞微环境[4]。
2.1.2   组合细胞   组合细胞的来源主要包括终末分化成熟的成体细胞，如人脐静脉内皮细胞；成体干/祖细胞，如间充质干细胞和内皮祖细胞；胚胎干细胞；诱导多能干细胞。组合细胞要求具有一定的调控增殖分化能力，并且本身细胞源容易获取或可以在细胞主体和组合细胞的相互作用下可分化为组织必需的结构。体外构建细胞共培养系统的方式通过引入组合细胞，可更好地模拟体内细胞生长环境，研究细胞间及细胞与环境之间的相互作用和信号通路[5]。
牙髓再生组织工程中的细胞共培养组合类型众多，多数为牙源性干细胞和内皮细胞共培养，其中牙髓干细胞和人脐静脉内皮细胞联合培养体系应用最为广泛[6]。已知内皮细胞和牙源性干细胞可分泌一系列有利于细胞生长和分化的生长因子，当二者进行共培养时，一方面内皮细胞提供的细胞外基质环境可以促进牙源性干细胞的增殖及分化能力，另一方面，牙源性干细胞作为周细胞样细胞，可为内皮细胞的血管化提供局部微环境，增强新生血管的稳定性[7-9]。
2.2   共培养体系的模型和维度   细胞共培养根据模型一般可分为直接接触共培养、间接接触共培养，而根据形成组织的维度，又可分为二维细胞培养和三维细胞共培养，二者可交叉使用，如直接接触的二维细胞培养等，见图3。目前牙髓再生的共培养模型多为间接接触的二维细胞培养。



2.2.1   直接接触培养   是指将不同细胞放在同一培养体系中，细胞之间直接接触。直接接触共培养中细胞主体和组合细胞间通过细胞外基质或细胞接触相互通信，既促进细胞主体形成目标组织，又使组合细胞形成目标组织必须的周围支持组织，从而实现组织再生。DISSANAYAKA等[10]研究发现将牙髓干细胞与人脐静脉内皮细胞进行直接共培养，可提高牙髓干细胞成牙/成骨潜能和人脐静脉内皮细胞的血管生成能力。
直接接触共培养可形成有整体性的组织，但是也有其短板：因为细胞处于同种环境，无法完全区分不同种细胞分泌的生长因子等物质，无法对相互作用的机制进行更深入的研究。由于培养手段的影响，若无生物支架介入，形成的再生组织则无生理性组织的三维结构，同时直接接触培养体系中不同细胞的接种比例对组织再生的结局有决定性影响[11]。
2.2.2   间接接触培养   是将不同细胞置于同一培养体系中，但不同细胞之间无直接接触，如嵌入式细胞共培养(Transwell小室)、细胞衍生物共培养等，细胞之间通过旁分泌途径产生单向作用或相互作用，从而促进组织再生。MERCKX等[12]通过向牙髓干细胞培养基中添加骨髓间充质干细胞的条件培养基以及细胞外小囊泡，构建了牙髓干细胞-骨髓间充质干细胞间接共培养体系，发现牙髓干细胞的组织再生能力不但有所增强，还可向内皮损伤部位迁移。
相比直接接触培养，间接接触培养不但可以准确说明细胞间通讯作用机制的影响，同时还可以对细胞的趋化、迁移能力进行观察，而细胞衍生物共培养作为一种脱细胞介入手段可以避免免疫排异反应并提高干细胞的利用率，与此同时，对如细胞条件培养基、细胞外囊泡等细胞衍生物的分离、成分分析以及作用机制也成为研究热点之一。但是由于细胞间无直接接触，无法分析细胞直接接触产生的细胞通讯作用，也无法分析复杂组织中细胞外基质介导的细胞间信号传递。
2.2.3   三维细胞共培养   三维细胞共培养即将细胞接种于具有三维结构的生物支架材料上或细胞三维成团培养，为细胞提供近似于体内的生长环境，其优点是能最大限度地有序还原组织原有形态，缺点则是生物支架材料和三维成团培养的成本和技术敏感性过高，并且研究者还在进一步探索最优材料。
安莉等[13]将牙髓干细胞和人脐静脉内皮细胞接种于基质胶上，并且在共培养体系中加入肿瘤坏死因子α，结果表明肿瘤坏死因子α可促进共培养系统体外成血管能力，同时在共培养体系中，牙髓干细胞可分泌血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子及血小板衍生生长因子等多种促血管生长因子，促进内皮细胞的存活和分化；人脐静脉内皮细胞同样分泌信号分子和趋化因子来影响牙髓干细胞的生长和分化能力。体内实验包括免疫缺陷小鼠皮下移植和组织工程牙齿种植。HONDA等[14]将间充质细胞和人口腔上皮细胞以1∶1比例接种于胶原蛋白海绵上，并将其移植到裸鼠皮下，最终发现这种细胞接种技术可以有效地调控再生牙的形态。LIU等[15]将牙周膜干细胞和牙髓干细胞接种到体外制备的羟基磷灰石-磷酸三钙支架材料(HA/TCP)上，将其移入生物根并种植于小型猪的下颌骨中，6个月后观察到牙根样结构和牙本质样结构形成。
2.3   牙髓再生组织工程共培养体系的培养条件   细胞共培养的条件包括：细胞的接种密度与比例、培养基的选择、培养时间和干预因素等。如安莉等[13]还在实验过程中发现的共培养体系中以1∶5的比例进行共培养，其血管的形成优于其他实验组且结构最为稳定，2种细胞的比例是共培养结果的关键，不同比例下细胞之间的交流产生不同的实验效应。
除了细胞主体及组合细胞的选择、共培养体系的选择外，细胞共培养体系的培养条件对组织再生结局也有重要影响[16-21]，详见表1。



2.4   生物支架材料的应用   牙髓再生中三维支架材料的应用不仅能为细胞提供黏附、增殖和迁移的场所，还有构建组织三维结构的功能以及通过不同材料特性达到控释细胞因子的作用，有助于细胞的成血管化和成牙本质分化[22]。常用的支架材料可分为天然材料、人工合成材料和复合材料。天然材料是指由动植物组织中提取的高分子可降解材料，具有良好的生物相容性，如胶原、水凝胶和脱细胞支架等。人工合成材料主要包括聚乳酸、聚乙醇酸等，无机材料主要以钙盐为基础，如羟基磷灰石和聚磷酸钙等。由于任何单一支架材料均难以满足牙髓组织对生长环境的要求，而复合材料是将天然材料与人工合成材料结合，以此不同材料的特点和优势来实现某些特定的功能，已成为目前组织工程生物支架材料研究的热点[23-24]。在牙髓再生研究中首次应用支架材料，是由YOUNG等[25]将牙髓单细胞悬液接种在聚乳酸-聚乙醇酸支架上，将其移植到免疫缺陷大鼠宿主体内生长20-30周后，观察到牙齿结构的形成。目前多数用于牙髓再生研究的材料都具有一定的可塑性和流动性，以适应根管的解剖形态[26]，前文所提DISSANAYAKA等[27-28]采用琼脂糖微模具制备牙髓干细胞-人脐带血管内皮细胞共培养的三维微组织球体，结果发现经过预血管化的组织可形成更为稳定的毛细血管结构，在体内体外都表现出更高的骨/牙源性基因表达水平和矿化水平。
3D打印生物材料已在组织工程学中广泛运用，其高个性化、便捷、可设计等性能为未来的组织工程再生提供诸多可能性。随着材料技术发展，3D打印已可以涉猎水凝胶一类形变能力极强、能适应不同解剖结构的材料，因而3D打印生物支架逐步进入到牙髓再生领域中[29-30]，因此3D打印生物材料在近5年也在不同研究中发挥着诱导细胞形成三维组织形态、促进细胞增殖分化的重要作用[31-37]，见表2。



2.5   牙髓再生组织工程共培养体系的作用机制   细胞之间的交互作用通过以下3种机制实现：①细胞表面分子的直接接触；②邻近细胞间的缝隙连接；③分泌到细胞外环境中的信号分子与目标细胞的特异受体相互作用：细胞之间释放扩散性分泌因子，如细胞因子、生长因子等[38-39]。无论是细胞表面分子的直接接触还是缝隙连接，由于细胞间有直接接触且细胞交流时不向外分泌信号分子等介质，可将二者归类为细胞间的直接通讯，故文章根据细胞间的直接作用和间接作用展开阐述牙髓再生组织工程共培养体系中的细胞交互机制。
2.5.1   共培养细胞间的直接作用   细胞表面分子的直接接触多见于免疫反应中的抗原呈递过程，在共培养中细胞主体与组合细胞间鲜有涉及。而缝隙连接是一种细胞间直接通讯方式，相邻细胞间通过细胞膜上的连接子相互锚定，允许相对分子质量小于
1 500的离子、小分子代谢物 (如氨基酸、核苷酸、维生素和糖类等)及第二信使(如cAMP，Ca2+，IP3)通过[40-41]。缝隙连接蛋白(connexin，Cx)是构成缝隙连接的基本单位，在哺乳动物体内分布广泛。牙髓组织中主要表达Cx26，Cx32和Cx43[42-43]，成骨细胞的主要连接蛋白为Cx43[44]，内皮细胞为Cx37，Cx40和Cx4[45]。在牙髓再生组织工程共培养体系中关于细胞间直接通讯作用的研究较少，但在其他学科领域的细胞共培养体系中，细胞间的信号通讯作用主要通过Cx43介导实现，如成骨细胞与血管内皮细胞[46]、单核细胞与内皮细胞[47-48]。同样地，亦有研究表明成牙本质细胞间的缝隙连接是由Cx43所介导的[49]，LI等[50]研究发现牙髓干细胞通过Cx43介导的Ca2+在细胞间相互交流，促进牙本质涎磷蛋白的表达和成牙分化。因此在牙髓再生共培养体系中，细胞间的直接作用很有可能是通过Cx43介导实现，但仍需更多证据支持。
2.5.2   共培养细胞间的间接作用   共培养体系中细胞之间通过分泌到细胞外环境中的信号分子与目标细胞的特异受体相互作用，即通过旁分泌/自分泌的生长因子/细胞因子发挥间接接触作用[51-66]。
健康牙髓由血管、神经和胶原纤维等部分组成，对于牙髓再生组织工程而言，需要形成与之形态功能相似的牙髓样组织。在此过程中，不同方向的分化与组织形成具有不同机制，其中成血管是牙髓组织再生的关键，健康组织中血管提供细胞和组织生命活动所必须的营养物质，而在组织再生相关组织工程研究中，血管不仅是物质运输的通道，还是富含趋化因子的细胞归巢支架，同时还承担血管化骨再生的功能[51]，因此文章主要对牙髓再生中成血管机制进行总结，见表3。
IWAYA等[52]在2001年的病例报道中首次引用牙髓血运重建这一概念，而与此同时血管内皮生长因子的发现改变了研究者对血管生成和发育过程中血管生成以及生理稳态的理解[53]，在牙髓再生过程中，血管内皮生长因子通过与细胞膜上的受体结合，发生一系列的生理过程从而影响细胞增殖、新生血管生成，具体过程如下：血管内皮生长因子A与细胞膜上的受体及跨膜蛋白结合，受体自身磷酸化或二聚化，经过胞内一系列底物及蛋白的活化水解，引起信号级联反应，使细胞大量钙离子通道开放，引发钙内流，进而释放一氧化氮和前列腺素，从而调节血管的生成[54-56]。在牙髓干细胞-人脐静脉内皮细胞共培养体系中，肿瘤坏死因子α和脂多糖可激活血管内皮生长因子-SIRT1信号通路，并激活下游核转录因子κB信号从而增强人脐静脉内皮细胞和牙髓干细胞的迁移能力和新形成血管结构的稳定性[57]。此外，其他的研究表明血管内皮生长因子调节血管生成还有可能与PI3K/AKT信号通路以及MEK1/2/ERK1/2信号通路[58]。随着细胞间交流关键生物因子的提纯以及信号通路的发现，研究者揭示了越来越多与牙髓再生成血管相关的关键因子以及被关键因子激活的信号通路，且时至今日牙髓再生的成血管机制依旧是研究热点。

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[10]	袁 博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[11]	秦宇星, 任前贵, 李子龙, 全嘉星, 沈佩锋, 孙 韬, 王浩宇. 骨微血管内皮细胞在股骨头坏死中的作用机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 955-961.
[12]	许其静, 杨伊春, 雷 微, 杨 莹, 余 江, 夏婷婷, 张 萌, 章 涛, 张 潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[13]	熊波涵, 余 洋, 卢晓君, 王 旭, 杨腾云, 张瑶璋, 廖欣宇, 周晓翔, 何 璐, 李彦林. 促进前交叉韧带重建腱骨愈合的研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 779-786.
[14]	张 敏, 张晓明, 刘童斌. 柚皮苷在骨组织再生领域的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 787-792.
[15]	宗明锐, 刘海燕, 李 冰, 武秀萍. 羧甲基壳聚糖在口腔组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 447-452.

体外诱导干细胞并为其提供牙髓再生所需的生长因子和生物支架，使之形成牙髓三维组织结构，移植到体内保证其存活并成功行使功能，是理想的牙髓再生治疗方法。目前主要使用牙髓干细胞进行牙髓再生的相关研究[1]。牙髓干细胞由Gronthos等[2]首次发现并分离，源自外胚层间充质，具有自我更新能力、多向分化能力和克隆形成能力，将其移植到免疫功能低下的小鼠体内，可在体内产生牙髓样组织，因此被认为是牙髓再生组织工程的种子细胞。
目前，大多数学者在实验中采用牙髓干细胞单细胞培养模型以建立牙髓再生体系，但牙髓干细胞很难在短时间内增殖达到牙髓再生所需的细胞量，且单细胞培养模型不足以模拟组织生长发育的微环境[3]。为解决以上问题，研究者将口腔来源的干细胞与其他类型细胞进行共培养，再引入生物支架、三维培养等组织工程学手段，以便更好地模拟细胞在组织形成和再生过程中的微环境。尽管前人对共培养体系有过综述，但内容并未精准涉及牙髓再生，也鲜少总结通过不同共培养手段构建的再生组织有何区别。
文章通过广泛查阅国内外牙髓再生组织工程中共培养研究的相关文献，并对共培养细胞的选择、培养模型和维度、培养条件以及细胞共培养的作用机制和应用进展等方面进行综述[3-4]。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2021年5-10月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   各数据库建库至2021年5月发表的关于牙髓再生组织工程中细胞共培养的相关文献。 
1.1.3   检索数据库   PubMed、中国知网和万方数据库。
1.1.4   检索词   英文检索词为“dental pulp regeneration，dental pulp stem cell，co-culture，tissue engineering，signaling pathway”；中文检索词为“牙髓再生、牙髓干细胞、共培养、组织工程、支架、信号通路”。
1.1.5   检索文献类型   研究原著和综述。
1.1.6   手工检索情况   无。

1.1.7   检索策略   以中国知网数据库检索策略为例，见图1。

1.1.8   检索文献量   初检得到954篇文献，其中英文文献720篇，中文文献221篇。
1.2   入组标准
1.2.1   纳入标准   ①文章的题目和摘要与主题词相关；②文章的内容与共培养、牙髓再生相关度高；③文献内容具有科学性、实时性和真实性，在同行专家认可的杂志上发表。
1.2.2   排除标准   ①与主题相关度较低、质量较低的文献；②重复性研究。
1.3   文献质量评估与数据的提取   通过阅读文题和摘要进行初步筛选，排除与研究内容无关、重复且设计不合理的文章，最后纳入67篇文献进行归纳总结，其中英文文献61篇，中文文献6篇，见图2。

3.1   既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题   对于牙髓再生来说，现有研究手段是基于组织工程3大要素进行的：干细胞、生长因子和生物支架，其中的关键在于：获取来源丰富且具有成牙/成血管潜能的种子细胞，使其在适宜的微环境下发育、分化，最终实现牙髓组织再生。学者们通过体外构建细胞共培养体系进行牙髓组织再生研究，不仅克服了单一细胞来源不足、体外扩增周期长的问题，而且在更大程度上模拟了体内生长环境，有助于研究细胞间相互作用和细胞与环境之间信号分子的作用过程，在结果上可观察到不同程度的牙体组织结构和血管再生。
目前牙髓再生的相关研究虽有一定的突破进展，其中仍有许多悬而未决的问题亟待探索和研究：例如细胞体内生长环境的模拟、共培养条件的优化、支架材料的仿生设计、血管再生相关机制及各因子细胞间的相互联系等，这些都是未来临床转化研究的关键和热点。另外，真正意义上的牙髓组织再生应包括：①成功的血管化组织；②与天然牙髓相似的细胞密度和细胞外基质结构；③再生的成牙本质细胞层及牙本质；④可行使功能的牙髓神经[67]。目前所涉及的体内外实验对全组织的再生仅限于血管样结构、牙髓牙本质样结构等具有与牙髓组织结构相似、但无法行使对应生物学功能的组织，因此从组织功能再生角度方面考虑，将仅仅生成部分牙体、牙髓组织或只构建相应组织结构却不能行使相应组织功能的牙髓组织再生工程实验称为“实现牙髓组织再生”，略有失偏颇。
3.2   该综述区别于他人他篇的特点   该综述从组织工程学角度出发，从细胞组成、培养方式及介入因素(生长因子和生物支架等)3个方面详细介绍了共培养体系的组成及其在牙髓再生中的研究现状，文章与其他综述不同的特点在于：在介绍研究现状的同时将不同的再生组织结局联系在一起，更直观地展现出相同细胞在不同组合、不同处理方式下会形成不同形态组织。
3.3   综述的局限性   该综述也存在一些局限性：①因为文献检索时纳入排除的标准不同而出现偏倚，导致对研究现状认知有部分误差；②由于是综述性文章，创新性、时效性不足难以避免；③文章为全面介绍共培养体系的宏观概念，将部分研究热点内容归于更大的概念范围而不展开细节论述，如将细胞外囊泡归为间接培养中；④文章主要重点在于介绍共培养体系的应用，因而在作用机制方面论述深度不足。
3.4   综述的意义   作者经过综合查阅和层层筛选，最终将具有时效性、权威性和创新性的文章纳入并进行整合讨论，作者对领域内的研究内容展开详略得当的论述，不但能为相关领域研究者节约大量时间，还能使有意向涉足该领域的研究者们对其有宏观理解。
3.5   课题组专家对未来的建议   经过对牙髓再生共培养进行论述后，文章发现如何在体外真正模拟牙髓生长环境、如何实现牙髓神经再生、如何合成具有与正常牙髓相似解剖结构的牙髓牙本质复合体并使其行使营养、支持、防御和再生的生理功能是当前牙髓再生研究的重难点，未来需要投入更多的精力进行研究。因此，实现牙髓再生并最终应用于临床，还需要进一步深入地探索。  
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：#br# 牙髓再生：不同于传统根管治疗中去除感染牙髓并用牙胶尖充填根管，牙髓再生利用干细胞的增殖、分化和迁徙能力，通过支架材料、生物因子等诱导使干细胞定植于牙髓腔内并再生为具有与健康牙髓相同生理功能和生物学结构的新生牙髓组织。#br# 共培养体系：将主体细胞与组合细胞置于同一培养体系中，通过直接或间接的细胞交流，组合细胞为主体细胞提供适宜增殖分化的微环境，从而实现诱导细胞定向分化、提高细胞增殖分化能力和组织形成与健康组织相似生物学结构的目的。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

体外诱导干细胞并为其提供牙髓再生所需的生长因子和生物支架，使之形成牙髓三维组织结构，移植到体内保证其存活并成功行使功能，是理想的牙髓再生治疗方法。目前主要使用牙髓干细胞进行牙髓再生的相关研究。牙髓干细胞由Gronthos首次发现并分离，源自外胚层间充质，具有自我更新能力、多向分化能力和克隆形成能力，将其移植到免疫功能低下的小鼠体内，可在体内产生牙髓样组织，因此被认为是牙髓再生组织工程的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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