山羊骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶修复椎间盘纤维环缺损的组织学比较

doi:10.12307/2022.320

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 1974-1978.doi: 10.12307/2022.320

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山羊骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶修复椎间盘纤维环缺损的组织学比较

徐翔1，吴一民1，李树文1，马丽波2，王宇鹏1，于英楠1，孙涛3 ，张远4 ，任伟5，银和平1

内蒙古医科大学第二附属医院，1微创脊柱外科，2护理部，3急诊科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；4内蒙古国际蒙医院手术麻醉科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；5内蒙古医科大学研究生院，内蒙古自治区呼和浩特市 010059

收稿日期:2021-05-12 修回日期:2021-05-14 接受日期:2021-06-28 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-16
通讯作者: 银和平，教授，主任医师，硕士生导师，内蒙古医科大学第二附属医院微创脊柱外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:徐翔，男，1988 年生，博士，主治医师，主要从事微创脊柱外科方向研究。
基金资助:
内蒙古医科大学科技百万工程课题[YKD2018KJBW(LH)006]，项目负责人：徐翔；内蒙古自治区自然科学基金项目(2019BS03034)，项目负责人：徐翔

Histological comparison between goat bone marrow mesenchymal stem cells and adhesive fibrin for the repair of annulus fibrosus defect of intervertebral discs

Xu Xiang1, Wu Yimin1, Li Shuwen1, Ma Libo2, Wang Yupeng1, Yu Yingnan1, Sun Tao3, Zhang Yuan4, Ren Wei5, Yin Heping1

1Department of Minimally Invasive Spinal Surgery, 2Department of Nursing, 3Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Huhhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 4Department of Surgical Anesthesiology, Inner Mongolia International Hospital, Huhhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 5Graduate College, Inner Mongolia Medical University, Huhhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2021-05-12 Revised:2021-05-14 Accepted:2021-06-28 Online:2022-05-08 Published:2021-12-16
Contact: Yin Heping, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Minimally Invasive Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Huhhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Xu Xiang, MD, Attending physician, Department of Minimally Invasive Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Huhhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
Engineering Project on Science and Technology of Inner Mongolia Medical University, No. YKD2018KJBW(LH)006 (to XX); Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2019BS03034 (to XX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：由于易于提取，骨髓间充质干细胞已成为组织工程中不可缺少的种子细胞，具有快速增殖、多重分化潜力等特征。
生物纤维蛋白胶：主要成分是蛋白质，用于止血、封闭创面、促愈合、防粘连、药物缓释。

背景：目前，腰椎间盘摘除术后纤维环破口仍继续存在，容易形成复发型腰椎间盘突出，如何修复纤维环破口是组织工程学的热点问题。
目的：比较以明胶海绵为载体的山羊骨髓间充质干细胞移植与纤维蛋白粘合剂修复椎间盘纤维环缺损的能力。
方法：从山羊髂骨中提取和分离出骨髓间充质干细胞，并将其进行传代培养。将15只山羊随机分为对照组、粘合组、移植组，每组5只(30个椎间盘)。采用手术器械制备0.75 cm×0.75 cm椎间盘纤维环缺损，粘合组利用纤维蛋白粘合剂对破损的纤维环进行粘合，移植组将负载骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度为5×109 L-1，体积为10 μL)的明胶海绵(0.75 cm×0.75 cm)放入纤维环缺损中，然后逐层进行缝合。术后6，12周，取出纤维环组织进行苏木精-伊红染色、Masson三色明胶染色、AB-PAS染色和Ⅱ型胶原染色。
结果与结论：苏木精-伊红染色观察到移植组中软骨细胞、胶原细胞与骨细胞的数量相比其他两组增多，细胞成熟，修复能力更强；Masson三色明胶染色观察到移植组有更多的成纤维细胞和纤维组织；AB-PAS染色观察到移植组有更多的软骨细胞参与修复；Ⅱ型胶原免疫组化染色发现移植组Ⅱ胶原含量最高；上述结果证实了山羊骨髓间充质干细胞对纤维环缺损有更好的修复能力。

https://orcid.org/0000-0001-8304-3134 (银和平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 纤维蛋白胶, 组织学观察, 纤维环, Ⅱ型胶原, Masson染色, AB-PAS染色, 苏木精-伊红染色

Abstract: BACKGROUND: At present, after lumbar discectomy, annulus fibrosus rupture still exists, easy to form recurrent lumbar disc herniation. How to repair the broken annulus fibrosus is a hot issue in tissue engineering.
OBJECTIVE: To compare the ability of goat bone marrow mesenchymal stem cell transplantation with gelatin sponge as carrier and adhesive fibrin repair for annulus fibrosus defects.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and isolated from the goat iliac bone and transferred for culture. Fifteen goats were randomized into control, adhesion, and transplant groups (n=5 per group and 30 discs per group). The 0.75 cm×0.75 cm disc annulus fibrosus defect was made with surgical instruments. In the binding group, the damage was bonded with fibrin adhesive. In the transplant group, the gelatin sponge (0.75 cm×0.75 cm) with bone marrow mesenchymal stem cell suspension (cell concentration: 5×109/L, 10 μL) was placed into the annulus fibrosus defect and the lesion was stitched layer by layer. At 6 and 12 weeks after surgery, annulus fibrosus tissue was removed for hematoxylin-eosin staining, Masson staining, AB-PAS staining, and type II collagen staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results showed that the number of chondrocytes, collagen cells and bone cells in the transplant group increased, the cells were mature and the repair ability was stronger compared with the other two groups. Masson staining demonstrated that the number of fibroblasts and fibrous tissue was more in the transplant group compared with the other two groups. AB-PAS staining exhibited that more chondrocytes in the transplant group were involved in repair compared with the other two groups. Type II collagen staining showed that the content of type II collagen was highest in the transplant group. The above results confirm that goat bone marrow mesenchymal stem cells have a perfect ability to repair annulus fibrosus defects.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells, adhesive fibrin, histological observation, annulus fibrosus, type II collagen, Masson staining, AB-PAS staining, hematoxylin-eosin staining

中图分类号:

徐翔, 吴一民, 李树文, 马丽波, 王宇鹏, 于英楠, 孙涛, 张远, 任伟, 银和平. 山羊骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶修复椎间盘纤维环缺损的组织学比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 1974-1978.

Xu Xiang, Wu Yimin, Li Shuwen, Ma Libo, Wang Yupeng, Yu Yingnan, Sun Tao, Zhang Yuan, Ren Wei, Yin Heping. Histological comparison between goat bone marrow mesenchymal stem cells and adhesive fibrin for the repair of annulus fibrosus defect of intervertebral discs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 1974-1978.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞的提取与鉴定结果通过密度梯度离心法提取出骨髓间充质干细胞，然后采用细胞贴壁的方式进行传代培养，第3代骨髓间充质干细胞生长方向大体一致，呈集落式生长，形态为长梭形，见图2A。通过免疫组化染色发现：CD29和CD44表面抗原呈阳性表达，细胞胞浆大部分呈现棕褐色，细胞核为紫色，而CD34表面抗原呈阴性表达，见图2B-D。

2.2 实验动物数量分析参加实验动物为15只，每组随机选取5只山羊进行实验(30个椎间盘)，中途无脱落。
2.3 苏木精-伊红染色组织学观察与结果分析术后6周，3组纤维环组织中骨细胞与软骨细胞增殖相差不大，纤维组织增生不明显，无明显差异。术后12周，移植组有大量的骨细胞与软骨细胞增殖，细胞体积很大，形态清晰，呈空泡状，胞核呈蓝紫色，细胞周围可见大量红染的胶原与基质，生长密集，还可见大量的成纤维细胞增殖，纤维组织大量增生，修复和填充缺损部位，见图3A-F。
按照Mankin病理评分标准：正常，0-1分；轻度退变，2-5分；中度退变，6-9分；重度退变，10-14分，术后12周移植组纤维环组织属于轻度退变，可见修复水平已经成熟，纤维环修复成功，见图3G。

2.4 Masson三色明胶染色组织学观察与结果分析术后6周，3组纤维环组织的软骨基质与胶原纤维增殖相差不大，胶原纤维组织生长不明显，无明显差异。术后12周，移植组可见大量空泡状的软骨细胞，细胞体积大，胞核蓝染；细胞生长排列整齐、密集；细胞周围有大量的软骨基质和胶原纤维，呈蓝染，缺损的部位由软骨基质和胶原纤维所填充；骨小梁周围含有大量成熟红染的肌纤维结缔组织，形态完整，修复状态理想，见图4A-F。
按照胶原纤维面密度值进行Masson染色评分，移植组胶原纤维面密度值随着时间的延长与对照组相比上升幅度很大，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4G，说明修复速度加快，修复功能增强。

2.5 AB-PAS染色组织学观察与结果分析术后6周，3组纤维环组织的软骨细胞增殖相差不大，未形成软骨终板，无明显差异。术后12周，移植组镜下呈现大量呈空泡状的软骨细胞，细胞体积较大，呈柱状排列紧密，核蓝染；细胞周围的软骨基质呈现深度蓝染，趋于成熟；软骨板和骨板界限不清，软骨板重度向骨板内凹入，呈现修复状态；软骨基质周围分泌着大量的黏多糖物质，呈深度红染；缺损被软骨组织与黏多糖物质填充，成功修复，见图5。

2.6 Ⅱ型胶原免疫组化染色结果分析术后6周，3组纤维环组织Ⅱ胶原细胞增殖不明显，Ⅱ型胶原纤维组织染色无差异。术后12周，移植组镜下显示有大量的深度黄染的细胞颗粒。细胞的胞浆和分泌的基质都呈现黄染，细胞排列紧密，呈一定的方向性。Ⅱ型胶原染色呈强阳性。与粘合组相比，组织缺损被Ⅱ型胶原填充的更加紧密，表明组织修复成功，图6A-F。
按照免疫组化评分标准：高倍镜下每张切片观察5个视野，每个视野计数100个细胞，不着色计为0分，淡黄色计为1分，黄色计为2分，棕褐色计为3分；按染色阳性细胞所占百分比：着色阳性细胞占计数细胞< 5%计为0分，5%-25%计为1分，26%-50%计为2分，50%-75%计为3分，> 75%计为4分，将二者评分之积作为最终评判标准，结果发现移植组Ⅱ型胶原含量与粘合组相比较多，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6G，说明移植组具有很强的修复功能。

2.7 生物相容性骨髓间充质干细胞、明胶海绵、生物蛋白胶植入体内无不良反应，具有良好的生物相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较使用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2013年6月至2018年6月在内蒙古医科大学完成。
1.3 材料 6月龄锡盟山羊15只，随机分为3组：对照组、粘合组、移植组，每组5只山羊(30个椎间盘)，一共90个椎间盘。所有动物均健康，整个研究期间动物无意外死亡。
1.4 实验方法
1.4.1 山羊骨髓间充质干细胞分离、培养与鉴定取6月龄内蒙古锡盟山羊，用速眠新Ⅱ肌肉注射麻醉后，于双侧髂骨处剪毛备皮，用碘伏进行消毒，然后铺无菌洞巾，在穿刺的地方进行利多卡因局部麻醉，接着用骨穿针进行穿刺，如果感觉有落空感，说明已到达穿刺部位，将骨穿针连接装有1 mL肝素的注射器上，抽取4 mL骨髓液(加肝素1 mL，一共5 mL)。利用密度梯度离心法和贴壁培养法分离与纯化出骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1并接种于培养瓶中进行培养，倒置显微镜观察每天的细胞生长情况，待细胞长到瓶底85%以上时进行传代培养。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，接种于6孔板中进行细胞爬片，利用细胞免疫组化方法检测CD29、CD34和CD44表面抗原的表达。

1.4.2 手术方法对照组山羊用速眠新Ⅱ肌肉注射麻醉后，取侧卧位，手术部位定位为T1-T5椎间盘，然后用剃毛剪以15 cm半径的手术视野进行剃毛，剃毛后用碘伏消毒两三遍，铺无菌洞巾，暴露手术区域，用尖刀在山羊棘突旁2.0-3.0 cm处纵向切开皮肤10-15 cm，然后逐层开皮，如果手术中有出血，可以用压迫止血法和止血钳进行止血。术中找到两肋骨后，发现两肋骨中间有一个白色结节，此为横突，横突靠头侧前下方有一个0.75 cm的白色线圈样物质，此为纤维环。在纤维环上用手术器械破损出0.75 cm×0.75 cm 的缺口，然后逐层缝合皮肤。粘合组、移植组也用同样方法进行造模。粘合组造模后使用猪纤维蛋白胶粘合剂(广州倍绣生物技术有限公司生产)粘合破损的纤维环，然后逐层缝合皮肤；移植组将第3代骨髓间充质干细胞在无菌的环境中与PBS制成细胞悬液(10 μL，细胞浓度为5×109 L-1)打入到医用明胶海绵(0.75 cm×0.75 cm，江西众强实业有限公司)，把明胶海绵植入到缺口中，然后逐层缝合皮肤，见图1。

1.4.3 组织学观察与评估术后6，12周再次进行手术，取出各组纤维环组织，放入体积分数为10%的中性甲醛溶液中固定24 h，用10% EDTA与超声微波联合脱钙1个月，将组织放置于自动脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋，做成厚度为4 μm的石蜡切片，进行苏木精-伊红染色、Masson三色明胶染色、AB-PAS染色和Ⅱ型胶原染色。
1.5 主要观察指标 ①苏木精-伊红染色主要观察组织大体形态以及组织中各类细胞的分布情况；②Masson三色明胶染色主要观察胶原组织与软骨的分布情况；③AB-PAS染色主要观察软骨与骨的分布情况；④Ⅱ型胶原染色主要观察Ⅱ型胶原分布情况。
1.6 统计学分析利用SPSS 25.0软件进行统计分析，将所得数据以x±s表示，3组间比较使用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着年龄的增长，椎间盘内的水分会逐渐丧失[17]，椎间盘退变也会逐渐加重。严重的椎间盘退变会引发一系列腰腿疼痛的症状，也会引起腰椎间盘突出症[18]。手术是治疗腰椎间盘突出症的重要手段。经椎间孔镜下腰椎间盘摘除术是微创手术方式的主流[19-20]，但也有很大的缺陷，在微创手术后的1个月内很容易出现复发性腰椎间盘突出症，患者不得不进行二次椎间盘摘除手术，给患者带来极大的痛苦与经济负担[21-22]。防止椎间盘再突出是解决复发的关键问题。因此，如何修复纤维环已经是当今热点问题。
骨髓间充质干细胞是当今组织工程学中最为重要的种子细胞，很多实验表明骨髓间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力，因此用骨髓间充质干细胞修复纤维环组织是很正确的选择[23-25]。明胶海绵作为组织工程学的支架必不可少，它具有疏松、多孔、无排斥反应等优点，可以把骨髓间充质干细胞打入到明胶海绵中，更有利于固定于缺口中进行修复。
纤维蛋白粘合剂作为组织工程材料早已用于组织修复研究，它的成品由主体胶/主体胶溶解液、催化剂/催化剂溶解液两部分组成。在两种成份混合时，凝血酶激活纤维蛋白原，形成半刚性体而封闭缺损[26]。SAKAI等[27]用胶原蛋白胶作为支架，导入间充质干细胞延缓椎间盘退变。SHA’BAN等[28]研究发现，纤维蛋白可促进体外培养的纤维环和髓核细胞增殖，利用纤维蛋白构建的三维多孔聚乳酸-羟基乙酸支架可以为细胞的传递提供载体，以再生组织工程化椎间盘组织。山羊的腰椎间盘结构与人类相似，亦由纤维环、髓核与终板组成。在纤维环损伤之后，仅最外层1/3 的纤维环组织能够以瘢痕愈合的形式缓慢修复 [17]。
在该实验中，对照组是未经任何修复方法的椎间盘，以瘢痕修复为主，正常瘢痕修复愈合期约为4周，纤维环修复则更为缓慢，故选取6，12周为观察时间点，粘合组和移植组分别运用纤维蛋白胶和骨髓间充质干细胞进行修复，通过组织学观察与评分对比2种修复方法的优劣，但此次实验未涉及空白对照组，没有对修复组与正常对照组进行对照说明，重点主要在于修复方式的对比，已证明细胞移植组比纤维蛋白胶组更具有修复能力。
临床对于纤维环小缺损可进行纤维环缝合，但对于大缺损的纤维环目前没有有效的修复方式，此次实验为临床中进行大缺损纤维环修复奠定实验基础。通过组织学观察与分析表明：移植组对于椎间盘纤维环的修复更加优越，在微创手术过程中可以加入自体骨髓间充质干细胞进行纤维环修复，防止椎间盘的再突出，为今后的临床试验研究奠定了基础，也为以后能够避免腰椎间盘突出症的复发提供了一种有效的手段。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

山羊骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶修复椎间盘纤维环缺损的组织学比较

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