2.1   大鼠间充质干细胞外泌体的鉴定   透射电子显微镜显示，提取物呈现中空凹陷的椭圆或圆形的囊泡结构，这与外泌体的形态一致，见图1A。粒径分析结果显示，这些微泡大多数处于60-150 nm大小范围，符合外泌体的粒径要求，见图1B。蛋白质印迹检测显示囊泡中存在外泌体表面标志物TSG101和Flotillin 1蛋白的表达，见图1C。以上实验证明此次实验提取产物为大鼠骨髓干细胞外泌体。



2.2   负载外泌体水凝胶的特征   含外泌体的甲基丙烯酸化明胶溶液在紫外光照下聚合成水凝胶，见图2A。扫描电镜观察显示外泌体成功负载在甲基丙烯酸化明胶水凝胶上，红色箭头标识外泌体，见图2B。水凝胶的储能模量为(2 010±26) Pa，在低应力下表现出典型的线弹性行为，适合复合细胞生长和体内移植治疗，见图2C，D。结果表明，甲基丙烯酸化明胶水凝胶有良好的细胞相容性和力学性能，成功负载干细胞外泌体确保了其在皮肤损伤修复中的潜在应用。



2.3   成纤维细胞的外泌体吞噬作用    见图3。

成纤维细胞的细胞骨架被染成绿色，细胞核被染成蓝色，外泌体被PKH-26标记成红色。结果可以看到外泌体位于细胞骨架内，聚集在细胞核周围，证明水凝胶内干细胞外泌体能被大鼠成纤维细胞吞噬进入细胞质内。
2.4   外泌体促进成纤维细胞的迁移能力   成纤维细胞是皮肤损伤的主要修复细胞，其细胞活力和迁移能力决定成纤维细胞损伤修复能力。细胞划痕实验结果显示，负载外泌体水凝胶上生长的成纤维细胞更多地迁移至中间，而对照组中出现稀疏的细胞向划痕处生长，见图4A。水凝胶组的间隙面积(0.62±0.02) mm2明显低于对照组(1.15±0.03) mm2，见图 4B。这些结果表明，负载外泌体3D水凝胶能显著提高成纤维细胞的活性和迁移能力。



2.5   负载外泌体水凝胶修复大鼠皮肤损伤的组织学变化   大体组织观察可见，空白组皮肤表面存在大面积缺损，完整性丧失，实验组皮肤损伤范围明显减少，创面几乎完全闭合，见图5A。实验组术后2周的皮肤创面面积(63.4±0.56) mm2明显低于空白组(82.2±0.12) mm2，见图5B。

苏木精-伊红染色显示，空白组皮肤组织出现不同程度的断裂，炎症细胞增多；实验组组织学结构较为完整，细胞数量明显增多，微血管结构清晰可见及密度增加；Masson三色染色显示，实验组皮肤组织呈现结构规则的胶原纤维，空白组仅存在少量胶原纤维且呈现稀疏的结构，见图5C。上述结果表明，负载外泌体水凝胶治疗组的创面愈合速度更快，更倾向于维持正常的皮肤组织结构。



2.6   负载外泌体水凝胶的组织相容性   由动物皮肤修复实验可知，负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶具有良好的组织相容性。

[1] 陶苏皖,朱链,许娜.水凝胶负载干细胞来源的外泌体用于皮肤伤口修复[J].中国生物化学与分子生物学报,2021,37(8):1024-1031. [2] 廖文强,詹剑华,罗锦花,等.慢性创面临床防治的现状与思考[J].实用临床医学,2021,22(2):83-89. [3] 唐乾利,唐强,龚元勋.慢性难愈合创面的基础研究及临床应用进展[J].右江医学,2020,48(11):801-806. [4] SHEN YF, HUANG JH, WANG KY, et al. PTH Derivative promotes wound healing via synergistic multicellular stimulating and exosomal activities. Cell Commun Signal. 2020;18(1):40.  [5] ZHAO R, JIN X, LI A, et al. Precise Diabetic Wound Therapy: PLS Nanospheres Eliminate Senescent Cells via DPP4 Targeting and PARP1 Activation. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2104128. [6] LI M, HOU Q, ZHONG L, et al. Macrophage Related Chronic Inflammation in Non-Healing Wounds. Front Immunol. 2021;12(2):131-156. [7] 蔡伟杰,韩培.水凝胶敷料治疗慢性创面研究进展[J].国际骨科学杂志,2020,41(4):195-198. [8] 刘瑞雪,周腾,樊晓敏,等.明胶基复合水凝胶研究进展[J].轻工学报,2018,33(6):42-54. [9] 罗雅馨,毕浩然,陈晓旭,等.间充质干细胞来源外泌体与再生医学：无细胞疗法临床应用的未来[J].中国组织工程研究,2020, 24(19):3055-3062. [10] 孙璇,毛念渝,刘明珠,等.间充质干细胞来源外泌体在皮肤损伤修复中的研究进展[J].系统医学,2019,4(16):196-198. [11] FAN L, XIAO C, GUAN P, et al. Extracellular Matrix-Based Conductive Interpenetrating Network Hydrogels with Enhanced Neurovascular Regeneration Properties for Diabetic Wounds Repair. Adv Healthc Mater. 2022;11(1):e2101556.  [12] SHEN Y, XU G, HUANG H, et al. Sequential Release of Small Extracellular Vesicles from Bilayered Thiolated Alginate/Polyethylene Glycol Diacrylate Hydrogels for Scarless Wound Healing. Acs Nano. 2021;15(4): 6352-6368.  [13] ALVEN S, PETER S, MBESE Z, et al. Polymer-Based Wound Dressing Materials Loaded with Bioactive Agents: Potential Materials for the Treatment of Diabetic Wounds. Polymers (Basel). 2022;14(4):724.  [14] 吴兴,刘肇兴,林欢欢,等.甲基丙烯酸酐明胶材料学特性及在皮肤组织工程应用与进展[J].中国组织工程研究,2018,22(2):323-328. [15] GUAN P, LIU C, XIE D, et al. Exosome-loaded extracellular matrix-mimic hydrogel with anti-inflammatory property Facilitates/promotes growth plate injury repair. Bioact Mater. 2021;22(7):600-610. [16] ZHU D, LI Z, HUANG K, et al. Minimally invasive delivery of therapeutic agents by hydrogel injection into the pericardial cavity for cardiac repair. Nat Commun. 2021;12(1):1412. [17] BRENNAN MÁ, LAYROLLE P, MOONEY DJ. Biomaterials Functionalized with MSC Secreted Extracellular Vesicles and Soluble Factors for Tissue Regeneration. Adv Funct Mater. 2020;30(37):1909125. [18] FAN L, LIU C, CHEN X, et al. Directing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neural Stem Cell Fate with a Three-Dimensional Biomimetic Hydrogel for Spinal Cord Injury Repair. Acs Appl Mater Inter. 2018; 10(21):17742-17755. [19] OUYANG X, HAN X, CHEN Z, et al. MSC-derived exosomes ameliorate erectile dysfunction by alleviation of corpus cavernosum smooth muscle apoptosis in a rat model of cavernous nerve injury. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):246. [20] 边晓玮,张翠萍,李炳旻,等.胎盘间充质干细胞外泌体对高糖培养的成纤维细胞衰老的影响[J].第三军医大学学报,2020,42(12): 1163-1173. [21] 田新立,江波,颜洪.脂肪间充质干细胞来源外泌体对角质形成细胞增殖和迁移的影响与机制[J].中国组织工程研究,2019,23(1):68-73. [22] 李超然,黄桂林,王帅.间充质干细胞来源外泌体促进损伤组织修复与再生的应用与进展[J].中国组织工程研究,2018,22(1):133-139. [23] 林宇建,韩兵,麦钰仪,等.深度创伤后瘢痕发生发展机制及干细胞来源的外泌体治疗研究进展[J].广东药科大学学报,2021,37(1): 142-147. [24] WANG G, XIE L, LI B, et al. A nanounit strategy reverses immune suppression of exosomal PD-L1 and is associated with enhanced ferroptosis. Nat Commun. 2021;12(1):5733. [25] 陶苏皖,朱链,许娜.水凝胶负载干细胞来源的外泌体用于皮肤伤口修复[J].中国生物化学与分子生物学报,2021,37(8):1024-1031. [26] 程远航,陈津,吴卫真.间充质干细胞及其外泌体修复电离辐射损伤的研究进展[J].中华细胞与干细胞杂志(电子版),2020,10(5): 310-313. [27] ZHANG C, ZHU Z, GAO J, et al. Plasma exosomal miR-375-3p regulates mitochondria-dependent keratinocyte apoptosis by targeting XIAP in severe drug-induced skin reactions. Sci Transl Med. 2020;12(574): eaaw6142. [28] WANG X, JIAO Y, PAN Y, et al. Fetal Dermal Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Accelerate Cutaneous Wound Healing by Activating Notch Signaling. Stem Cells Int. 2019;2019:1-11. [29] WANG T, JIAN Z, BASKYS A, et al. MSC-derived exosomes protect against oxidative stress-induced skin injury via adaptive regulation of the NRF2 defense system. Biomaterials. 2020;257:120264. [30] FANG S, XU C, ZHANG Y, et al. Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNAs Suppress Myofibroblast Differentiation by Inhibiting the Transforming Growth Factor-β/SMAD2 Pathway During Wound Healing. Stem Cell Transl Med. 2016;5(10): 1425-1439. [31] 唐建宏,张霓霓,黄桂林,等.间充质干细胞源性外泌体在组织纤维化修复中的作用[J].中国组织工程研究,2022,26(25):4022-4027. [32] ZHANG K, ZHAO X, CHEN X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. Acs Appl Mater Inter. 2018;10(36): 30081-30091. [33] WATERS R, ALAM P, PACELLI S, et al. Stem cell-inspired secretome-rich injectable hydrogel to repair injured cardiac tissue. Acta Biomater. 2018;69: 95-106.  [34] SUN G, LI G, LI D, et al. hucMSC derived exosomes promote functional recovery in spinal cord injury mice via attenuating inflammation. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2018;89:194-204.  [35] ROMANELLI P, BIELER L, SCHARLER C, et al. Extracellular Vesicles Can Deliver Anti-inflammatory and Anti-scarring Activities of Mesenchymal Stromal Cells After Spinal Cord Injury. Front Neurol. 2019;10:1225.  [36] 姜文彬,陈雳风,孙家明.脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复中的作用机制[J].组织工程与重建外科,2021,17(4):352-357. [37] LI W, LIU Y, ZHANG P, et al. Tissue-Engineered Bone Immobilized with Human Adipose Stem Cells-Derived Exosomes Promotes Bone Regeneration. Acs Appl Mater Inter. 2018;10(6):5240-5254. [38] 崔国宁,刘喜平,虎峻瑞,等.干细胞来源外泌体的生物学特性研究进展[J].今日药学,2020,30(2):106-109. [39] CHEN P, ZHENG L, WANG Y, et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 2019;9(9):2439-2459. [40] ZHU Y, LIU H, QIN S, et al. Antibacterial Sericin Cryogels Promote Hemostasis by Facilitating the Activation of Coagulation Pathway and Platelets. Adv Healthc Mater. 2022:e2102717.  [41] TSARYK R, GLORIA A, RUSSO T, et al. Collagen-low molecular weight hyaluronic acid semi-interpenetrating network loaded with gelatin microspheres for cell and growth factor delivery for nucleus pulposus regeneration. Acta Biomater. 2015;20:10-21. [42] CASADO-DÍAZ A, QUESADA-GÓMEZ JM, DORADO G. Extracellular Vesicles Derived From Mesenchymal Stem Cells (MSC) in Regenerative Medicine: Applications in Skin Wound Healing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2020;8:146. [43] 周欣,王颖,张馨欣.间充质干细胞外泌体-温敏水凝胶的制备及其在表皮创伤修复中的应用[J].中国医药工业杂志,2021,52(9): 1199-1207.

[1]	农复香, 蒋志雄, 李英豪, 许文聪, 施智兰, 罗 慧, 张晴朗, 钟 爽, 唐梅文. 外泌体调控铁死亡在疾病诊断治疗中的应用与作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-10.
[2]	潘钟杰, 秦志鸿, 郑铁军, 丁晓飞, 廖世杰. 股骨头坏死发病机制中非编码RNA的靶标性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1441-1447.
[3]	党 祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹 金, 熊 山, 张顶梅, 王 信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[4]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[5]	李 诚, 郑国爽, 蒯贤东, 于炜婷. 海藻酸盐支架修复关节软骨[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1080-1088.
[6]	李启程, 邓 进, 付小洋, 韩 娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[7]	王 敏, 尹秀山, 王盈熹, 张 妍, 赵 龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[8]	张厚君, 邓博文, 蒋昇源, 赵 毅, 任敬佩, 徐 林, 穆晓红. 脑性瘫痪儿童脑脊液内外泌体的蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 903-908.
[9]	高 婷, 马小红, 李晓荣. 三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 860-865.
[10]	袁 博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[11]	许其静, 杨伊春, 雷 微, 杨 莹, 余 江, 夏婷婷, 张 萌, 章 涛, 张 潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[12]	陈冠廷, 张琳琪, 李清茹. 外泌体miRNA对慢性肾脏病诊断价值的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 970-976.
[13]	刘文涛, 冯兴超, 杨 毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[14]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[15]	李 龙, 李光第, 石 豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.

皮肤损伤通常由严重创伤或烧伤等引起，使机体有效生理屏障受到破坏，导致身体脱水和外部微生物渗透[1]。皮肤损伤的病理过程中包括原发损伤导致的结构破坏，可进一步引起氧化应激、炎症等继发性损伤[2-3]，复杂的微环境变化导致损伤部位成纤维细胞活性下降甚至凋亡坏死，从而形成囊腔，迁延不愈合[4-5]。现有的伤口愈合策略包括有效清创、感染治疗、合并症治疗、减压和使用伤口敷料等[6]，但这些治疗策略修复时间较长且结果往往不尽如人意。

有效的伤口敷料可以作为屏障促使伤口快速闭合，并减少瘢痕的形成。目前，天然细胞外基质水凝胶具有出色的生物降解性和生物相容性，作为新一代的伤口敷料受到了广泛的青睐。研究表明，细胞外基质水凝胶可为细胞的黏附、分化和增殖提供三维基质，以改善伤口修复[7-8]，但是，细胞外基质水凝胶缺少必要的生物活性成分。外泌体是细胞分泌的直径为30-150 nm的微小囊泡，具有非免疫原性和非致瘤性等优点[9]。骨髓间充质干细胞外泌体含有多种mRNA、microRNA(miR)、脂质和蛋白质等多种生物活性物质，具有抗炎和促进细胞增殖生长作用[10]。骨髓间充质干细胞外泌体通过将各种RNA和蛋白质输送到邻近或远处的细胞，在细胞间通讯中起着重要的作用。因此，3D细胞外基质水凝胶复合干细胞来源外泌体可能是皮肤损伤治疗的良好选择。

应用细胞外基质水凝胶有效递送外泌体并与皮肤周围组织进行桥接，有助于皮肤损伤的修复[11-13]。明胶作为天然胶原蛋白的产物，是体内细胞外基质的主要成分。甲基丙烯酸改性明胶水凝胶具有良好的生物学特性和可调节的物理特性，在骨骼[14]、软骨[15]、心脏等领域组织工程中得到广泛应用[16]。据报道，甲基丙烯酸改性明胶水凝胶含有刺激细胞黏附的RGD肽，能有效建立一个免疫隔离屏障，显著增强移植外泌体的稳定性[17-18]。3D甲基丙烯酸改性明胶水凝胶提供了一种高效且有效的方式来维持外泌体的生物活性，可能是皮肤损伤治疗的良好选择。

作者所在团队分离获得大鼠骨髓间充质干细胞外泌体，将外泌体均匀负载在3D甲基丙烯酸改性明胶水凝胶，通过紫外光照将其原位聚合在大鼠背部损伤处，以评估水凝胶联合外泌体治疗大鼠皮肤损伤的效果，为后期的临床应用提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，动物观察实验，实验数据比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2021年5月在南方医科大学附属第三医院和华南农业大学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物    6-8周龄雄性SD大鼠20只，3周龄雄性SD大鼠3只，孕13.5 d SD大鼠胎鼠3只，均购自南方医科大学实验动物中心。所有大鼠均在华南农业大学动物房中饲养，自由进食、进水，相对湿度50%，温度25 ℃，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气，每天更新食物及饮用水，每周清洁1次鼠笼。实验方案经南方医科大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   主要试剂及仪器   明胶(纯度≥98%)、甲基丙烯酸酐(纯度≥90%)(北京阿拉丁)；DMEM培养液、胰蛋白酶、青-链霉素、PBS、胎牛血清、DMEM培养基(Gibco，美国)；DAB 显色试剂盒、苏木精染色试剂盒、鬼笔环肽染色液(碧云天，中国)；肿瘤易感基因TSG101(Abcam，美国)；Flotillin 1(ProteinTech，武汉)；亲脂示踪剂PKH26(美国Sigma公司)；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE凝胶、BCA 蛋白质测定试剂盒、兔源Ⅱ型胶原多克隆抗体、增强型化学发光试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；RIPA 裂解缓冲液(中国CWBIO公司)；多聚甲醛、伊红染色液、苯胺蓝染色液(自北京索莱宝科技有限公司)；红色荧光亲脂示踪剂PKH26(Sigma)；超速离心机(Beckman Coulter)；透射电子显微镜(HITACHI)；旋转流变仪(Physica MCR301，Anton Paar)；发射扫描电子显微镜(蔡司)；共聚焦显微镜(Leica)。
1.4   实验方法   
1.4.1   外泌体的分离和鉴定  

分离培养骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞均按照以往文献报道方法提取[15]。无菌条件下切取3周龄SD大鼠双侧股骨及胫骨，使用DMEM培养液冲洗骨髓腔直至变白。将冲洗获得的细胞培养于含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，隔天更换培养基以获得纯化的骨髓间充质干细胞。

提取外泌体：采用差速超速离心方案获取骨髓间充质干细胞外泌体。提前使用超速离心机将胎牛血清在4 ℃下以 120 000×g超速离心12 h，以制备不含外泌体的血清。取第2-4代骨髓间充质干细胞用于培养分离外泌体，当细胞密度达到80%时，换用无外泌体含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，48 h后收集细胞上清液。将上清液低速离心(200×g，20 min)去除死细胞和细胞碎片后，使用0.22 μm滤头进行过滤，继续进行高速离心(100 000×g，90 min)。离心后的内容物用PBS洗涤，再次高速离心(100 000×g，90 min)，所得外泌体重新悬浮在 100 μL PBS中以备进一步使用。使用qNano®系统(Izon Science)检测外泌体的大小，透射电子显微镜分析外泌体的形态。采用蛋白质印迹检测确定外泌体表面标记物肿瘤易感基因TSG101和Flotillin 1的表达[19]。

免疫印迹检测：将骨髓间充质干细胞和外泌体在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解。使用BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。在8%SDS-PAGE 凝胶上将等量(30 μg)的每种蛋白质悬浮液分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。随后将膜用5%脱脂牛奶封闭 1 h，在4 ℃下与一抗(TSG101、Flotillin 1抗体，稀释比为1∶500)孵育过夜。加入二抗孵育1 h后，使用增强型化学发光(ECL)试剂盒对免疫印迹显影。
1.4.2   负载外泌体3D水凝胶的制备和特征    甲基丙烯酸化明胶水凝胶按照以往文献报道方法合成[8]。简而言之，将甲基丙烯酸酐(20%)加入明胶溶液中，搅拌反应1 h，透析后冷冻干燥保存。将200 μg外泌体和0.05%光引发剂(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂)加入到甲基丙烯酸化明胶水凝胶溶液(200 g/L)中，将混合溶液在紫外光(UV)下交联形成负载外泌体的3D甲基丙烯酸化明胶水凝胶。使用发射扫描电子显微镜观察水凝胶的形貌，旋转流变仪评估水凝胶的力学流变。使用旋转流变仪在频率扫描模式下对水凝胶的力学性能进行测定，频率范围为0.1-10 Hz，应变值为5.0%，温度为37 ℃。
1.4.3   大鼠成纤维细胞的提取   去除SD大鼠胎鼠的头部、内脏、四肢及尾部，将躯干剪碎，加入0.25%胰酶室温下充分消化后分离出大鼠成纤维细胞[20]。将成纤维细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基，每3 d换一次培养基。
1.4.4   成纤维细胞摄取外泌体实验   将外泌体与红色荧光亲脂示踪剂PKH26在室温下孵育 30 min，然后4℃下100 000×g离心70 min，去除残余的染料；随后与甲基丙烯酸化明胶水凝胶溶液混匀，在紫外光照射下形成水凝胶。

将1×107的成纤维细胞加在负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶上，培养24 h后，用40 g/L多聚甲醛固定     30 min，加入鬼笔环肽染色液孵育1 h。最后加入 Hoechst 33342 染液进行细胞核染色 5 min，使用共聚焦显微镜观察细胞吞噬外泌体。
1.4.5   成纤维细胞体外迁移实验   将1×107的成纤维细胞种植在负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶上，并以接种于普通培养板的细胞作为对照组。当细胞达到 80%-90%融合率时，在每个样品纵向划出人工划痕，并用PBS洗涤2次以去除悬浮细胞。继续培养12 h后，使用钙黄绿素-AM进行染色，采用共聚焦显微镜观察细胞迁移。 
1.4.6   大鼠皮肤缺损模型制作及外泌体水凝胶植入   取6-8周龄SD大鼠20只，腹腔注射70 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪混合物进行麻醉，剔除大鼠背部毛发，使用模具在大鼠背部左右造成1 cm大小圆形损伤缺口，深度为0.2 cm，造模后随机数字法分为空白组与实验组，每组10只，空白组损伤部位覆盖生理盐水，实验组损伤部位覆盖负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶。两组最后均覆盖无菌纱布。 每天观察并记录所有伤口情况。

组织学分析：术后2周取大鼠背部皮肤组织，40 g/L多聚甲醛固定1 d，包埋在石蜡中，并垂直于伤口表面切成6 mm厚切片。①苏木精-伊红染色：将切片脱蜡、水化后放入苏木精水溶液中染色5 min，流水冲洗1 h后，加入体积分数70%和90%乙醇中梯度脱水各10 min，最后加入乙醇伊红染色液染色。②Masson染色：使用蓝化液返蓝3-5 min，流水冲洗2 min后，加入丽春红品红染色5-10 min，最后使用苯胺蓝染色液复染，脱水封固后进行观察。
1.5   主要观察指标   成纤维细胞吞噬外泌体情况，负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶对成纤维细胞迁移的影响，以及负载外泌体的甲基丙烯酸化明胶水凝胶修复皮肤缺损的效果。
1.6   统计学分析   统计分析均使用SPSS 22.0软件，数据表示为x±s。 通过单向方差分和最小显著差异检验(LSD-t)(假设方差相等)对结果进行统计分析。当P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经南方医科大学生物统计学专家审核。

皮肤损伤模型实验结果显示，原位聚合负载骨髓间充质干细胞外泌体的水凝胶显著加快了创面的愈合；免疫组织化学结果显示，负载干细胞外泌体的水凝胶可以促进成纤维细胞的增殖迁移，增加胶原纤维的沉积。

最近的研究表明，间充质干细胞在皮肤组织再生中的作用主要与其旁分泌作用有关[21]。间充质干细胞分泌活性因子具有促损伤处成纤维细胞增殖生长、促血管生成、抗炎等作用，有效加速创面愈合[22-23]，因此，干细胞外泌体在治疗创面愈合中受到极大关注。外泌体可以解决一些与活细胞相关的问题，如免疫相容性、肿瘤发展、遗传多样性等。骨髓间充质干细胞的旁分泌作用可介导间充质干细胞对多种疾病有益治疗作用，其旁分泌物质包括多种细胞因子、外泌体和核酸[24-25]。外泌体通过将物质转移到受体细胞来调节细胞间通讯，并且可以刺激参与创面愈合过程的皮肤细胞的生长和增殖[26-27]。据报道，外泌体通过激活 STAT3、AKT、ERK和Wnt/β-catenin 信号通路影响细胞的迁移及增殖、促进血管生成、胶原蛋白生成和再上皮化过程[28-30]。

众所周知，细胞外基质水凝胶敷料具有良好的生物相容性和多孔状结构，可以完全填充各种不规则损伤形状，满足皮肤损伤修复要求[31]。明胶是一种胶原蛋白，是细胞外基质的主要成分。3D 细胞外基质水凝胶可以持续降解，是细胞因子和生物活性物质传递的良好载体[32-35]。骨髓间充质干细胞的旁分泌作用可介导间充质干细胞对多种疾病有益治疗作用，其旁分泌物质包括多种细胞因子、外泌体和核酸[36]。在过去的几年中，据报道，来自骨髓间充质干细胞的外泌体在皮肤损伤中具有治疗作用。然而，外泌体直接注射在受损部位容易流失并且活性时间很短[37-39]，因此，此次实验旨在证实负载外泌体的水凝胶是否可以促进成纤维细胞的迁移和皮肤创面的愈合。此次实验结果显示，负载外泌体的水凝胶可以促进成纤维细胞的迁移，显著加速皮肤创面的愈合和胶原纤维的沉积，另一方面，通过细胞外基质水凝胶增加皮肤损伤处外泌体的局部浓度和保留度。随着甲基丙烯酸改性明胶水凝胶的生物降解，外泌体可逐步持续往外渗透释放，在损伤处停留时间延长，促进外泌体内容物有效吸收并发挥治疗功能。综上，说明外泌体和3D细胞外基质水凝胶的结合可能是皮肤损伤修复的有效治疗方法之一。

尽管此次实验表明负载外泌体水凝胶在促进皮肤创面愈合中起着重要作用，但实验结果仍然存在一些局限性。皮肤细胞外基质包括胶原蛋白、弹性蛋白、聚糖等[40-41]，此次实验只选取了明胶作为水凝胶的本体材料，后续实验应进一步探究不同皮肤外基质成分来源的水凝胶结合外泌体对于皮肤损伤治疗的作用。此外，骨髓干细胞来源的外泌体含有多种蛋白质、DNA、RNA和miRNA，在皮肤修复中发挥不同的治疗作用[42-43]。因此，它们对皮肤损伤治疗作用的潜在机制需要进一步详细研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
外泌体：指细胞分泌的直径为30-150 nm的微小囊泡，具有非免疫原性和非致瘤性等优点，含有多种mRNA、microRNA、脂质和蛋白质等多种生物活性物质，具有抗炎、促血管生成和促进细胞增殖生长等作用。
细胞外基质水凝胶：保留原组织或器官的细胞外基质蛋白成分、活性因子和天然的三维结构，能较好还原组织受损前的微环境，具有促进细胞黏附、增殖和分化的生物活性以及可生物降解的特性，在骨骼、软骨、周围神经和心脏等领域组织工程中得到广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

天然细胞外基质 水凝胶具有出色的生物降解性和生物相容性， 因缺少生物活性成分作为损伤敷料效果有限。作为骨髓间充质干细胞旁分泌物的载体，骨髓间充质干细胞外泌体携带可溶性因子、脂质、蛋白质和核酸，可促进细胞间通讯并调节多种生理功能。在这项研究中，研究了甲基丙烯酸改性的水凝胶联合干细胞衍生的外泌体在皮肤损伤中的治疗效果。在体外，成纤维细胞摄入骨髓间充质干细胞外泌体可以显着促进迁移。体内皮肤损伤模型，水凝胶联合外泌体治疗显著促进胶原沉积和微血管形成，促进皮肤伤口的愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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