2.1   小鼠胚胎流出道心内膜垫与插入垫的形成   胚龄9.5 d小鼠胚胎， 流出道呈单管状，其管壁由外向内依次可见心肌膜、无细胞的心胶质及内皮，见图1A。Isl1为第二生心区前体细胞的特异性标记物，表达见于心包腔背侧壁的脏壁中胚层，并延续至与之相连的流出道远端壁，见图1B。Nkx2.5用于显示第二生心区前体细胞、早期分化以及分化完成的心肌细胞，由流出道远端至近端，均可见Nkx2.5阳性细胞，见图1C。心肌细胞标记物MHC在流出道心肌膜远端呈弱阳性表达，向流出道近端延伸，MHC表达增强，见图1A。 Isl1、Nkx2.5与MHC在心包腔背侧壁与流出道远端壁的表达模式提示第二生心区前体细胞向心肌细胞分化；MHC、Nkx2.5在流出道的表达模式则说明此期流出道为心肌性流出道，见图1A，C。此期动脉囊位于咽腹侧，管壁由内皮构成，其近端与心包内的流出道相连，见图1A。动脉囊与弓动脉周围可见正在迁移的神经嵴细胞的标记物Ap2α的表达。动脉囊腹侧的Ap2α阳性细胞延续至流出道远段的心胶质内，见图1D，提示神经嵴细胞沿着弓动脉、动脉囊壁迁移进入流出道。Sox9、α-平滑肌肌动蛋白可用于标记间充质细胞。连续切片观察，流出道心胶质内尚未出现Sox9或α-平滑肌肌动蛋白阳性间充质细胞，见图1E，F。

胚龄10-10.5 d，动脉囊腹侧的Ap2α阳性神经嵴细胞继续延伸至流出道远段的心胶质内，见图2A。流出道内皮及其邻近的部分间充质细胞开始表达上皮-间充质转化特异性标记物Snail，尤以流出道近段较明显，见图2B，C，说明心内膜的内皮细胞经过上皮-间充质转化形成心胶质内的间充质细胞。神经嵴细胞的迁入与内皮细胞的上皮-间充质转化使流出道心胶质内间充质细胞明显可见，并表达α-平滑肌肌动蛋白、Sox9，见图2D，E，说明流出道心内膜垫形成。流出道心肌、内皮以及心内膜垫内的间充质细胞同时表达Jag1、Notch2，见图2F，G，心内膜垫内的间充质细胞也表达Alk3和p-Smad1/5/8，见图2H，I。

胚龄11 d，咽腹侧的Isl1阳性细胞急剧增加，形成锥形区，见图3A，部分细胞表达Nkx2.5，见图3B。此期动脉囊由心包背侧突入心包腔，MHC染色呈阴性，因此形成流出道非心肌部，其远端壁仍与心包腔背侧壁相连，见图3C。横切面和冠状切面显示上述锥形区域尖端Isl1或Nkx2.5阳性细胞经左、右弓动脉之间延续入流出道非心肌部的内皮与外层上皮之间，在局部聚集形成阳性细胞团，即插入垫，见图3A，B，D，E。相邻切片染色显示此处流出道壁的外表面MHC仅局部表达，见图3F，说明插入垫出现于流出道非心肌部与心肌部交界处。连续切片观察肺动脉侧插入垫内Nkx2.5阳性细胞多于主动脉侧插入垫，见图3G，说明前者的形成早于后者；三维重建结果显示肺动脉侧插入垫定位高于主动脉侧插入垫，见图3H，I，J。比较两种心内膜垫，可见插入垫和流出道心内膜垫几乎出现于同一水平，但插入垫的长度小于流出道心内膜垫的长度，见图3H；另一方面，流出道心内膜垫内可见α-平滑肌肌动蛋白、Sox9、Jag1、Notch2、p-Smad1/5/8与Alk3的表达，见图3K-P，但不再表达Snail，见图3Q。而上述包括Snail在内的7种蛋白在插入垫内大多呈阴性，见图3K-N，P，仅可见p-Smad1/5/8阳性细胞，见图3O，说明插入垫形成时并未发生上皮-间充质转化。至胚龄11.5 d，两侧插入垫大小对称，仍富含Isl1阳性细胞，见图3R，但Nkx2.5表达减少，见图3S，可观察到少量Sox9阳性细胞，见图3T。



2.2   小鼠胚胎流出道分隔与主、肺动脉瓣膜形成   胚龄12.5 d，流出道的非心肌部已经分隔为升主动脉和肺动脉干，见图4A。在两动脉根部与流出道心肌部交界处，动脉瓣膜原基已形成，其中主动脉的左、右冠瓣，以及肺动脉的左、右半月瓣是由于心内膜垫融合形成，见图4B。瓣膜内富含Sox9阳性间充质细胞，见图4C，也可观察到Jag1、Notch2、Alk3、p-Smad1/5/8的明显表达，见图4D-G。而主动脉的无冠瓣和肺动脉的前半月瓣来自于2个插入垫，与胚龄11.5 d相比，该瓣膜内Isl1阳性细胞和Nkx2.5阳性细胞急剧减少，见图4H，I，Sox9表达明显上调，见图4C，同时开始表达Jag1和Notch2，见图4D，E。在此期，连续切片观察和三维重建结果显示主动脉的无冠瓣和肺动脉的前半月瓣的厚度明显薄于其他4个动脉瓣，见图4J。瓣膜以下，流出道心内膜垫彼此相贴，但尚未融合，心内膜垫内由间充质细胞聚集形成2个致密细胞柱，所含细胞大多呈α-平滑肌肌动蛋白阳性，见图4K，也表达Sox9，见图4L。在瓣膜水平，两侧致密细胞柱在中线融合，α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞平行排列，见图4B。

胚龄13-15 d，主、肺动脉瓣膜原基增长、变薄，基本具有了成体动脉瓣膜的形态。瓣膜以下的流出道心内膜垫逐渐融合，将流出道心肌部分隔为主动脉前庭和肺动脉圆锥。动脉瓣膜内观察到大量Sox9阳性间充质细胞，见图5A。值得注意的是，在主动脉的无冠瓣和肺动脉的前半月瓣同时观察到Isl1阳性细胞，见图5B，C，其余4个动脉瓣膜内无Isl1阳性细胞，见图5B，C。Notch2信号及其配体Jag1在胚龄13 d的动脉瓣膜的表达开始减弱，在胚龄15 d时消失，见图5D，E；同时Alk3和p-Smad1/5/8阳性细胞在动脉瓣膜内的表达也逐渐减弱，见图5F，G。

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先天性心脏畸形的表现常包括瓣膜发育异常，例如主动脉瓣二叶式畸形[1]，因此研究主、肺动脉瓣膜的发育过程对探究这些先天畸形的发生具有重要意义。一般认为，主、肺动脉瓣膜来源于胚胎心脏的流出道心内膜垫[2-4]。在流出道形成后，心内膜的内皮细胞经上皮-间充质转化形成间充质细胞进入心胶质[5-6]；心脏神经嵴来源细胞也同时迁入，二者共同参与形成流出道心内膜垫[7-8]。在流出道分隔时，两侧流出道心内膜垫的远端融合形成主动脉的左、右冠瓣和肺动脉的左、右半月瓣[9-11]。而主动脉的无冠瓣、肺动脉的前半月瓣则是由插入垫(Intercalated cushions，IC)形成[6，12-14]。现有对流出道发育的研究多聚焦于参与流出道分隔的心内膜垫，仅有数篇关于瓣膜发育的文献涉及到插入垫的形成，认为插入垫来自于第二生心区[12]，第二生心区包括咽前间充质、鳃弓核心间充质和心包腔背侧壁脏壁中胚层[15-16]。但有学者在插入垫来源的主动脉无冠瓣内同样观察到心脏神经嵴来源细胞的少量分布[6，10，17]。因此，插入垫的形成以及重塑成为动脉瓣膜的过程有待进一步研究。

有关主动脉瓣二叶式畸形发生原因的研究显示部分病例表现为Notch1基因突变[18]；配体Jagged1 (Jag1)、受体Notch1或Notch2基因突变可导致肺动脉瓣狭窄，说明主、肺动脉瓣膜的发育过程需要Notch信号通路的调节[19-20]。现有研究证实受体Notch1通过与配体Jag1结合抑制间充质细胞增生从而限制心内膜垫的大小，即保证瓣膜正常形态的发生[18]，而受体Notch2在瓣膜发育过程中的表达模式以及作用有待进一步阐明。

此研究选用免疫组织化学染色、三维重建等方法系统观察胚龄9.5-15 d小鼠胚胎心脏流出道的分隔与主、肺动脉瓣膜形成过程，揭示插入垫的细胞来源以及两对心内膜垫重塑形成动脉瓣膜的过程，为探究动脉瓣膜相关疾病的病因提供形态学基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学体外实验。
1.2   时间及地点   实验于2020年5月至2021年12月在山西医科大学组织胚胎学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   2月龄SPF级健康ICR雌鼠16只、雄鼠10只，体质量24-32 g，收集胚龄9.5-15 d小鼠胚胎共176只，每个胚龄胚胎各选取5只做实验。所有的实验小鼠均来自山西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(晋)2019-0004。

实验方案经山西医科大学动物实验中心伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   主要试剂   兔抗Sox9抗体和小鼠抗Snail抗体(Santa Cruz公司)；兔抗Isl1抗体(ABclonal公司)；小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；小鼠抗心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)抗体(Upstate公司)；兔抗Nkx2.5抗体和兔抗AP2α抗体、兔抗Notch2抗体、兔抗Jagged1抗体(Jag1)、兔抗BMPR1A抗体(Alk3)均为Abcam公司产品；兔抗phospho Smad1/Smad5/Smad8(p-Smad1/5/8，Sigma公司)；即用型SABC-POD山羊抗小鼠IgG、即用型SABC-POD山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   标本制作    2月龄健康ICR小鼠，于每日晚18点以雌雄2∶1的比例进行合笼，次日6点发现阴栓者记为妊娠0.5 d，发现阴栓的小鼠依据 KAUFMAN[21]标准来确定妊娠天数。取9.5-15 d的胚胎固定脱水后，石蜡包埋，制作7 μm厚连续切片，用来做免疫组织化学染色。
1.4.2   免疫组织化学染色   选用SABC法染色。石蜡切片经过脱蜡、水化，体积分数3%过氧化氢和TENG-T各处理30 min后，加入兔抗Sox9抗体和小鼠抗Snail抗体(1∶50)、兔抗Isl1抗体(1∶500)、小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(1∶1 500)、小鼠抗心肌MHC抗体(1∶1 000)，兔抗Nkx2.5抗体和兔抗AP2α抗体(1∶100)、兔抗Notch2抗体(1∶1 000)、兔抗Jagged1抗体(Jag1，1∶200)、兔抗BMPR1A抗体(Alk3，1∶300)及兔抗phospho Smad1/Smad5/Smad8(p-Smad1/5/8，1∶50)，4 ℃过夜孵育。分别滴加即用型SABC-POD山羊抗小鼠IgG和即用型SABC-POD山羊抗兔IgG，SABC试剂各常温下孵育
30 min，DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封固，用日本OlympusBX53显微镜观察小鼠胚胎心脏Isl1、Nkx2.5、MHC、Ap2α、Sox9、α-平滑肌肌动蛋白、Snail、Jag1、Notch2、Alk3和p-Smad1/5/8的蛋白表达，DP74成像系统拍照。
1.4.3   三维重建   选择胚龄11.5 d和12.5 d的小鼠胚胎免疫组织化学染色的连续石蜡切片图，用Olympus显微镜拍照后，收集到胚龄11.5 d共176张和胚龄12.5 d共167张照片，分别将照片上传到Amira 5.2.0软件(澳大利亚Visage Imaging公司)，大概操作步骤为：将所有连续切片按照从头端至尾端的顺序整理好导入软件中→导入数据后，在软件内对齐切片→勾画出所关注结构的轮廓→不同结构选用不同的颜色→通过Surface显示其空间立体结构→通过SurfaceCut对建好的三维结构进行切割→按需保存图像。在三维重建中，制作了动脉囊、流出道、流出道心内膜垫、插入垫、主动脉瓣膜和肺动脉瓣膜。通过处理后生成的三维立体结构，观察流出道心内膜垫和插入垫的变化以及瓣膜的形态。
1.5   主要观察指标   ①胚龄9.5-15 d的小鼠胚胎心脏Isl1、Nkx2.5、MHC、Ap2α、Sox9、α-平滑肌肌动蛋白、Snail、Jag1、Notch2、Alk3和p-Smad1/5/8的蛋白表达；②心脏的三维重建观察流出道心内膜垫和插入垫的变化以及瓣膜的形态。

3.1   小鼠胚胎流出道的插入垫来源于咽前间充质第二生心区细胞   研究显示流出道心内膜垫的形成有赖于心内膜来源的细胞和心脏神经嵴来源细胞的参与[6]，而关于插入垫的来源及其形成过程有待进一步阐明[2，4]。

此次实验结果显示，胚龄9.5-10.5 d小鼠胚胎，AP2α阳性神经嵴细胞出现于流出道远端的心胶质内。同时，内皮细胞经上皮-间充质转化形成间充质细胞进入心胶质，说明心脏神经嵴和心内膜来源细胞共同参与心内膜垫的形成，与以往研究结果一致。胚龄11 d，第二生心区前体细胞更多地聚集在咽前间充质，形成锥形区，其尖端的Isl1阳性细胞延伸入流出道管壁外层与内皮之间，部分细胞也同时表达Nkx2.5，并在局部聚集形成插入垫。ELEY等[12]认为具有上皮特性的第二生心区前体细胞由心包腔背侧壁进入流出道远端形成插入垫，此次实验结果直观显示了插入垫的细胞来源于咽前间充质，在迁入流出道之前，已失去上皮特性。插入垫的内皮细胞缺乏Snail的表达，说明插入垫内并未进行上皮-间充质转化，进一步证实所含细胞是外源细胞的迁入。至胚龄12.5 d，流出道分隔以及动脉瓣膜原基形成后，仅在主动脉的无冠瓣和肺动脉的前半月瓣内发现Isl1和Nkx2.5阳性细胞，提示这2个瓣膜来源于插入垫，与胚龄11 d相比，插入垫来源的瓣膜内细胞Isl1和Nkx2.5表达减弱，间质细胞标记物Sox9表达增强，提示第二生心区前体细胞直接分化为瓣膜的间质细胞。
3.2   Notch2信号参与主、肺动脉瓣膜的发育   主、肺动脉瓣膜的发育过程包括心内膜垫的形成、流出道分隔时瓣膜原基形成及其重塑，此过程需要Notch信号通路的调节。相关研究多聚焦在受体Notch1，对Notch2的研究显示在房室管和流出道的心内膜垫以及形成的瓣膜内持续表达[22]，但其作用尚未阐明，且Notch2是否参与插入垫的形成也未见报道。在第二生心区，Jag1/Notch信号刺激下游信号骨形态发生蛋白4，后者通过受体Alk3作用于p-Smad1/5/8调节上皮-间充质转化[23-26]。因此，此次实验观察动脉瓣膜发育过程中受体Notch2、配体Jag1以及下游靶信号Alk3、p-Smad1/5/8和Snail的表达。结果显示在流出道心内膜进行上皮-间充质转化形成心内膜垫过程中，Notch2、Jag1表达于流出道心肌、内皮以及心内膜垫的间充质细胞，Alk3、p-Smad1/5/8也表达在心内膜垫的细胞，提示Notch2参与流出道心内膜垫的形成。在流出道心内膜垫融合时，神经嵴来源细胞形成的致密细胞柱彼此接近融合形成的漩涡状结构内细胞变成平行排列，并表达α-平滑肌肌动蛋白、Notch2和Jag1，说明Notch2信号可能也参与流出道心内膜垫的融合。研究证明在上皮-间充质转化过程中，内皮细胞失去连接和极性，重组其细胞骨架[27]；流出道心内膜垫内融合时致密细胞柱所含间充质细胞胞质内肌动蛋白丝明显增加[28]。此次实验观察到的Jag1、Notch2在心内膜垫形成与融合过程中的持续表达提示Notch2信号可能参与细胞骨架的重组，增强细胞运动能力。在插入垫形成过程中，所含细胞未表达Jag1、Notch2，提示Notch2信号并不参与插入垫的形成，这进一步提示流出道心内膜垫与插入垫有不同的细胞来源与形成过程。

在动脉瓣膜原基重塑为瓣膜的过程中，所含细胞需经过增生、分化、迁移、黏附与凋亡，以确保瓣膜正常的形态发生[29-30]。此次实验结果显示在此过程中，Jag1、Notch2表达见于所有动脉瓣膜，其下游信号仅表达于流出道心内膜垫来源瓣膜内。随着重塑的完成，上述蛋白表达逐渐减弱消失，提示Notch2信号可能同时参与流出道心内膜垫与插入垫来源瓣膜原基的重塑，但两种来源的瓣膜原基内Notch2信号的下游调节因子可能并不相同。

综上，Notch2信号在流出道心内膜垫的形成、融合与瓣膜原基重塑时均发挥作用，由此推测在此期间如果Notch2信号失活，可能会使流出道心内膜垫的形成、融合发生异常，而瓣膜发生的任一过程异常均可能导致主动脉瓣二叶式畸形的发生，从而表现为主动脉瓣的瓣叶部分融合，仅有2个瓣叶，即左右冠瓣融合型二叶式主动脉瓣，但确切的机制还需进一步研究。此实验结果只从形态学角度显示了动脉瓣膜的正常形成过程及其调控因素，为主动脉瓣二叶式畸形的发生原因提供了假设，但关于Notch2信号失活之后的表型、相关调控机制以及是否会导致主动脉瓣二叶式畸形还需进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
主动脉和肺动脉：动脉是指从心脏发出最后止于组织内的血管，它将血液由心脏运送至身体各处。主动脉从左心室发出，是向全身各部输送血液的主要导管。肺动脉从右心室发出，是输送静脉血至肺的功能血管。
动脉瓣膜：瓣膜是人或某些动物的器官里面可以开闭的膜状结构。主动脉瓣连结左心室和主动脉，肺动脉瓣连结右心室和肺动脉，动脉瓣膜只朝向动脉开，它们的作用是防止血液倒流。

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先天性心脏畸形的表现常包括瓣膜发育异常，例如主动脉瓣二叶式畸形，因此研究主、肺动脉瓣膜的发育过程对探究这些先天畸形的发生具有重要意义。一般认为，主、肺动脉瓣膜来源于胚胎心脏的流出道心内膜垫。在流出道形成后，心内膜的内皮细胞经上皮-间充质转化形成间充质细胞进入心胶质；心脏神经嵴来源细胞也同时迁入，二者共同参与形成流出道心内膜垫。在流出道分隔时，两侧流出道心内膜垫的远端融合形成主动脉的左、右冠瓣和肺动脉的左、右半月瓣。而主动脉的无冠瓣、肺动脉的前半月瓣则是由插入垫（Intercalated cushions，IC）形成。

有关主动脉瓣二叶式畸形发生原因的研究显示部分病例表现为Notch1基因突变；配体Jagged1 (Jag1)、受体Notch1或Notch2基因突变可导致肺动脉瓣狭窄，说明主、肺动脉瓣膜的发育过程需要Notch信号通路的调节。该研究选用免疫组织化学染色、三维重建等方法系统观察胚龄9.5-15d小鼠胚胎心脏流出道的分隔与主、肺动脉瓣膜形成过程，揭示插入垫的细胞来源以及两对心内膜垫重塑形成动脉瓣膜的过程，为探究动脉瓣膜相关疾病的病因提供形态学基础。

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