转录因子配对盒基因6对骨髓间充干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化的影响

doi:10.12307/2022.566

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3858-3864.doi: 10.12307/2022.566

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转录因子配对盒基因6对骨髓间充干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化的影响

吴霜，邹星星，高杰，胡蓉，苏敏

贵州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，贵州省贵阳市 550025

收稿日期:2020-11-14 接受日期:2021-02-27 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-22
通讯作者: 苏敏，博士，教授，贵州医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，贵州省贵阳市 550025
作者简介:吴霜，女，1989年生，贵州省贵阳市人，汉族，2022年贵州医科大学毕业，硕士，主要从事干细胞基础与临床研究。
基金资助:
贵州省科技支撑项目(黔科合支撑[2020]4Y230号)，项目负责人：苏敏；贵州科技厅人才平台计划(黔科合平台人才[2020]4103号)，项目负责人：苏敏；贵州省科学技术项目(黔科合基础[2020]1Y408)，项目负责人：高杰；贵州省科技厅学术新苗培养项目(黔科合平台人才[2018]5779-21)，项目负责人：高杰；贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2018]201)，项目负责人：高杰

Effect of paired box gene 6 protein on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into keratolimbal stem cell-like cells

Wu Shuang, Zou Xingxing, Gao Jie, Hu Rong, Su Min

Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China

Received:2020-11-14 Accepted:2021-02-27 Online:2022-08-28 Published:2022-01-22
Contact: Su Min, MD, Professor, Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
About author:Wu Shuang, Master, Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
Guizhou Science and Technology Support Project, No. [2020]4Y230 (to SM); Talent Platform Program of Guizhou Science and Technology Department, No. [2020]4103 (to SM); Guizhou Science and Technology Project, No. [2020]1Y408) (to GJ); Academic New Seedling Training Project of Guizhou Provincial Science and Technology Department, No. [2018]5779-21) (to GJ); Youth Science and Technology Talent Growth Project of Guizhou Education Department, No. KY[2018]201 (to GJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
配对盒基因6：在脊椎动物眼睛发育过程中是必不可少的，在人类怀孕的第5周，配对盒基因6存在于视网膜的神经层和色素层，也在来自表面外胚层的前段结构中高度表达，包括晶状体囊泡和角膜上皮。出生后，配对盒基因6仅限于视网膜神经节、无长突细胞和水平细胞、晶状体、角膜、结膜、虹膜和睫状体。
角膜缘干细胞：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，具有不断增殖分化和向心性移动的能力，能够修复替代衰老死亡的角膜上皮细胞，在角膜上皮的更新和角膜疾病的治疗中起着不可替代的作用，其属于单能干细胞，在角膜损伤修复中发挥重要作用。

背景：角膜病移植手术面临着角膜供者严重缺乏、术后发生免疫排异反应等诸多问题。在大力倡导角膜捐献的同时，急需找到一种新的替代性的治疗手段。
目的：通过优化骨髓间充质干细胞培养条件，探讨转录因子配对盒基因6对骨髓间充质干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化的影响。
方法：根据细胞形态、成骨成脂分化能力、细胞表面抗原表达鉴定骨髓间充质干细胞及过表达配对盒基因6的骨髓间充质干细胞。按照培养细胞和培养基不同进行分组：对照组(骨髓间充质干细胞+完全培养基)、实验组A(骨髓间充质干细胞+条件培养基)、实验组B(骨髓间充质干细胞+条件培养基+细胞因子)、实验组C(过表达配对盒基因6的骨髓间充质干细胞+条件培养基+细胞因子)。诱导5，10 d时采用免疫荧光、流式细胞术检测p63、k14和k12的表达，流式细胞术检测细胞增殖指标Ki-67的表达和细胞凋亡率，Western blot法和RT-PCR法检测配对盒基因6的蛋白和mRNA表达。
结果与结论：①诱导培养前，两组细胞均具有骨髓间充质干细胞的特性。②诱导培养后，均出现球型或卵圆形的细胞，呈悬浮生长。4组细胞的角膜缘干细胞样细胞特异性分子p63、k14表达阳性，实验组荧光表达量高于对照组(P < 0.05)，而角膜上皮分子k12表达阴性。随着培养条件的优化，实验组C的细胞增殖更明显，凋亡细胞更少。诱导5 d时，实验各组配对盒基因6的蛋白及mRNA表达量呈递增变化。③结果表明，条件培养基联合细胞因子诱导可加快骨髓间充质干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化。过表达配对盒基因6的骨髓间充质干细胞向角膜缘干细胞样细胞定向分化的速度和比例更具有优越性，且其能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。
缩略语：骨髓间充质干细胞：bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs；角膜缘干细胞：limbal stem cells，LSCs

https://orcid.org/0000-0001-9867-9952 (吴霜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充干细胞, 角膜缘干细胞, 配对盒基因6, 细胞因子, 条件培养基

Abstract: BACKGROUND: Keratopathy transplantation is faced with many problems, such as serious shortage of corneal donors, postoperative immune rejection and so on. While vigorously advocating corneal donation, there is an urgent need to find a new alternative treatment.
OBJECTIVE: The effect of paired box gene 6 on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into keratolimbal stem cell-like cells was investigated by optimizing the culture conditions of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing paired box gene 6 were identified according to cell morphology, osteogenic adipogenic differentiation ability, and cell surface antigen expression. According to different cultured cells and culture medium, they were divided into control group (bone marrow mesenchymal stem cells + complete medium), and experimental group A (bone marrow mesenchymal stem cells + conditioned medium), experimental group B (bone marrow mesenchymal stem cells + conditioned medium + cytokine), and experimental group C (bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing paired box gene 6 + conditioned medium + cytokine). The expression levels of p63, k14 and k12 were detected by immunofluorescence and flow cytometry at 5 and 10 days after induction. The expression of Ki-67, an indicator of cell proliferation, and the rate of apoptosis, were measured by flow cytometry. Western blot assay and RT-PCR were used to determine the protein and mRNA expression of paired box gene 6.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Before induction and culture, the two groups of cells had the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells. (2) After conditioned culture, spherical or oval cells appeared in the four groups after induction, which showed suspension growth. The expression of keratolimbal stem cell-like cells molecules p63 and k14 was positive in the four groups. The fluorescence expression in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05), but the expression of corneal epithelial molecule k12 was negative. With the optimization of the culture conditions, the cell proliferation of experimental group C was more obvious, and there were fewer apoptotic cells. After 5 days of induction, the expression of paired box gene 6 protein and mRNA in the experimental groups increased progressively at 5 days after induction. (3) Results suggested that conditioned medium combined with cytokine induction can accelerate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into keratolimbal stem cell-like cells. Bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing paired box gene 6 are more superior in the speed and proportion of directional differentiation into keratolimbal stem cell-like cells, and it can promote cell proliferation and inhibit cell apoptosis.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, keratolimbal stem cell-like cells, paired box gene 6, cytokines, conditioned medium

中图分类号:

吴霜, 邹星星, 高杰, 胡蓉, 苏敏. 转录因子配对盒基因6对骨髓间充干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3858-3864.

Wu Shuang, Zou Xingxing, Gao Jie, Hu Rong, Su Min. Effect of paired box gene 6 protein on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into keratolimbal stem cell-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3858-3864.

图/表（结果） 12

2.1 小鼠BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs培养及鉴定结果刚接种时细胞呈圆形漂浮于培养基中，24 h后贴壁细胞呈不规则形；1周左右细胞呈集落样生长，形态逐渐变为长梭形或多角形，胞浆丰富，胞核明显，见图1。

成骨诱导25 d后茜素红染色可见大量橘红色矿化结节，见图2。

成脂诱导25 d后油红O染色可见红色脂滴，见图3。

流式细胞术检测细胞表面抗原，结果显示：细胞阳性指标CD29、CD90.2表达率 > 95%，阴性指标CD34和CD45表达率< 5%，见图4。

免疫荧光检测配对盒基因6表达：绿色荧光蛋白标记细胞核染成绿色，PE标记的荧光二抗表达配对盒基因6，在过表达配对盒基因6的BM-MSCs的胞核中可见染成红色的荧光颗粒，而正常BM-MSCs的胞核中未见红色荧光，见图5。

2.2 BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs向LSCs样细胞分化鉴定结果诱导第5天倒置显微镜下观察，4组细胞均出现球形或卵圆形的细胞，呈悬浮生长，见图6。

诱导第5，10天，4组细胞DAPI标记细胞核染成蓝色，PE标记的荧光二抗表达p63，k14，在对照组及实验组中可见染成红色的荧光颗粒，结果保留了merge图，对各组的阳性细胞平均荧光强度进行分析，实验组C >实验组B >实验组A >对照组；角膜上皮特异性抗体k12呈阴性表达，见图7。

流式细胞术检测诱导第5，10天细胞表面抗原，结果显示4组细胞阳性指标p63、k14呈递增趋势，阴性指标k12表达率< 5%，见图8。诱导5，10 d，流式细胞术检测细胞增殖指标Ki-67表达：实验组C >实验组B > 实验组A，见图9。诱导5，10 d，流式细胞术检测细胞凋亡比例：实验组B > 实验组A > 实验组C，见图10。

RT-PCR结果显示：对照组未见到配对盒基因6条带，实验组A、B、C可在1 269 bp 处见到配对盒基因6条带呈递增变化，见图11。

Western blot检测结果显示，对照组未见到配对盒基因6条带，实验组A、B、C可在47 kD处见到配对盒基因6条带呈递增变化，见图12。

综合流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR、Western blot结果，提示小鼠来源BM-MSCs和过表达配对盒基因6的BM-MSCs成功分化为LSCs样细胞，实验组C的分化比例高于其余3组。

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引言

角膜病是仅次于白内障的世界第二致盲常见疾病[1]。当预防和早期治疗都失败时，角膜移植手术就成了治疗严重角膜疾病最为有效的手段。但该手术面临着角膜供者严重缺乏、术后发生免疫排异反应等诸多问题，因此在大力倡导角膜捐献的同时，急需找到一种替代性的治疗手段。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可诱导分化为角膜上皮细胞[2]、角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)[3]、角膜基质细胞等多种角膜细胞[4]。现已在干细胞眼科治疗研究中用于治疗多种眼科疾病[5]，这充分表明了干细胞治疗眼病的可行性和良好应用前景。
配对盒基因6在组织发育中能与多种因子结合，直接或间接地调控其他转录因子、蛋白等表达，广泛参与细胞增殖、分化和黏附等生命活动[2]。研究证实，配对盒基因6能促进LSCs形成，在皮肤表皮干细胞中过表达配对盒基因6可诱导其转化为LSCs样细胞[3]。
表皮生长因子在体外培养时可以刺激角化细胞进行有丝分裂[6]，促进角膜上皮增殖、运动并调节其分化状态[2]。神经生长因子是影响多种细胞在体内、外增殖的细胞因子，可促进和维持LSCs的体外扩增和生长，降低凋亡发生，有维持LSCs干性的作用[3]。转化生长因子主要位于未损伤角膜和愈合过程中上皮细胞的基底层，能刺激骨髓间充质干细胞的增殖与分化[4]。因此，结合骨髓间充质干细胞和相关细胞因子的特性，在优化培养条件的基础上，探讨配对盒基因6对骨髓间充质干细胞向LSCs样细胞增殖分化的影响，为组织工程研究提供更多实用性资料，为临床治疗角膜病探索新的途径。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计离体原代细胞模型，组间差异采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年4月至2021年2月在贵州医科大学科研中心实验室及贵州医科大学组织学与胚胎学实验室完成。
1.3 材料 BM-MSCs株(货号BNCC342037，北纳生物公司)；过表达配对盒基因6的BM-MSCs株(由苏敏课题组保存提供)；磷酸盐缓冲液(Solarbio公司)；DMEM/F12高糖培养基、胎牛血清、青链霉素(Gibco公司)；C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞成脂、成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司)；兔抗P63、小鼠抗k14、小鼠抗k12抗体(Genetex公司)；抗小鼠IgG-PE和抗兔IgG-APC(Abcam公司)；小鼠抗大鼠CD29-PE、直标单克隆抗体CD90.2-PE、CD45-PE、CD34-PE(BioLegend公司)；Nikon300倒置相差显微镜(Nikon公司)；细胞培养箱(Thermo公司)；流式细胞仪(BD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养及鉴定将C57BL/6小鼠BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs接种于T25培养瓶中，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基培养，每隔2 d换液1次，待细胞融合80%-90%后，按1∶2比例传代培养。
(1)成骨分化诱导：取融合达到70%的细胞，吸去完全培养基，加入成骨诱导分化培养基进行分化诱导培养，每3 d更换1次新鲜的成骨诱导培养基。诱导分化培养25 d后，吸去成骨诱导分化培养基，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，加入茜素红染料染色5 min，PBS洗涤3次，于倒置荧光相差显微镜下观察。
(2)成脂分化诱导：取过融合细胞，吸去完全培养基，加入成脂分化诱导培养基A液进行分化诱导培养，孵育3 d后更换为成脂分化诱导培养基B液，孵育1 d后换回A液。此过程重复3-5次后，加入B液维持1周，诱导分化培养25 d后，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定，再次洗涤后加入油红O工作染色液染色30 min，洗涤去除染料，于倒置荧光相差显微镜下观察。
(3)流式细胞术检测CD29、CD90.2、CD34、CD45的表达：消化收集细胞，PBS清洗后离心，使用体积分数为0.01%甲醛固定10 min，加入小鼠抗大鼠CD29-PE(1.0 μg/106)，直标单克隆抗体CD90.2-PE(0.25 μg/106)，直标单克隆抗体CD45-PE(0.25 μg/106)，直标单克隆抗体CD34-PE(0.25 μg/106)，4 ℃避光孵育45 min，PBS清洗3次，离心后去上清，每组加入100 μg 0.5%牛血清白蛋白重悬，置于冰盒上机检测，Flowjo软件分析细胞数量及百分比。
1.4.2 免疫荧光检测配对盒基因6的表达取细胞常规固定、破膜、封闭，加入兔抗配对盒基因6一抗(1∶200)、绿色荧光蛋白一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，12 h后加入CY3标记的山羊抗兔IgG二抗，37 ℃避光孵育2 h，留少量PBS覆盖染色细胞，倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.3 LSCs条件培养基的制备取 50 mL无菌离心管，加入40 mL DMEM/F12、10 mL胎牛血清(特级)、500 μL Glutamax(100×)、500 μL非必须氨基酸、500 μL青链霉素、终浓度为10-10 mol/L霍乱毒素(PBS稀释)、0.5 mg/L氢化可的松、5 mg/L胰岛素、2 mg/L三碘甲状腺原氨酸、50 mg/L表皮生长因子、5 μg/L神经生长因子、10 μg/L 转化生长因子，混合均匀，现配现用。
1.4.4 小鼠BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs向LSCs样细胞分化按照培养细胞和培养基不同进行分组：对照组(BM-MSCs+完全培养基)、实验组A(BM-MSCs+LSCs条件培养基)、实验组B(BM-MSCs+LSCs条件培养基+细胞因子)、实验组C(Pax6/BM-MSCs+LSCs条件培养基+细胞因子)，实验组A、B、C将培养基更换为LSCs条件培养基，实验组B和C额外加入细胞因子[表皮生长因子(50 μg/L)、神经生长因子(5 μg/L)、转化生长因子β(10 μg/L)]继续培养进行后续实验。取第3代细胞，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬制成单细胞悬液，以5×108 L-1接种于25 cm2培养瓶中进行分组培养。
1.4.5 细胞免疫荧光检测p63、k14、k12的表达诱导分化第5，10天，各组细胞铺于24孔板内，用40 g/L多聚甲醛固定、0.5% TritonX-100破膜及体积分数为10%山羊血清封闭，分别加入一抗兔抗p63(1∶200)、小鼠抗k14(1∶200)、小鼠抗k12(1∶100)，4 ℃孵育过夜，12 h后避光孵相应的二抗(CY3标记的山羊抗兔IgG、CY3标记的山羊抗小鼠IgG)，37 ℃避光孵育2 h，DAPI复染细胞核，留少量PBS覆盖染色细胞，倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.6 流式细胞术检测p63、k14、k12的表达收集诱导分化第5，10天的4组细胞，PBS清洗，体积分数为0.01%甲醛固定，PBS清洗2次，0.5% TritonX-100破膜10 min，加入小鼠抗k14、小鼠抗k12和兔抗p63一抗 (1∶100)，4 ℃避光孵育45 min，PBS清洗3次，每次5 min，加入抗小鼠IgG-PE和抗兔IgG-APC(1∶200)标记的二抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，每次3 min，冰上重悬细胞，上流式细胞仪检测，Flowjo软件分析细胞数量及百分比。
1.4.7 流式细胞术检测增殖情况收集诱导分化第5，10天的4组细胞，PBS清洗，体积分数为0.01%甲醛固定，PBS清洗2次，0.5% TritonX-100破膜10 min，加入PE标记的大鼠抗小鼠Ki-67单克隆荧光抗体(1.0 μg/106)，4 ℃避光孵育45 min，PBS清洗3次，离心后去上清，每组加入100 μL 0.5%牛血清白蛋白重悬，置于冰盒上流式细胞仪检测。
1.4.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况收集诱导分化第5，10天的4组细胞，冷PBS洗涤2次，然后用1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1。将100 μL细胞悬液(1×105个细胞)转移到5 mL培养管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI避光轻轻旋转培养管，孵育15 min后向每管中加入400 μL的1X Binding Buffer，1 h内上流式细胞仪分析。
1.4.9 Western blot法检测配对盒基因6的蛋白表达诱导分化第5天，取4组细胞制备蛋白样品，以100 μL裂解液(裂解液∶PMSF=100∶1)冰上裂解30 min。将标准品按 0，1，2，4，8，12，16，20 µL加到 96 孔板的标准品孔，然后用标准品稀释液补足到 20 µL；各孔加入 200 µL BCA 工作液，37 ℃孵育 20-30 min；酶标仪测定540 nm波长的吸光度值并绘制标准曲线；根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。制胶后，取出蛋白样品，100 ℃煮10 min，瞬时离心，根据所提蛋白样品的浓度，计算出含30 ng蛋白所需的上样量，加入5×上样缓冲液至终浓度为1×，边缘孔加入 15 μL 1×上样缓冲液，浓缩胶80 V电泳2 h，当条带进入分离胶时切换电压参数为120 V。将膜用1×TBST洗3次，5 min/次，转移至含有5%BSA的器皿中，室温摇床上摇动2 h。用封闭液稀释兔多克隆抗体配对盒基因6 (1∶1 000)和内参β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，TBST室温洗3 次，10 min/次，加入通用兔二抗(1∶5 000)稀释液，室温孵育 2 h，用1×TBST洗3次，10 min/次；将 ECL 发光液的A液和B液两种试剂等比例混合，将混合液加在PVDF膜的蛋白条带上，放入暗箱中能观察到微亮荧光，调整焦距后拍照保存。
1.4.10 RT-PCR法检测配对盒基因6的mRNA表达诱导第5天，Trizol法提取细胞总RNA，分光光度法检测其纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性，然后反转录合成cDNA，反应结束后，将样品-20℃保存备用，根据试剂盒说明书进行PCR反应，PCR扩增产物加入提前配好的2%琼脂糖凝胶中，200 V电泳40 min，拍照观察4组细胞配对盒基因6的表达差异。配对盒基因6上游引物：5’-ATC AGA GTC GAC ATG CAG AAC AGT CAC AGC GGA G-3’，下游引物：5’-ATC TGA GGA TCC TTA CTG TAA TCG AGG CCA GTA CTG-3’，引物交由上海生工生物工程有限公司设计并合成。
1.5 主要观察指标 ①BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs的成脂、成骨分化能力；②BM-MSCs与过表达配对盒基因6的BM-MSCs的CD29、CD90.2、CD34、CD45表达；③诱导分化后各组BM-MSCs向LSCs样细胞分化程度；④诱导分化后各组BM-MSCs的配对盒基因6蛋白及mRNA表达。
1.6 统计学分析计量资料用x±s表示，所有数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，比较组间差异采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

角膜病患者以每年150万-200万人次递增，而每年只有约5 000人能得到移植治疗并治愈。干细胞眼科治疗研究的获批，使自体骨髓间充质干细胞运用到多种眼科疾病治疗中，随着其在角膜损伤修复方面的研究不断深入，其优势日益明显。
BM-MSCs存在于骨髓基质中，具有取材广、增殖分化潜能[7]、分泌免疫因子且无移植排异反应等优点。目前使用BM-MSCs治疗角膜疾病主要体现在：①直接移植：取自体BM-MSCs移植后利用其旁分泌作用，可释放神经保护性物质在损伤部位分泌各种生长因子、趋化因子等生物活性因子，促进受损组织修复和再生[8]；②诱导分化后移植：体外构建组织工程角膜，将体外培养的角膜细胞接种于可降解的生物支架材料上构建与天然角膜具有相似功能和结构的角膜替代物。
诱导BM-MSCs分化为角膜缘上皮细胞后与角膜基质相结合用于移植治疗[9]。角膜缘上皮细胞为细胞分化的终末状态，它不具有干细胞特性，旁分泌及免疫调节功能也不及LSCs，而LSCs是角膜上皮细胞自我更新以及角膜损伤修复的细胞基础。与其他成体干细胞相同，部分LSCs进入自我更新状态，维持其干细胞特性，保持干细胞池的稳定。因此，该实验考虑将BM-MSCs诱导成为LSCs，目前仅以其表达LSCs因子，不表达角膜缘上皮细胞相关因子作为LSCs鉴定标准，该实验诱导而成的细胞为LSCs样细胞，而不能确定其为LSCs。
细胞增殖分化受多种基因的精确调节，任何特定细胞发育形成都是细胞内外微环境共同调节的结果。作者考虑到优化外环境培养条件，在诱导培养基中加入了3种细胞因子：表皮生长因子、神经生长因子及转化生长因子β。表皮生长因子与其受体酪氨酸激酶结合后刺激细胞内酪氨酸活化，调节细胞的增殖和分化。角膜缘基底上皮细胞中含有丰富的酪氨酸激酶受体，这些细胞具有合成自分泌和旁分泌生长因子的活性，从而促进角膜创伤的愈合[10]。神经生长因子是一个能够影响多种细胞在体内、外增殖的细胞激素，其以不同的分泌方式作用于角膜缘目的细胞后与细胞表面受体连接，从而达到细胞内信号传导的目的[5]。转化生长因子β是一种成骨细胞趋化因子，能增加蛋白质和胶原的产生而促进形成骨基质，具有诱导成骨潜力。因此加入了3种细胞因子能刺激细胞增殖，加快BM-MSCs向LSCs样细胞分化的速度[11]。
转录因子配对盒基因6在脊椎动物眼睛发育过程中是必不可少的。有实验将配对盒基因6转染到小鼠胚胎干细胞中发现转染成功的细胞约有一半可分化为角膜上皮样细胞[12]。相反，当配对盒基因6敲除后，正常的LSCs则更倾向于向皮肤的上皮样细胞分化，角膜上皮的修复能力有所下降，这从另一方面证明了配对盒基因6对于维持LSCs稳定性的重要作用[13]。在皮肤表皮干细胞中过表达配对盒基因6可诱导其转化为LSCs样细胞[12]。配对盒基因6在胚胎干细胞诱导转化为LSCs样细胞过程中可促进其增殖[3]。配对盒基因6转染能够诱导小鼠脂肪间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞[14]。在组织发育中，配对盒基因6能直接或间接地调控多种蛋白及转录因子等靶标。因此，作者猜想在一定范围内过表达配对盒基因6的BM-MSCs可更快分化成为LSCs样细胞，且促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。
BM-MSCs目前的鉴别主要有3个方面：①成纤维样细胞形态，呈梭形、多角形、黏附贴壁生长；②不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45，而表达CD29和CD90.2；③体外可诱导分化成骨和脂肪的功能实验[15]。该实验鉴定了培养的两组细胞均具有间充质干细胞的特性，其具有增殖分化能力，然后鉴定诱导分化后所培养的细胞。LSCs表达p63、Ki-67等蛋白[16-17]。k14是复层上皮具有有丝分裂活性的基底细胞的标识物，表达于人角膜缘及中央角膜上皮的基底细胞中[18-19]，其作为表达在复层化上皮的重要角蛋白，参与细胞的增殖和迁移过程[20]。k12标识终末分化的角膜上皮细胞，在正常角膜缘上皮基底细胞中没有表达[21]。为验证诱导分化细胞为LSCs类细胞而非角膜上皮细胞，流式细胞术及免疫荧光检测了以上因子的表达，最终4组细胞均表达p63及k14，均不表达k12，且表达比例呈递增改变，这说明4组细胞均有分化成LSCs类细胞的能力，实验组C尤为明显。通过对反映细胞增殖能力的指标Ki-67进行检测[22]，发现实验组LSCs的Ki-67水平明显升高(P < 0.05)，说明过表达配对盒基因6后LSCs的增殖能力明显增强。
使用课题组已构建的过表达配对盒基因6的BM-MSCs株，其使用人延伸因子1α亚基启动子(PEF1α)的哺乳动物表达载体pEF1α-IRES-AcG-FP。启动子PEF1α具有不受细胞周期影响、启动子强度高等优点，可使PEF1α启动子下游的蛋白实现高表达，也适用于难转的细胞，有利于转染和外源蛋白的大量扩增，因此实验组C对于配对盒基因6的mRNA和蛋白表达明显增高[23]。而BM-MSCs本身并不表达配对盒基因6，但随着诱导培养基和诱导因子的加入，BM-MSCs向LSCs样细胞分化，根据分化程度的不同，其对配对盒基因6的mRNA及蛋白表达有所不同。
综上，条件培养基联合细胞因子诱导可加快BM-MSCs向LSCs样细胞分化。优化细胞培养环境，过表达配对盒基因6的BM-MSCs向LSCs样细胞定向分化的速度和比例更具有优越性，且其能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，这为细胞移植治疗角膜病提供了可行性评价依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

转录因子配对盒基因6对骨髓间充干细胞向角膜缘干细胞样细胞分化的影响

Effect of paired box gene 6 protein on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into keratolimbal stem cell-like cells

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