各组镜下观察到了少量死细胞发出的红色荧光，满视野为活细胞发出的绿色荧光，细胞存活率均在90%以上，说明了MC3T3-E1细胞在聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液中存活良好，细胞活性良好；对照组、实验组细胞发出的荧光同阳性对照组相似，且随着细胞生长时间的延长，可观察到共聚焦皿的底部铺满了发绿色荧光的活细胞，说明MC3T3-E1细胞可在材料浸提液中增殖生长，聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料无明显毒性。
2.3   各组MC3T3-E1细胞的增殖    随着培养时间的延长，各组细胞增殖吸光度值呈升高的趋势，说明细胞在不断地增殖生长，见图4。

培养第1天时，3组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第3，5，7天时，实验组细胞增殖吸光度值高于阳性对照组、对照组(P < 0.05)，阳性对照组与对照组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

两种材料不同培养时间点的细胞毒性分级，见表1，培养第3，5，7天，两种材料的细胞毒性均为0级，细胞毒性合格，认为材料对细胞增殖基本无影响。



2.4   两种材料表面MC3T3-E1细胞的黏附生长   见图6。

培养第1天时，低倍电镜下可观察到MC3T3-E1在两种材料表面黏附生长，细胞铺展良好，聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料表面细胞分泌出的基质多于聚醚醚酮材料；高倍电镜下可观察到细胞伸出伪足和表面分泌的钙化颗粒，细胞生长良好。培养第3天时，低倍电镜下观察到两组材料表面黏附的细胞增多，同时分泌出较多的基质，高倍电镜下同样观测到细胞伪足和钙化颗粒，细胞在材料表面生长增殖良好，其中聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料上的细胞生长黏附、基质分泌更多。培养第7天时，低倍电镜下观察到了细胞已经在两种材料表面出现细胞重叠生长的现象，其中聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料上的细胞铺展生长、分泌基质效率更高。
2.5   材料的生物相容性   由以上结果可知，聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料具有良好的生物相容性。

聚醚醚酮是一种聚芳醚酮类耐高温热塑性聚合物，也是一种理想的3D打印材料，具有稳定的化学性质、优秀的生物相容性、抗疲劳特性、辐射透明性及与椎体骨相似的弹性模量、不产生应力屏蔽效应、在高温或灭菌过程中具有极好的化学稳定性等优良性质，在医疗行业中有着巨大的应用潜力。同时聚醚醚酮材料也具有生物惰性和亲水性差的性质，阻碍了聚醚醚酮材料植入物与周围骨组织的骨融合长入，导致临床中的聚醚醚酮材料融合器出现融合器移位、塌陷、下沉等情况，造成椎间融合手术失败甚至出现严重手术并发症的风险[1-6]，因此如何提高聚醚醚酮材料的生物活性是脊柱外科的研究热点。

羟基磷灰石的化学组成为Ca10(PO4)6(OH)2，是一种与人类骨骼最接近的人工合成等价物，具有良好的生物相容性、成骨性和生物活性和可降解性，为临床上一种重要的骨植入材料和骨替代材料，但存在着脆性差、强度差的问题[7-10]。羟基磷灰石有着良好的生物活性，通常被涂覆在金属上或掺入聚合物中制备复合材料，以提高复合材料的生物相容性和生物活性[11-13]。

通过在聚醚醚酮材料中引入羟基磷灰石制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料，可提高聚醚醚酮材料的生物活性[14-15]。羟基磷灰石含量增多将使复合材料具有更高的生物活性，但是随着羟基磷灰石含量的增加，材料的力学性能可能会降低，脆性会加大。以往对于聚醚醚酮材料改性的研究多以表面涂层、掺入生物活性材料等方式提高其生物活性，如使用羟基磷灰石、生物玻璃等，近年来也有新型涂层改性聚醚醚酮材料的报道，如纳米钽涂层(Ta)、氮化硅(Si3N4)、二氧化钛(TiO2)等，但采用3D打印技术改性修饰聚醚醚酮材料的报道相对较少[16-19]。因此，此次实验以聚醚醚酮/羟基磷灰石(羟基磷灰石质量分数为10%)丝材为原料，采用熔融沉积型3D打印技术制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料，从多角度评价材料的细胞毒性和生物相容性，评定该材料是否具备成为3D打印个性化新型颈椎融合器材料的潜力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料和细胞相容性实验，实验数据采用正态性分析和方差齐性检验，两组间比较采用两独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年6-12月在中国人民解放军新疆军区总医院药剂科实验中心完成。
1.3   材料   聚醚醚酮丝材、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料丝材购自陕西聚高增材智造科技发展有限公司。
1.3.1   主要试剂与细胞   α-MEM培养基、原代小鼠前成骨细细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；青霉素、链霉素、T25细胞培养瓶、24孔板和96孔细胞培养板(无锡耐思生物科技有限公司)；Calcein-AM/PI Double Stain Kit(上海翌圣生物科技有限公司)；CCK-8试剂(北京博奥森生物科技有限公司)；胎牛血清、二甲基亚砜、胰蛋白酶、PBS(美国Gibco公司)。
1.3.2   主要仪器设备   Engineer Q300熔融沉积型3D打印机(陕西聚高增材智造科技发展有限公司)；JSM-7610FPlus热场发射扫描电子显微镜(北京捷欧路科贸有限公司)；荧光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)；高级超净台(三门峡博科医疗器械有限公司)；高速离心机、酶标仪(德国Sigma公司)；二氧化碳恒温细胞培养箱、冰箱 (美国Thermo公司)等。
1.4   实验方法   
1.4.1   材料的制备   利用计算机辅助设计软件设计10 mm×10 mm×1 mm的小方块试样。分别以聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石(羟基磷灰石质量分数为10%)丝材为原料，采用熔融沉积型3D打印机制备聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料试样的制备，打印参数：喷嘴直径0.4 mm，打印温度420 ℃，打印速度40 mm/s，填充率100%，扫描间距0.4 mm。打印完成后的试样经环氧乙烷消毒，备用。扫描电镜下观察材料的微观形貌。
1.4.2   细胞培养与准备   取原代小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)，使用含有体积分数10%胎牛血清+1%青/链霉素的α-MEM培养基(完全培养基)，在37 ℃、体积分数5%CO2的恒温细胞培养箱中培养，每2 d给予细胞换液。经细胞复苏、细胞换液、细胞传代、细胞冻存等步骤将MC3T3-E1细胞培养至第3代，用于实验。
1.4.3   材料浸提液的制备   取预先准备好的聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料，每块材料用1 mL含有体积分数10%胎牛血清+1%青/链霉素的α-MEM培养基(完全培养基)置换洗涤3次。按照材料试样表面积/浸提介质=3 cm2/1 mL将两种材料分别加入完全培养基中，于37 ℃恒温箱中静置浸提72 h，得到聚醚醚酮材料浸提液、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液，4 ℃冰箱保存备用。
1.4.4   材料浸提液中细胞的增殖与存活   

Live/Dead荧光染色：取第3代MC3T3-E1细胞，接种于共聚焦皿中，接种密度为5×104 /皿，分3组处理，阳性对照组加入完全培养基，对照组加入聚醚醚酮材料浸提液，实验组加入聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养第1，3，7天，向共聚焦皿中加入PBS约500 μL(含0.5 μL钙黄绿素-AM、1 μL碘化丙啶，避光放置30 min。共聚焦荧光显微镜下观察(期间注意避光)，活细胞为荧光绿色，死细胞为荧光红色。

CCK-8实验：取第3代MC3T3-E1细胞，接种于24孔板中，细胞密度为5×104/孔，分3组处理，阳性对照组加入完全培养基，对照组加入聚醚醚酮材料浸提液，实验组加入聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液，空白对照组加入完全培养基(无细胞)，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养第1，3，5，7天，每孔加入含有10%CCK-8的完全培养基，避光放置2 h后，使用酶标仪选择450 nm波长检测各组吸光度值。

按照公式计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率(RGR)=(实验组平均吸光度值-空白对照组平均吸光度值)/(阳性对照组平均吸光度值-空白对照组平均吸光度值)×100%，再进行细胞毒性评价。细胞相对增殖率100%，细胞毒性0级；细胞相对增殖率75%-99%，细胞毒性1级；细胞相对增殖率50%-74%，细胞毒性2级；细胞相对增殖率25%-49%，细胞毒性3级；细胞相对增殖率1%-24%，细胞毒性4级；细胞相对增殖率0%，细胞毒性5级。0级表示细胞增殖优良，毒性合格；1级表示细胞增殖良好，细胞毒性合格；2级表示细胞增殖尚可，细胞毒性待定；3-5级，表示材料对细胞增殖产生较大影响，细胞毒性不合格。
1.4.5   材料表面细胞的黏附和铺展   取出预先处理好的两种材料试样分别置入24孔板中，将MC3T3-E1细胞接种到两种材料表面，细胞密度为5×104/孔，加入完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，隔天换液。培养至第1，3，7天后，取出材料，PBS洗涤，加入40 g/L多聚甲醛中固定细胞。除去多聚甲醛，经梯度乙醇脱水：体积分数10%-30%-50%-70%-70%-85%-85%-95%-100%-100%的乙醇，每孔1 mL，每次10 min。冷冻干燥24 h后，在材料表面镀金，扫描电镜下观察材料及其附着的细胞。
1.5   主要观察指标   两种材料对MC3T3-E1细胞存活、增殖与黏附的影响。
1.6   统计学分析   采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，首先对实验数据进行正态检验和方差齐性检验，符合条件采用参数检验中的两独立样本t检验分析数据，不符合则采用非参数检验，结果用x±s形式表示，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经中国人民解放军新疆军区总医院生物统计学专家审核。

聚醚醚酮作为一种很有前途的热塑性材料，具有良好的加工性、稳定的化学性质和良好的生物相容性，其弹性模量接近人类皮质骨，已经被用于运动医学、脊柱外科等[20-23]。目前，聚醚醚酮材料是脊柱外科中常用的椎间融合器材料，使用聚醚醚酮融合器常需要辅以自体骨移植以增加融合器的稳定性和成骨效能，自体骨移植有同切口下取骨和不同切口下取骨两种方式，取骨量有限，同时给患者带来更多的手术创伤[24-27]。此外，聚醚醚酮材料亲水性和生物活性较差，影响了新生成骨细胞在材料表面的附着生长，从而使聚醚醚酮材料植入物的骨整合能力较差，导致临床上聚醚醚酮融合器不能很好地与椎体融合，如出现植入物下沉、移位、塌陷甚至融合手术失败等情况。羟基磷灰石具有较好的亲水性和生物活性，可以聚合物的方式与生物活性差的材料相结合，制造出具有优良生物活性和机械性能的复合材料[28-31]。目前，一些研究已经采用羟基磷灰石涂层或以羟基磷灰石复合材料的方式将疏水性材料转化为亲水性材料[32-36]。此次实验通过熔融沉积型3D打印技术的方式制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料，使复合材料具有3D打印技术和羟基磷灰石双重优势，从而使该材料在具有羟基磷灰石材料的亲水性和生物活性而适合细胞附着生长和增殖的同时，也具有3D打印技术可定制个性化植入物的优势。

材料的细胞毒性和黏附性是材料与细胞融合生长的必备条件，也是生物相容性最重要的指标，材料必须具备以上条件，细胞才能在材料表面附着生长、增殖、分化。为了研究复合材料的生物相容性，此次实验通过Live/Dead荧光染色、CCK-8实验、扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在材料表面的黏附生长情况，从多角度对聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料与聚醚醚酮材料的细胞毒性和生物相容性进行了评价。通过Live/Dead荧光染色实验观察到了MC3T3-E1细胞在聚醚醚酮材料和聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液中存活生长良好，视野中绝大部分为活细胞发出的绿色荧光，仅少量为死细胞发出的红色荧光，细胞存活率在90%以上，说明了聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料无明显细胞毒性。CCK-8实验检测到随着细胞培养时间延长，聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料浸提液中细胞的吸光度值呈升高趋势，培养第3，5，7天时，两种材料的毒性分级为0级，且聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料组吸光度值均高于阳性对照组和聚醚醚酮组(P < 0.05)，说明了两种材料浸提液中的细胞在不断地增殖生长，聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料和聚醚醚酮材料的细胞毒性合格，细胞在聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料中的增殖生长优于聚醚醚酮材料和阳性对照组。扫描电镜观察到了细胞在聚醚醚酮材料、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料表面黏附、生长情况良好，细胞分泌了较多基质，高倍镜下还观察到细胞周围分泌的钙化颗粒，聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料上附着的细胞数量、细胞分泌的基质和钙化颗粒均较聚醚醚酮材料多，说明了两种材料无细胞毒性，细胞可在材料表面附着生长，材料具有良好的生物相容性。聚醚醚酮材料因其分子结构中的芳香苯环和聚酯官能团而具有疏水性，不利于细胞附着，阻碍了细胞在其表面生长。而羟基磷灰石由于其分子结构中的羟基而具有亲水性，通过与聚醚醚酮材料混合可使复合材料具有亲水性质，从而利于细胞在材料表面附着生长。扫描电镜观察到聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料上的钙化颗粒较聚醚醚酮材料更多，可能是由于羟基磷灰石的促成骨细胞矿化作用，但具体原因有待进一步验证。此外，羟基磷灰石也有促进成骨细胞聚集、增殖、分化的作用和优秀的亲水性[37-38]，因此，理论上聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料材料较聚醚醚酮材料具有更好的亲水性，更利于细胞的附着生长，此次实验结果与之相符。通过观察材料的大体观和微观图像发现，3D打印出的聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料表面较纯聚醚醚酮材料粗糙，材料表面的粗糙程度也会影响到成骨细胞的附着生长，实验结果的差异是否为材料表面的粗糙程度造成的影响尚需进一步研究。

综上，此次实验采用熔融沉积型3D打印技术制备的聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料，经初步体外实验证实细胞毒性合格，具有良好的生物相容性，并且聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料优于聚醚醚酮材料。结合3D打印技术的优势，聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料具有成为3D打印定制个性化新型融合器材料的潜力。实验还存在一定的局限性，例如实验材料没有进行长期的实验，复合材料结合强度和长期稳定性也有待验证。此外，还需要通过进一步的生物力学实验和构建动物模型，以验证聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料的临床应用价值。
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文题释义：
熔融沉积型3D打印技术：是一种使用高温将打印材料熔化为半熔融状态，通过打印机喷头挤出后凝固，打印三维实物的先进制造技术，具有快速、准确、可定制化打印出任意形状实物的优势。实验将聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石复合材料通过熔融沉积型3D打印技术制成10 mm×10 mm×1 mm小方块试样，用于实验。
聚醚醚酮：是一种全芳香族类热塑性特种工程塑料，具有优秀的物理、化学、力学性能，良好的抗疲劳性，辐射透明性，在医疗上主要用于植入物材料；相较于金属材料，聚醚醚酮具有辐射透明性和与椎体骨相似的弹性模量，植入人体后可有效降低“应力屏蔽效应”，被越来越多地用于骨科植入物材料。

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此次实验以聚醚醚酮、聚醚醚酮/羟基磷灰石(羟基磷灰石质量分数为10%)丝材为原料，采用熔融沉积型3D打印技术制备聚醚醚酮和聚醚醚酮/羟基磷灰石材料。通过Live/Dead荧光染色实验和CCK-8细胞计数试剂检测评定材料的细胞毒性，通过扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在复合材料上的黏附生长、增殖、分泌基质的情况，多角度评价聚醚醚酮/羟基磷灰石材料的生物相容性。实验结果表明，熔融沉积型3D打印技术制备聚醚醚酮/羟基磷灰石复合物具有良好的生物相容性，细胞毒性合格，有望成为3D打印新型椎间融合器的材料。

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