2.1   实验动物数量分析   纳入SD大鼠24只，饲养过程中死亡6只，其中正常组1只大鼠不明原因死亡；糖尿病组2只因为血糖太高而死亡，1只因为皮肤脓肿感染死亡；tBHQ组有2只大鼠死亡，其中1只大鼠解剖后发现一侧肾脏有肿瘤生长，另外1只死亡原因不明。最终18只大鼠进入结果分析，共3组，每组6只。
2.2   各组大鼠糖尿病相关生化指标的改变   各组大鼠干预治疗12周的空腹血糖水平有所不同，总体比较差异均有显著性意义(F=78.53，P=0.000)；其中与正常对照组比较，糖尿病组及tBHQ组大鼠空腹血糖水平升高，差异均有显著性意义(均P < 0.05)。各组大鼠在干预后空腹胰岛素总体比较差异有显著性意义(F=22.48，P=0.000)，其中糖尿病组及tBHQ组高于正常对照组(P < 0.05)；tBHQ组较糖尿病组升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。



2.3   各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中PFKFB3、S1P2蛋白的表达    
2.3.1   各组大鼠视网膜中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量   各组中均可见PFKFB3、S1P2的阳性表达，PFKFB3、S1P2主要分布于视网膜神经节细胞层、内核层，见图1。



各组大鼠在干预治疗12周时视网膜中PFKFB3、S1P2蛋白相对表达量的总体比较差异均有显著性意义(FPFKFB=264.43，PPFKFB3< 0.001；FS1P2=547.87，PS1P2< 0.001)。 
糖尿病组PFKFB3(t=17.80，P < 0.001)、S1P2(t=32.00，P < 0.001)的表达均较正常对照组增加，差异有显著性意义；tBHQ组PFKFB3(t=10.20，P < 0.001)、S1P2(t=24.50，P < 0.001)的表达较糖尿病组降低，差异有显著性意义，见表3。



2.3.2   各组大鼠主动脉中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量   各组PFKFB3、S1P2主要表达在主动脉内膜内皮细胞中，主动脉平滑肌细胞未见明显阳性表达，见图2。



各组大鼠主动脉内膜内皮细胞中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量总体比较差异均有显著性意义(FPFKFB=15.148，PPFKFB3=0.002；FS1P2=7.263，PS1P2=0.002)。 
糖尿病组PFKFB3(t=3.35，P=0.01)、S1P2(t=2.87，P=0.016)的表达均较正常对照组增加，差异有显著性意义；tBHQ组PFKFB3(t=5.26，P=0.001)、S1P2(t=3.47，P=0.006)的表达较糖尿病组降低，差异有显著性意义，见表4。



2.3.3   各组大鼠心脏组织中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量   各组PFKFB3、S1P2主要表达在心脏组织的心肌细胞和心肌间血管内皮细胞中，见图3。




各组大鼠心肌细胞和心肌间血管内皮细胞中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量的总体比较差异均有显著性意义(F心肌PFKFB =9.273，P心肌PFKFB=0.004；F心肌S1P2 =6.411，P心肌S1P2=0.014；F心肌血管内皮PFKFB =6.659，P心肌血管内皮PFKFB=0.02；F心肌血管内皮S1P2 =6.214，P心肌血管内皮S1P2=0.02)。
在大鼠心肌细胞中，糖尿病组PFKFB3(t=2.64，P=0.024)、S1P2(t=3.16，P=0.009)的表达均较正常对照组增加，差异有显著性意义；tBHQ组PFKFB3(t=3.95，P=0.002)、S1P2(t=2.32，P=0.04)的表达较糖尿病组降低，差异有显著性意义。
在大鼠心肌细胞间血管内皮细胞中，糖尿病组PFKFB3(t=2.77，P=0.025)、S1P2(t=3.04，P=0.016)的表达均较正常对照组增加，差异有显著性意义；tBHQ组PFKFB3(t=3.23，P=0.015)、S1P2(t=2.62，P=0.028)的表达较糖尿病组降低，差异有显著性意义，见表5。



2.3.4   各组大鼠肾脏中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量   在肾脏组织中，各组PFKFB3主要分布在肾小管细胞中，肾小球不表达；S1P2分布在肾小球和肾小管细胞中，见图4。



各组大鼠肾小管细胞和肾小球细胞中PFKFB3、S1P2蛋白的相对表达量的总体比较差异均有显著性意义(F肾小管PFKFB=4.969，P肾小管PFKFB=0.019；F肾小管S1P2=11.403，P肾小管S1P2< 0.001；F肾小球S1P2=12.316，P肾小球S1P2=0.001)。
在大鼠肾小管细胞中，糖尿病组PFKFB3(t=2.92，P=0.009)、S1P2(t=4.97，P < 0.001)的表达均较正常对照组增加，差异均显著性意义；tBHQ组PFKFB3(t=2.36，P=0.039)、S1P2(t=2.13，P=0.043)的表达较糖尿病组降低，差异有显著性意义。
在大鼠肾小球细胞中，糖尿病组S1P2的表达均较正常对照组增加(t=4.45，P < 0.001)，差异有显著性意义；tBHQ组S1P2的表达较糖尿病组降低(t=3.81，P < 0.001)，差异有显著性意义，见表6。



2.4   各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中PFKFB3、S1P2 mRNA的表达   qRT-PCR检测结果显示，各组大鼠视网膜、心脏、肾脏、主动脉等各器官中的PFKFB3、S1P2mRNA的表达总体比较差异有显著性意义(F视网膜PFKFB3=30.973，P视网膜PFKFB3< 0.001；F视网膜S1P2=53.268，P视网膜S1P2< 0.001；F心脏PFKFB3=66.859，P心脏PFKFB3< 0.001；F心脏S1P2=58.025，P心脏S1P2< 0.001；F肾脏PFKFB3=71.709，P肾脏PFKFB3< 0.001；F肾脏S1P2=64.539，P肾脏S1P2< 0.001；F主动脉PFKFB3=39.192，P主动脉PFKFB3< 0.001，F主动脉S1P2=17.087，P主动脉S1P2< 0.001)。糖尿病组(t视网膜PFKFB3=6.36，P视网膜PFKFB3< 0.001；t心脏PFKFB3=11.58，P心脏PFKFB3<0.001；t肾脏PFKFB3=11.27，P肾脏PFKFB3< 0.001；t主动脉PFKFB3=8.71，P主动脉PFKFB3< 0.001)较正常对照组增多；tBHQ组(t视网膜PFKFB3=6.85，P视网膜PFKFB3< 0.001；t心脏PFKFB3=5.93，P心脏PFKFB3< 0.001；t肾脏PFKFB3=9.16，P肾脏PFKFB3< 0.001；t主动脉PFKFB3=5.85，P主动脉PFKFB3< 0.001)较糖尿病组减少，差异均有显著性意义；糖尿病组(t视网膜S1P2=8.49，P视网膜S1P2< 0.001；t心脏S1P2=10.2，P心脏S1P2< 0.001；t肾脏S1P2=10.8，P肾脏S1P2< 0.001；t主动脉S1P2=5.7，P主动脉S1P2< 0.001)较正常对照组增多；tBHQ组(t视网膜S1P2=8.69，P视网膜S1P2< 0.001；t心脏S1P2=8.14，P心脏S1P2< 0.001；t肾脏S1P2=8.38，P肾脏S1P2< 0.001；t主动脉S1P2=4.02，P主动脉S1P2=0.002)较糖尿病组减少，差异均有显著性意义，见表7。



2.5   各组大鼠视网膜、主动脉、心肌、肾脏中细胞的凋亡指数   TUNEL法检测结果显示，各组大鼠视网膜神经节细胞、心脏心肌细胞、肾脏肾小管细胞、主动脉全层细胞凋亡指数各器官的总体比较差异有显著性意义(F视网膜=56.294，P视网膜< 0.001；F心脏=22.441，P心脏< 0.001；F肾脏=142.81，P肾脏< 0.001；F主动脉=19.28，P主动脉< 0.001)。糖尿病组(t视网膜=7.21，P视网膜< 0.001；t心脏=6.59，P心脏< 0.001；t肾脏=4.43，P肾脏=0.001；t主动脉=16.25，P主动脉< 0.001)较正常对照组增多；tBHQ组(t视网膜=7.36，P视网膜< 0.001；t心脏=4.34，P心脏=0.001；t肾脏=5.98，P肾脏< 0.001；t主动脉=12.11，P主动脉< 0.001)较糖尿病组减少，差异均有显著性意义，见图5及表8。

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糖尿病及其慢性并发症的发病机制尚未完全明了。LA SELVA等[1]的研究表明高糖对细胞的损伤是通过直接刺激糖酵解途径实现的，而6-磷酸果糖激酶2/果糖双磷酸酶2同工酶3(6-phosphofructo-2-kinase /fructose-2，6-bisphosphatase-3，PFKFB3)是糖酵解途径的一种关键调节器；并且长期高血糖的刺激可激活1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)的生成增加，与其受体2(S1P2)结合后，在细胞增殖、炎症调节、肿瘤代谢、血管形成等过程中起重要作用[2]。既往作者所在课题组研究发现，叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)可以干预糖尿病大鼠视网膜中细胞增殖和凋亡。此次研究探讨PFKFB3、S1P2在2型糖尿病大鼠视网膜、心肌、肾脏、主动脉中的表达，了解其在2型糖尿病大鼠重要器官中的作用，为研究糖尿病及其慢性并发症的发病机制提供依据；并同时探讨tBHQ与PFKFB3、S1P2的关系，了解tBHQ对 PFKFB3、S1P2的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，数据资料经W检验呈正态分布，组间均数经Levene检验方差齐，方差不齐的组间比较采用矫正t检验；各组大鼠的检测指标总体差异比较采用单因素方差分析，3组之间两两比较采用LSD-t检验。
1.2   时间及地点   实验于2016年1月至2018年12月在西南医科大学中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   24只SPrague Dawley大鼠，均为雄性，体质量180-200 g，4周龄，由西南医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(川)2018-065。实验方案经西南医科大学附属医院动物实验伦理委员会批准，实验动物在麻醉下进行所有的操作。
1.3.2   试剂及仪器   tBHQ(美国 Acros公司)；链脲佐菌素(美国Sigma公司)；兔抗大鼠S1P2、PFKFB3多克隆抗体(Bioworld公司，美国)；血糖仪(罗氏公司，德国)；OLYMPUS BX53数字显微镜及Image-Pro Plus图像分析软件；PFKFB3、S1P2、β-actin引物序列(生工生物有限公司，上海)；反转录试剂盒、提取总RNA试剂盒、qRT-PCR试剂盒、SYBR Green工染料(宝生物工程有限公司，日本)；Leica生物显微镜 (Leiea公司，德国)；荧光定量PCR 仪CFX96(BIO-RAD公司，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物分组与模型制备  大鼠喂养7 d后按随机数字表法随机抽取7只为正常对照组，其余17只大鼠为造模组。基础饲料喂养正常对照组大鼠；高脂高糖饲料(猪油18%，蔗糖20%，蛋黄3%，基础饲料59%)喂养造模组大鼠。1个月后，造模组大鼠腹腔注射30 mg/kg剂量链脲佐菌素制作2型糖尿病模型；7 d后经尾静脉采血，造模成功的指标为：测量空腹血糖>16.7 mmol/L。等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液对正常对照组大鼠进行腹腔注射。
造模组随机分为糖尿病组9只、tBHQ组8只。造模成功后7 d，在高脂高糖饲料中添加1% tBHQ喂养tBHQ组大鼠；基础饲料继续喂养正常对照组大鼠；高脂高糖饲料继续喂养糖尿病组大鼠。饲养12周后，剔除饲养过程死亡大鼠，最终正常对照组、糖尿病组及tBHQ组各6只大鼠纳入此次实验。

1.4.2   大鼠眼球、主动脉、心脏、肾脏组织标本的制备   将3组大鼠于干预后12周空腹过夜，使用戊巴比妥钠(2%，50 mg/kg)腹腔内注射行全身麻醉，大鼠心脏血液采用穿刺法收集备用，摘取两侧眼球，主动脉、心脏、肾脏。各组取6个组织制作标本，眼球先用19G穿刺刀于角膜缘处穿刺前房后固定，将各眼球和其他组织置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h以上；常规石蜡包埋、切片(厚度分别为2 μm和5 μm)。使用剩余眼球将视网膜剥离并在PBS中漂洗，将视网膜上残余的玻璃体清理干净；同时使用剩余大鼠；最后将视网膜、主动脉、心脏、肾脏组织置入去RNA酶的1.5 mL EP管中，迅速置于液氮中并于-80 ℃保存备用。
1.4.3   大鼠生化指标的检测   心脏全血采集后测定大鼠空腹血糖(采用7180全自动生化分析仪)及大鼠空腹胰岛素含量(采用125I胰岛素放射免疫分析盒检测)。
1.4.4   免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中PFKFB3、S1P2蛋白的表达量   取各器官2 μm石蜡切片，苏木精-伊红染色后观察各组织结构情况。取各器官5 μm石蜡切片，进行常规脱蜡-漂洗-预热，放入载玻片，92-98 ℃加热5 min，在室温下进行抗原修复，分别滴加兔抗大鼠PFKFB3(1∶100)、S1P2(1∶100)一抗，进行4 ℃孵育过夜后使用PBS洗涤；加二抗(稀释比例1∶200)，室温孵育40 min后DAB显色，用数字显微镜(OLYMPUS BX53)及Image-Pro Plus图像分析软件分析PFKFB3、S1P2在大鼠各器官中的表达分布，棕黄色或棕褐色着色者为阳性反应细胞，测定单位面积的平均吸光度(A)，实验重复3次，取平均值。
1.4.5   qRT-PCR检测各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中PFKFB3、S1P2 mRNA的表达   在干预12周时，取各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏组织。将标本匀浆后，提取总RNA，要求测得RNA的A260 nm/A280 nm在1.9-2.2之间，并以RNA为模板反转录合成cDNA，其中反应体系为10 μL，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。采用CFX96 real-time PCR Detetion System进行PCR扩增，总反应体系为25 μL；扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s；共39个循环。同时进行内参β-actin的荧光定量检测。结果使用比较Ct值法分析。引物序列见表1。

1.4.6   TUNEL法检测各组大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中细胞的凋亡指数   将石蜡切片脱蜡-漂洗-浸洗后，滴加54 μL末端核酸转移酶(TdT)缓冲液，室温放置1-5 min，于湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加54 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中37 ℃孵育30 min。SABC法染色，DAB显色，蒸馏水冲洗5 min×4次，苏木精复染、脱水，透明后封固。阴性对照不加TdT酶，其余步骤相同。在光学显微镜下，细胞核或细胞质被染成棕黄色或棕褐色为凋亡细胞，以细胞凋亡指数作为评价指标，在高倍镜下(×400)每张切片随机拍摄3-5个视野，计算凋亡细胞数占细胞总数的比例。凋亡指
数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。 
1.5   主要观察指标   干预12周时，测定大鼠血糖及胰岛素水平；采用免疫组织化学法及实时荧光定量PCR法定量检测各组大鼠心脏、视网膜、肾脏、主动脉中PFKFB3、S1P2蛋白及mRNA的分布和表达；采用TUNEL法检测各组大鼠心脏、视网膜、肾脏、主动脉细胞的凋亡指数。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0软件进行统计分析。此次研究中数据资料经W检验呈正态分布，以x±s表示，组间均数经Levene检验方差齐，方差不齐的组间比较采用矫正t检验。各组大鼠的检测指标总体差异比较采用单因素方差分析，3组之间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经西南医科大学附属医院生物统计学专家审核。

机体高糖和缺氧引起糖酵解过程增强。PFKFB3是调节糖酵解的关键酶，也是近年来发现的参与细胞代谢的新型激酶之一，它对细胞的生长和增殖具有重要的调节作用[3]，在肝癌、肺癌、肾癌等实体肿瘤中明显高表达[4]，它通过调节糖酵解促进癌细胞的增殖[5]。既往有研究发现，小鼠的主动脉、平滑肌细胞和血管内皮细胞中均有PFKFB3的表达，均可以发生糖酵解，并且在脂蛋白升高的颈动脉斑块中，PFKFB3和细胞间黏附分子1的表达增加，PFKFB3的抑制消除了炎症，同时减弱了跨内皮细胞的迁移[6]。此次研究发现，在大鼠主动脉、平滑肌细胞、主动脉血管内皮细胞中PFKFB3均有表达，与SCHNITZLER等[6]的研究一致；同时此次研究还发现糖尿病组PFKFB3表达较正常组增多，说明高糖环境下糖尿病大鼠主动脉的糖酵解过程增强，PFKFB3参与了代谢，并在高糖环境下产生了一定作用。PFKFB3通过调节细胞骨架重塑、迁移和竞争在血管发芽中发挥关键作用[7]。据报道，PFKFB3可调节血管内皮细胞的增殖、迁移和血管发芽[8]。PFKFB3通过诱导内皮增殖和迁移来促进血管生成过程，一方面，位于细胞核的PFKFB3可能通过提高糖酵解通量和调节细胞周期来促进内皮增殖；另一方面，PFKFB3调节内皮细胞的分化，进而促进丝状伪足和片状伪足的形成，从而启动内皮迁移和血管萌发[9]。但是有一些研究发表了不同的意见，认为靶向抑制PFKFB3 导致体外和体内血管生成抑制，但对内皮细胞的增殖或迁移能力没有影响[10]。研究发现，病理性视网膜血管生成中内皮细胞与邻近巨噬细胞/小胶质细胞之间具有糖酵解依赖性旁分泌关系[11]。内皮细胞分泌糖酵解代谢物，特别是乳酸，触发局部巨噬细胞/小胶质细胞代谢的变化，有利于高糖酵解状态，缺氧上调 PFKFB3的表达并促进内皮细胞中乳酸的分泌。此次实验虽然没有对视网膜血管内皮细胞进行研究，但结果发现，PFKFB3主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层，同时糖尿病组较正常组的表达增多，说明高糖环境下糖尿病大鼠视网膜的糖酵解过程增强，PFKFB3参与了视网膜的代谢。同时此次研究发现，心肌细胞和心肌间血管内皮细胞中有PFKFB3的表达，2型糖尿病大鼠中PFKFB3的表达增加，与LI等[12]的研究不一致。LI等[12]的研究发现，暴露于高糖环境下的心肌细胞的糖酵解显著降低，PFKFB3表达逐渐减少，存在差异的原因还有待进一步研究。通过研究还发现PFKFB3在肾脏肾小管细胞中表达，肾小球不表达，并且糖尿病组大鼠PFKFB3的表达升高，提示在高糖环境下肾小管细胞的糖酵解增强，参与糖尿病肾病的代谢，既往的研究没有发现类似报道。

S1P是一种磷酸化鞘氨醇代谢物，已被证明在各种病理生理过程中发挥重要作用，包括免疫反应、血管生成、细胞分化、细胞凋亡、炎症和癌症[13-15]。组织和血浆 S1P 水平的升高已被认为是人类和啮齿动物肥胖的一个关键特征[16]，这表明S1P代谢可能参与了2型糖尿病的发病。目前发现人类细胞的细胞膜上存在5种与S1P特异性结合的G蛋白偶联受体，分别为S1P1-S1P5，可激活不同的细胞内信号途径而产生广泛的生物学效应，包括细胞增殖、血管生成等[17-18]。内皮细胞表面主要存在S1P1-S1P3受体的表达，S1P作用于S1P2受体，激活细胞内PTEN信号蛋白，促进血管通透性增加[19]。既往有研究发现，S1P2受体在视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞中的表达水平最高[20]。S1P刺激ARPE-19细胞中白细胞介素8的表达[21]，并诱导视网膜色素上皮细胞的增殖和纤维化[22]；即S1P2受体在小鼠缺血驱动的视网膜病变期间被诱导，在病理性新生血管形成的生长期达到峰值。此次研究发现S1P2主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层，同时糖尿病组较正常组的表达增多，说明高糖环境下糖尿病大鼠视网膜的S1P代谢活跃。而此次研究没有观察S1P2在视网膜色素上皮细胞的表达情况，S1P2可能参与了糖尿病状态下视网膜神经上皮层血管的生成。

人们普遍认为，在5种S1P受体亚型中，S1P1、S1P2 和 S1P3 在心血管系统中表达最多[23-24]。S1P2 和 S1P3 受体都可以介导 S1P 对血管平滑肌细胞的影响，它们参与了细胞骨架重塑、黏附和连接变化、细胞迁移、增殖、存活和血管生成；S1P2 参与心血管系统的发育和维持[25]。此次研究发现，S1P2主要表达于心脏组织的心肌细胞和心肌间血管内皮细胞及主动脉内膜内皮细胞中；并且糖尿病组的表达较正常组增多，说明糖尿病组的心脏、主动脉和内皮细胞中S1P代谢活跃，与糖尿病心血管疾病的发生有一定的关系。S1P2是糖尿病模型肾脏组织中最丰富的S1P受体，且SphK1/S1P2途径在早期糖尿病肾病中被激活[26]。此外，过去的研究证实，在糖尿病条件下，肾脏组织中观察到SphK1和S1P的水平升高，SphK1活性和S1P水平的增加可以刺激肾小球膜细胞增殖，然后激活核因子κB[27]。S1P2作为S1P受体之一，主要在肾小球系膜细胞中表达，并在糖尿病肾病中起重要作用[28]。此次研究发现S1P2表达于肾脏组织的肾小球细胞和肾小管细胞中，在糖尿病大鼠肾脏中，S1P2的表达升高，进一步说明S1P2在糖尿病肾病的发生中起一定作用。

S1P形成的增加会刺激S1PR3连锁的信号通路，从而增加血管内皮生长因子A的表达水平和小鼠角膜的血管生成[29]。S1PR2可以促进新生血管的形成，为血管生成的正调节因子[30-31]。S1P2 受体在小鼠视网膜的病理性新生血管形成的生长期达到峰值，其中血管内皮生长因子也发挥重要作用[32]。S1P 上调视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子的表达和分泌，在S1P上调后，低氧诱导因子1和血管内皮生长因子的表达水平增加，这两者都被认为与新生血管性老年性黄斑病变的发展密切相关。有研究数据还清楚地证明了S1P在视网膜色素上皮细胞中诱导的促血管生成反应，因为 S1P 可以通过上调视网膜色素上皮细胞中的血管内皮生长因子以及低氧诱导因子1水平来诱导渗出性新生血管性老年性黄斑病变相关的血管生成[20]。已有充分的证据表明，PFKFB3基因表达水平因生长因子(血管内皮生长因子、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素)的表达而上调[33-34]。在血管生成过程中，血管内皮生长因子诱导PFKFB3通过调节丝状伪足和片状伪足的管形成和定向迁移来促进血管生成和内皮迁移[35-36]。通过以上研究以及结合此次实验可以初步认为，S1P代谢可以诱导血管内皮生长因子的表达增加，导致PFKFB3表达增加，从而引起一系列反应。

有研究显示，抑制糖酵解过程可能会减弱病理性眼部血管生成，并且可能比目前的常规治疗留下更少的全身副反应[37]。敲除PFKFB3会削弱巨噬细胞/小胶质细胞获得血管生成的能力，使它们无法在氧诱导的增殖性视网膜病变小鼠模型中促进内皮细胞增殖、发芽以及病理性新生血管形成。当内皮PFKFB3被基因删除或用PFKFB3抑制剂治疗小鼠时，抑制了视网膜中的新生血管生长[38]。PFKFB3的抑制剂3PO只能部分和暂时降低体内糖酵解水平，但它可以减少视网膜和炎症模型中病理性新血管形成的数量[39-40]。S1P2 拮抗剂可抑制血管内皮细胞中S1P诱导的JNK磷酸化，还能减轻内皮功能障碍并防止动脉粥样硬化[41]。在正常血糖和高血糖情况下，S1P2受体拮抗剂JTE-013在鼠肾系膜细胞中显著降低了细胞增殖和外源性S1P诱导的纤维链接蛋白增加[42]。据报道，玻璃体内注射与 S1P 特异性结合的人源化单克隆抗体可减少脉络膜新生血管的面积和脉络膜新生血管的荧光素泄漏。S1P2可促进异常的视网膜血管生成和血管通透性，S1P2 抑制剂可能是病理性新血管形成的治疗靶点[20]。通过以上研究发现，通过抑制PFKFB3及S1P2可以减少血管生成及控制炎症反应。tBHQ为较强的抗氧化剂，可减少视网膜的氧化应激损伤。作者所在课题组既往研究发现，tBHQ对糖尿病大鼠胰岛功能具有一定的保护作用[43]；可促进糖尿病大鼠视网膜组织中核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1、B淋巴细胞瘤2的表达，降低血管内皮生长因子的表达，对视网膜组织具有抗氧化应激损伤、减少细胞的凋亡、抑制视网膜血管增殖等作用。而也有研究发现，tBHQ对糖尿病大鼠肾脏有一定的保护作用，可促进糖尿病大鼠肾脏组织中核因子E2相关因子2、血红素加氧酶1的表达，对肾脏有抗氧化应激损伤的作用[44]。此次课题大鼠使用tBHQ干预剂后，PFKFB3、S1P2的表达有所降低，说明使用tBHQ干预剂可能降低PFKFB3、S1P2的表达，对糖尿病大鼠各器官有一定的保护作用，但其作用机制有待进一步研究。

同时，此次研究通过检测大鼠视网膜、主动脉、心脏、肾脏中的凋亡细胞发现，糖尿病组各器官中凋亡指数较正常对照组增多，说明2型糖尿病大鼠各器官细胞凋亡增加，同时PFKFB、S1P2的表达增加，其与细胞的凋亡可能相关。既往有研究发现，PFKFB3抑制剂3PO 显著减弱了血小板衍生因子诱导的Ⅰ型胶原蛋白水平增加以及细胞凋亡[45]。而在激活的B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤中，S1P2通过Gα13依赖性途径促进细胞凋亡[46]。此次研究使用tBHQ干预剂后，各器官凋亡指数降低，说明tBHQ干预剂可以抑制大鼠各器官细胞的凋亡；同时使用tBHQ干预后PFKFB3、S1P2的表达降低，进一步说明糖尿病大鼠各器官细胞的凋亡可能与PFKFB3、S1P2的表达相关。

通过此次实验研究发现，2型糖尿病大鼠视网膜、心肌、肾脏、主动脉中PFKFB3和S1P2的表达增加，提示糖尿病大鼠各器官的病变可能通过S1P2/PFKFB3途径起作用，且S1P2和PFKFB3与糖尿病大鼠各器官细胞的凋亡可能具有一定关系。使用tBHQ干预剂后PFKFB3、S1P2的表达降低，说明tBHQ对糖尿病大鼠各器官有一定的保护作用，但其作用机制有待进一步研究，为将来研究糖尿病及其慢性并发症的发病机制提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
PFKFB3：即6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3，是糖酵解途径的一种关键调节器，其表达增高促进糖酵解通量增加，可调节血管内皮细胞的增殖、迁移和血管发芽，并可通过诱导内皮增殖和迁移来促进血管生成过程。
S1P2：即1-磷酸鞘氨醇受体2，在血管内皮细胞中高表达，当受到低氧、炎症刺激因子和生长因子等因素刺激时其表达上调并在细胞增殖、炎症调节、肿瘤代谢、血管形成等过程中起着重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

S1P是一种磷酸化鞘氨醇代谢物，已被证明在各种病理生理过程中发挥重要作用，包括免疫反应、血管生成、细胞分化、细胞凋亡、炎症和癌症。组织和血浆 S1P 水平的升高已被认为是人类和啮齿动物肥胖的一个关键特征，这表明S1P代谢可能参与了2型糖尿病的发病。目前发现人类细胞的细胞膜上存在5种与S1P特异性结合的G蛋白偶联受体，分别为S1P1-S1P5，可激活不同的细胞内信号途径而产生广泛的生物学效应，包括细胞增殖，血管生成等。内皮细胞表面主要存在S1P1-S1P3受体的表达，S1P作用于S1P2受体，激活细胞内PTEN信号蛋白，促进血管通透性增加。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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