1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2021年6月至2022年5月在郑州大学第二附属医院生殖医学部实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株、质粒 HEC-1-A细胞株(人子宫内膜腺癌细胞)由郑州大学第二附属医院鲁笑钦老师课题组惠赠;YKO-RP003-HLA-DRA质粒购于源井生物。
1.3.2 仪器与试剂 细胞培养箱(MCO-5AC,SANYO,日本);显微镜(XSP-BM31Y,老上光,中国);单人单面垂直送风净化工作台(SW-CJ-1D,苏州天创净化设备有限公司);离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司,批号2020092302);HEC-1-A专用培养基(普诺赛,中国,批号WH01112106XP);胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio,中国,批号20200922);嘌呤霉素(Solarbio,中国,批号107R0421);D-PBS缓冲液(不含钙镁和酚红)(Biosharp,中国,批号22109893);快速细胞冻存液(无血清)(上海雅酶,批号01592200);LipofectamineTM Stem Reagent(Invitrogen,立陶宛,批号 01107237);Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium(Gibco,美国,批号2193103);琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪生物公司,中国);通用型柱式基因组提取试剂盒(康为世纪生物公司,中国)。
1.4 方法
1.4.1 质粒构建及鉴定 构建带有绿色荧光和嘌呤霉素抗性基因且能靶向敲除 HLA-DRA基因的 CRISPR/Cas9 质粒,质粒构建由源井生物公司完成。应用在线工具http://h-p.crispor.tefor.net.zzulib.vpn358.com/针对靶基因设计oligo单链并合成引物,制备线性化表达载体,将靶基因的退火产物构建到线性化载体中。转化反应产物到E.coli Stbl3感受态细胞,通过菌落PCR对转化子进行筛选,对筛选所得阳性克隆正反双向测序鉴定,经鉴定与设计序列一致后,质粒抽提用于后续实验。
1.4.2 无内毒素质粒提取及质粒浓度和纯度检测
(1)取10 μL构建好的含有质粒gRNA的大肠杆菌,将菌种接种于液体LB培养瓶中,适温摇菌24 h,离心后倒掉培养液,加入溶液P1充分重悬细菌,加入溶液P2裂解菌体为清亮液体,加入溶液P4缓慢上下颠倒混匀后离心去除沉淀,收集上清液用去内毒素过滤柱过滤,过滤后转移至离心管中,加入0.3倍滤液体积的异丙醇后转移到吸附柱中,离心后倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中,加去蛋白液PD,重复上述离心步骤,加漂洗液PW重复上述步骤漂洗2次后空离去除残余漂洗液,从吸附柱中间缓慢加入洗脱缓冲液TB,离心后收集质粒,-20 ℃保存。
(2)取5 μL质粒溶液,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)取5 μL质粒溶液,使用NanoDrop分光光度计检测质粒的质量浓度为0.3 μg/μL,A260/280在1.8-2.0之间。
1.4.3 细胞培养 将冻存的HEC-1-A细胞从液氮中取出,在37 ℃下使其快速解冻,然后用HEC-1-A培养基重悬后离心,弃上清,用HEC-1-A培养基重悬细胞后种于10 cm 培养皿中,置于37 ℃和体积分数为6% CO2培养箱中培养。
1.4.4 细胞转染 在细胞传代当天,以每孔1.5×105个细胞接种于24孔板中,加入500 μL HEC-1-A培养基,分别用25 μL Opti-MEM稀释2 μL LipofectamineTM Stem Reagent转染试剂和0.5 μg质粒,轻轻吹打混合均匀,然后将LipofectamineTM Stem Reagent转染试剂和质粒混合均匀,室温静置10 min后将其加入24孔板的1个孔中进行细胞转染,转染48 h后更换HEC-1-A专用培养基。
1.4.5 嘌呤霉素抗性基因筛选稳定的HLA基因敲除细胞克隆 转染48 h换液后,用2.0 μg/mL嘌呤霉素连续筛选6 d,观察同步筛选的空白对照组几乎无细胞后终止转染组细胞筛选,待细胞生长1周后,观察到一荧光较强且致密细胞克隆团块,用细胞刮将孔内其余细胞去除,仅保留该细胞团,待其增殖后用于后续实验。
1.4.6 荧光显微镜观察阳性细胞 使用倒置荧光相差显微镜在激发波长为488 nm的蓝光激发下可观察到表达绿色荧光蛋白的阳性细胞即预计HLA-DRA基因成功敲除细胞。
1.4.7 DNA提取、PCR及胶回收
(1)分别取HLA-DRA基因编辑细胞及对照组细胞,1 500 r/min
离心3 min后尽量吸弃上清,加入20 μL Proteinase K。
(2)加入适量Buffer GL涡旋振荡混匀,56 ℃水浴10 min后短暂离心去除管内壁水珠。
(3)加入适量无水乙醇,立即涡旋振荡,短暂离心,不弃上清。
(4)将步骤(3)所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中。
(5) 12 000 r/min离心1 min后,倒掉收集管中的废液,将吸附柱装入收集管中。
(6)加入Buffer GW1,12 000 r/min离心1 min后,倒掉收集管中的废液,将吸附柱装入收集管中。
(7)加入Buffer GW2,12 000 r/min离心1 min后,倒掉收集管中的废液,将吸附柱装入收集管中。
(8) 12 000 r/min离心2 min,倒掉收集管中废液,将吸附柱置于室温彻底晾干以去除吸附柱中残余的乙醇。
(9)将吸附柱放入新的离心管中,从吸附柱中间部位加入Buffer GE,静置5 min后离心,收集DNA溶液,置于-20 ℃保存。
(10)预混PCR反应试剂:引物序列及PCR反应体系,见表1和表2。将各组分加到PCR管里,轻轻吹打混匀后,盖上管盖,将PCR管放到PCR仪中,按照如下程序进行PCR反应:94 ℃,10 min;94 ℃,15 s,60 ℃,10 s,72 ℃,30 s,50个循环;37 ℃,5 s。
(11)按照上述反应比例以及PCR条件,进行40 μL PCR反应体系的扩增,PCR反应结束后,将40 μL PCR反应液全部加入到加样孔中,进行琼脂糖凝胶电泳。
(12)从琼脂糖凝胶中切下单一目的DNA条带,溶解胶块,回收纯化DNA,置于-20 ℃保存。
(13)吸取上个步骤回收纯化的DNA 5 μL,进行琼脂糖凝胶电泳,检测PCR产物胶回收效果,目的条带清晰可见。
1.4.8 胶回收产物测序 对PCR胶回收产物送至北京擎科生物技术有限公司进行基因测序,验证HEC-1-A细胞中的HLA-DRA基因是否敲除。
1.4.9 转录组测序与分析 对测序数据进行质控后使用edgeR软件进行差异分析,按照P值< 0.05且|log2FC|≥1为筛选标准筛选差异基因,对筛选得到的差异基因使用clusterProfiler
分别进行基因功能富集分析和通路富集分析,预测HLA-DRA基因编辑引起的差异表达在基因功能上的体现及其参与的主要信号转导通路和生化代谢途径。
1.5 主要观察指标 ①细胞转染与嘌呤霉素筛选后绿色荧光蛋白表达;②PCR扩增、胶回收测序观察预计编辑位点基因序列的改变;③转录组测序后观察与肿瘤增殖分化相关基因的表达以及功能富集情况。