免疫组化结果显示，与野生型对照小鼠相比，SIRT6-i/-i小鼠小肠潘氏细胞标记物溶菌酶表达水平明显降低，干细胞标记物Lgr5表达水平降低，见图2。



2.3   SIRT6-i/-i小鼠来源的肠类器官形成及特征标记物改变    SIRT6-i/-i小鼠来源的肠隐窝细胞经培养3 d，可形成球囊状类器官，其出芽率较野生型对照小鼠来源的肠类器官显著降低(0.25±0.04，0.54±0.10，P < 0.01)。经Western-blot实验检测显示，SIRT6-i/-i肠道类器官中SIRT6的蛋白表达水平明显降低，见图3。

免疫荧光结果显示，与野生型对照小鼠相比，SIRT6-i/-i小鼠来源的肠类器官中Lgr5的蛋白表达水平显著降低，而细胞角蛋白20、黏蛋白2的蛋白表达水平明显升高，见图4及表2。







2.4   SIRT6-i/-i小鼠肠组织转录组学的特征变化   转录组分析表明，与野生型对照小鼠比较，SIRT6-i/-i小鼠肠组织差异表达基因共846个，其中上调基因438个，下调基因408个，见图5；差异基因在KEGG通路富集前5位的分别是化学致癌、药物代谢、视黄酸代谢、亚油酸代谢和类固醇生物合成，见图6；显著富集通路中关联的基因主要为Cyp2、Cyp3、Cyp4家族的改变，尤其以基因表达上调为主，见图7。

沉默信息调节因子(silent information regulator，SIRT)是存在于细菌和哺乳动物细胞内高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的蛋白去乙酰化酶，参与调控细胞的基因修复、细胞代谢、细胞能量平衡和寿命，大多涉及心、脑、肾、肝等器官[1]。近年来研究表明，SIRT通过调节炎性因子、改变杯状细胞和潘氏细胞数量及肠上皮细胞间紧密连接蛋白等影响肠屏障功能，其在肠黏膜调控中的研究日益受到关注[2]。SIRT6是SIRT家族中的一员，主要表达于细胞核中，研究发现SIRT6敲除小鼠寿命显著缩短[3]，而肠上皮SIRT6特异性敲除小鼠对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎更为敏感[4]。同时，SIRT6在调控干细胞稳态方面发挥重要作用：SIRT6通过共激活核因子E2相关因子2保护人骨髓间充质干细胞免受氧化应激损伤，在维持人骨髓间充质干细胞稳态方面起重要作用[5]；通过骨形态发生蛋白信号促进间充质干细胞成骨分化[6]；通过TET介导的5-羟甲基胞嘧啶的产生来调控胚胎干细胞稳态[7]。目前关于SIRT6在肠干细胞调控中的作用尚不明晰，此次研究采用肠道SIRT6特异性基因敲除小鼠模型，初步探讨SIRT6对肠黏膜更新的影响，并通过转录组学分析相关机制，为后续SIRT6参与肠黏膜形态及功能的生理病理研究提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，两组间的各项数据经检验符合正态分布，经过方差齐性检验，方差齐，采用t检验分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年7月至2021年5月在广州中医药大学科技创新中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SIRT6-i/-i小鼠及同窝野生型对照小鼠各3只，SPF级，雌性，8周龄，体质量20-22 g，由广州中医药大学科技创新中心高永博士赠送。环境湿度控制在 50%-70%，温度 20-26 ℃，喂养灭菌饮用水和标准鼠饲料。

实验过程符合广州中医药大学实验动物伦理要求，批准号为20200703001。实验遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂与仪器   IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Mouse)(货号：06005，加拿大STEMCELL公司)；cell dissociation reagent(货号：07174，加拿大STEMCELL公司)；Matrigel(货号：356234，美国BD公司)；Corning CELL Recovery Solution(货号：354253，美国康宁公司)；CryoStor® CS10(货号：07930，加拿大STEMCELL公司)。全蛋白提取试剂盒/BCA 蛋白含量检测试剂盒(货号：KPG2100、KPGBCA，
凯基生物公司)；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒(货号：P0012A，上海碧云天生物技术有限公司)；SIRT6小鼠多克隆抗体、细胞角蛋白20小鼠多克隆抗体(货号：12486S，13063S，美国CST公司)； GAPDH小鼠单克隆抗体、溶菌酶小鼠多克隆抗体、Lgr5小鼠单克隆抗体(货号：Ab125247，Ab108508，Ab75850，美国abcam公司)；黏蛋白2小鼠单克隆抗体(货号：Sc-7314，美国Santa公司)。山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 488)预吸附二抗(货号：ab6734，美国Abcam公司)；鼠兔通用型免疫组化检测试剂盒(货号：SP-9000，北京中杉金桥生物科技有限公司)；DAB 显色试剂盒(20×)(货号：ZLI-9017，北京中杉金桥生物科技有限公司)。垂直电泳仪Mini-protean  TETra System、Trans-Blot®SD Cell 转印系统、ChemiDocTMXRS+成像仪、Imark酶标仪(型号：1658001，2211BR，1708265，LD108，美国Bio-RAD公司)；荧光显微镜(型号：BX63，日本奥林巴斯公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   构建SIRT6-i/-i小鼠模型   SIRT6基因(NCBI参考序列：NM_181586；Ensembl：ENSMUSG00000034748)位于小鼠10号染色体上；共鉴定出8个外显子，ATG起始密码子位于外显子1，TGA终止密码子位于外显子8(转录 SIRT6-201：ENSMUST00000042923) ；选择外显子2-3作为目的位点；将Cas9和gRNA共同注射到受精卵中用于生产CRISPR-AI 条件性敲除小鼠(flox/+)并进行基因分型鉴定。采用SIRT6-floxed杂合小鼠与Villin-Cre小鼠交配，同时SIRT6-floxed杂合小鼠进行自交；获得的SIRT6floxed/floxed小鼠和Villin-Cre；SIRT6floxed/+小鼠交配，最终获得Villin-Cre；SIRT6floxed/floxed小鼠即为肠绒毛特异性SIRT6敲除小鼠，获得SIRT6floxed/floxed小鼠即为同窝野生型对照小鼠。幼鼠出生3周进行基因型鉴定。 

1.4.2   形态学观察   8周龄SIRT6-i/-i组小鼠和同窝对照组小鼠，适应性饲养3 d。按照小鼠体质量以 1.5 mL/kg的剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，随后处死小鼠。取小肠组织(空肠段1 cm)置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定72 h，经过脱水、浸蜡、包埋、切片处理后，进行苏木精-伊红染色，然后脱水、中性树胶封固后在光学显微镜下观察拍片，比较小肠组织形态学变化。在显微镜400倍镜下，计数杯状细胞和潘氏细胞的数目(5个视野/片)；另一部分切片用于免疫组织化学染色。剩余的小肠组织用于后文所述各项实验。
1.4.3   转录组学分析   取1.4.2中所述两组小鼠剩余的小肠组织中段(空肠段2 cm)，迅速液氮冻存。样本由百迈克生物科技有限公司进行提取、Illumina平台测序，并进行生物信息学分析BMKCloud (www.biocloud.net)。分析差异表达基因在某一通路上是否发生显著差异(over-presentation)即为差异表达基因的通路富集分析。转录组差异表达基因使用edgeR进行分析，将Fold Change≥1.5且P < 0.01作为筛选标准。Pathway显著性富集分析以KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)中Pathway为单位[8]，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。
1.4.4   类器官培养   取1.4.2中所述两组小鼠剩余的小肠组织6-8 cm进行隐窝干细胞分离及类器官培养。将所取小肠组织装入10 mL含有预冷PBS的离心管中，移入超净台内进行操作；用已经过高温灭菌的剪刀镊子沿着肠系膜纵向剖开肠管，用预冷的PBS进行反复清洗，剪碎成长度约为1 mm组织，用滴管将剪碎的组织移入50 mL的离心管中，用预冷的PBS进行冲洗，每次30 s，重复20次，直到上清液清澈；去除上清液，每一管加入20 mL gentle cell dissociation reagent，室温放在摇床上震荡消化15 min；静置30 s，去除上清液，每管加入15 mL 0.1%BSA(99 mL冷PBS+1 mL 10%BSA)，用滴管吹打，静置30 s，用70 μm滤器进行过滤，重复操作4次；常温离心，1 500 r/min，5 min，收集沉淀；加入10 mL 培养基(99 mL F12+1 mL 10%BSA)，用1 mL枪头吹打混匀。取10 μL混悬液滴于玻片，于显微镜下评估类器官活力及数量；常温离心，1 500 r/min，5 min，去上清；加入300 μL Intestinal Mouse Basal Medium，用1 mL枪头吹打，混匀，加入300 μL提前放在4 ℃的基质胶，吹打，混匀，制成隐窝干细胞混悬液；拿出提前放在细胞培养箱预热的24孔板，以每孔50 μL混悬液滴在24孔板中；将24孔板放在培养箱10 min待基质胶固化，每孔加入600 μL Intestinal Mouse Basal Medium培养液，每两三天换一次培养液。
1.4.5   Western blot检测类器官SIRT6蛋白表达变化   1.4.4中所提取的两组类器官培养传代后，收集类器官样品提取蛋白，具体收集步骤如下：弃去孔中原来的培养液，用预冷的PBS冲洗2遍；每孔加入500 μL细胞回收液，用1 mL枪头进行吹打，直至基质胶溶解；将液体吸入1.5 mL离心管，4 ℃放置30 min；4 ℃离心5 000 r/min，3 min，弃上清，收集沉淀用于后续实验。BCA试剂盒进行蛋白定量；配制10%分离胶和浓缩胶，进行电泳(条件：80 V，20 min；100 V，90 min)，转膜条件(100 V，60 min)。一抗(SIRT6 1∶1 000，GAPDH 1∶5 000)4 ℃孵育过夜，二抗 (1∶3 000)，室温孵育1 h。采用ECL显色，用Image Lab 3.0进行曝光，Image J测定吸光度，做半定量分析。
1.4.6   免疫荧光检测肠类器官Lgr5、细胞角蛋白20和黏蛋白2蛋白表达变化   ①第1天，用1.4.4中所述两组类器官培养传代后，制作类器官爬片，具体步骤如下：将细胞爬片置于24孔板中，以每孔5 μL类器官基质胶滴于爬片上培养3 d。加入40 g/L多聚甲醛固定，放入4 ℃冰箱过夜，用于后续免疫荧光检测。②第4天，将24孔板取出进行类器官免疫荧光检测，具体步骤如下：弃去孔中固定液，用预冷IF buffer冲洗3遍，5 min/次；用0.5%Tritonx-100透膜20 min，再次用预冷IF buffer进行冲洗，条件同前；用1%BAS(IF buffer配制)封闭30 min后，一抗(Lgr5为1∶100；细胞角蛋白20为 1∶200；黏蛋白2为1∶200)4 ℃孵育过夜。③第5天，取出24孔板于室温复温10 min，用预冷IF buffer冲洗5 min，重复3次；之后与室温下避光孵育荧光二抗 (1∶500) 1 h和DAPI避光染核 3 min；将爬片放在滴有防荧光淬灭剂的玻片上，周围用透明指甲油封固，避光在室温下进行风干1 h后，用荧光显微镜观察与拍摄。
1.4.7   免疫组化检测肠干细胞标记物Lgr5和潘氏细胞标记物溶菌酶的表达   取1.4.2中所述小肠切片用于免疫组化检测，具体步骤如下：切片经过二甲苯及各级乙醇进行常规脱蜡；PBS冲洗后，将切片置于抗原修复液中，用微波炉加热，高火8 min，中高火10 min进行抗原修复；待切片恢复至室温，PBS冲洗，滴加体积分数3%过氧化氢酶，室温孵育10 min，PBS冲洗；滴加正常羊血清工作液37 ℃孵育1 h进行封闭；滴加一抗(Lgr5 1∶100；溶菌酶 1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日，二抗室温孵育1 h，辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育20 min，DAB显色液染色30 s，苏木精染核40 s，切片经过各级乙醇及二甲苯进行透明、晾干后用中性树脂封固，用光学显微镜进行组织切片染色情况观察。 
1.5   主要观察指标   ①小鼠小肠黏膜绒毛长度及密度、隐窝高度、杯状细胞数目和潘氏细胞数目；②小肠黏膜干细胞标记物Lgr5蛋白、潘氏细胞标记物溶菌酶蛋白的表达；③肠类器官出芽率、肠类器官中Lgr5、细胞角蛋白20、黏蛋白2蛋白表达；④转录组学分析。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经过广东中医药大学生物统计学专家审核。此次实验应用Prism软件作图，应用SPSS statistics软件进行统计学分析，数据用x±s表示，先检验是否符合正态分布，再进行方差齐性检验，经检验两组间的数据符合正态分布，方差齐，采用t检验进行分析，P < 0.01为差异有显著性意义。

SIRT6是沉默信息调节因子家族的一员，被称为“长寿基因”，研究表明SIRT6发挥“长寿作用”的机制与其在维持基因组和表观基因组稳定性方面的作用息息相关[9]。亦有研究表明，SIRT6可优化老年时的能量稳态，以延缓虚弱并保持健康的衰老[10]。

此外，SIRT6在细胞应激、细胞衰老及代谢、干细胞稳态等方面亦发挥重要作用。研究表明，SIRT6在调节干细胞稳态和不同类型成体干细胞的功能方面具有关键作用。SIRT6的组蛋白去乙酰化修饰对维持间充质干细胞稳态十分重要，SIRT6缺陷的间充质干细胞在体内移植时表现为成骨细胞和软骨细胞分化受损、细胞衰老和细胞早衰等；而SIRT6过表达可以促进大鼠间充质干细胞的成骨分化，增强新骨形成和骨修复[11-12]。SIRT6也可维持造血干细胞的长期自我更新能力，SIRT6通过H3K56去乙酰化，抑制调控造血干细胞稳态的关键因子Wnt通路的基因转录；而SIRT6的缺失会导致细胞静息期的减少，进而导致造血干细胞更新失衡。刘芳宜[13]的研究表明SIRT6与结肠炎的关系密切，SIRT6的表达会随着结肠炎的发生发展而降低。LU等[14]的研究表明，SIRT6 是维持黏膜稳态和治疗肠道炎症的候选靶点。目前SIRT6参与肠干细胞稳态调控的研究尚少。

2007年荷兰的CLEVERS发现Lgr5标记的阳性隐窝干细胞具有增殖分化功能，BARKER等[15]通过插入等位基因以及谱系追踪等实验技术手段证明Lgr5是人和小鼠肠道隐窝干细胞的标记物。潘氏细胞是小肠上皮中唯一产生溶菌酶的细胞类型[16]，因此溶菌酶是潘氏细胞的经典标记物。潘氏细胞是唯一位于隐窝区域的分化细胞，不仅可以产生抗菌肽调节肠道微生物，而且可产生生长因子维持隐窝微环境影响干细胞的增殖分裂[17]。干细胞的增殖、分化和凋亡过程依赖不同信号途径相互作用，以维持干细胞的稳态，其中Wnt信号与干细胞增殖调控息息相关，而Notch信号更多参与干细胞的分化调控[18]。此次研究结果发现SIRT6-i/-i小鼠小肠绒毛及隐窝高度明显变浅，其中黏膜杯状细胞的数量明显增多，潘氏细胞数量明显降低，而溶菌酶和Lgr5的表达明显下降，提示SIRT6缺失导致隐窝干细胞增殖、分化稳态失衡，隐窝区域细胞增殖能力减弱，进而导致肠黏膜更新受损。

细胞角蛋白20属于细胞骨架成分之一，具有调节细胞分化的作用，有严格的特异性分布，在小肠中主要位于小肠绒毛的上皮细胞的细胞纤维素中[19]，是上皮细胞的经典标记物。杯状细胞分布于整个肠上皮，可分泌黏液并合成黏蛋白，与水、无机盐共同组成肠道上皮的黏液屏障，对肠黏膜起到保护和润滑作用[20]。黏蛋白2是一种分泌型肠黏液蛋白,是组成肠黏液的主要成分[21]。黏蛋白2的表达及定位具有细胞特异性[22]，大部分在杯状细胞中分布，可用来标记杯状细胞。在体外实验中，通过分离肠道隐窝干细胞，构建肠道类器官模型发现，SIRT6-i/-i小鼠来源的肠类器官中SIRT6蛋白明显缺失，其类器官的成球及出芽形态明显减少，免疫荧光结果显示Lgr5的蛋白表达明显降低，而类器官中成熟的吸收上皮细胞标记物细胞角蛋白20、杯状细胞标记物黏蛋白2的蛋白表达增高；可见SIRT6缺失表型主要体现在对隐窝干细胞的影响，表现为干细胞增殖功能减弱，而分化功能相对增强，进而可能导致肠黏膜更新稳态受损。

近年来，高通量测序技术被广泛应用于肠道的差异转录组研究，为肠黏膜更新机制解析提供基础数据。为全面了解SIRT6-i/-i小鼠肠组织全转录水平的变化情况，此次研究对SIRT6-i/-i小鼠肠组织与对照小鼠肠组织差异表达基因进行分析，发现KEGG功能显著富集通路中差异表达基因以Cyp2、Cyp3、Cyp4家族的上调为主，提示SIRT6参与肠黏膜更新机制可能与细胞色素P450家族的调控有关。P450酶是植物界、动物界及微生物界生长过程中不可或缺的部分，参与催化类固醇激素的合成、调控脂溶性激素及药物代谢等[23]。1990年Nebert[24]提出P450酶的生物学功能可能在于负责调控与生物体细胞增殖、分化、独立和肿瘤诱发有关的信号分子的稳态水平。此次研究中SIRT6-i/-i小鼠肠组织显著上调的Cyp3a11是人Cyp3a4的同源基因，Cyp3a4是人体CYP450酶系中最重要的成员之一，主要分布于肝脏和肠道，随着人出生后肠道菌群的定植而逐渐上调，无菌小鼠研究也显示，其肝脏Cyp3a11的表达水平显著低于正常饲养条件的小鼠[25-26]。成人Cyp3a4介导的三级胆汁酸代谢在一定程度上参与了胆汁酸代谢稳态调控，而胎儿肠道中没有微生物定植，其胆汁酸代谢清除可能主要经Cyp3a7完成，随着肠道菌群的定植和肝Cyp3a的发育，逐步过渡到成人胆汁酸的初级-次级-三级代谢模式[27]。胆汁酸及其相关核受体FXR、PXR、VDR在维持肠黏膜屏障的完整性中都发挥重要作用[28-29]，可见肠道SIRT6缺失引起的Cyp3酶家族基因改变可能是其参与肠黏膜更新稳态调控的机制之一。

总之，SIRT6对成体干细胞结构与功能的调控研究正逐步成为热点，尤其是对肠道干细胞的调控机制研究亟待深入。此次研究中SIRT6-i/-i小鼠肠黏膜形态及差异转录组的表达特征，从分子水平上初步表明了SIRT6与肠干细胞稳态调控关系密切，为进一步探讨SIRT6参与肠黏膜形态及功能的生理病理研究提供了思路，可为临床炎症性肠病等难治性疾病提供新的治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
肠类器官：来源于隐窝干细胞，在体外3D培养技术下，通过隐窝干细胞可增殖分化成各种功能的肠上皮细胞，可在体外重建出类似体内肠道细胞组成、生理结构和功能的三维立体肠组织。
沉默信息调节因子(Silent information regulator，SIRT)：是具有去乙酰化酶活性的第三类去乙酰化酶的总称，主要通过依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发挥去乙酰化作用，SIRT家族参与了细胞新陈代谢、DNA损伤修复等细胞生命过程。 
SIRT6：是SIRT家族的成员之一，具有去乙酰化酶活性和单ADP核糖基转移酶活性，在调控衰老、糖酵解、脂质代谢、炎症、肿瘤和凋亡的发生发展中发挥着不可忽视的作用。

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文章特点—

(1)采用小肠SIRT6基因特异性敲除小鼠(SIRT6-i/-i)，并在此基础上体外构建SIRT6-i/-i肠道类器官模型，研究SIRT6对肠道的影响。

(2)研究证实，SIRT6缺失会导致干细胞增殖和分化功能失衡，表现出肠黏膜更新受损。SIRT6参与了肠隐窝干细胞增殖和分化稳态的调控，其机制可能与SIRT6缺失抑制小肠干细胞标记物Lgr5蛋白和潘氏细胞标记物溶菌酶蛋白表达，上调吸收上皮细胞标记物细胞角蛋白20蛋白和杯状细胞标记物黏蛋白2蛋白表达有关。

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